用于检测结核分枝杆菌pncA基因突变的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于检测导致结核分枝杆菌化嗦酷胺耐药基因pncA基因突变热 点区7个突变的试剂盒，属于结核病耐药基因突变检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 结核病是结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病。自柯赫化och)发现结核杆菌W 来，结核病一直威胁人类健康，而且治疗结核病的疫苗、药物和诊断技术一直是人类不断寻 求解决的目标。近年来，近年，抗生素滥用、环境污染和艾滋病等原因导致，结核病有卷± 重来，发病率和死亡率明显回升趋势，已经成为与追疾和AIDS并成为传染病的Ξ大杀手之 一。更为严峻的是，结核杆菌对现有的药物变得更耐药。仍然是发展中国家较为严重的传 染病之一。根据世界卫生组织（World化alth化ganization，WHO)统计表明，在2011年， 全球有870万活动性结核病新发病例（其中13%设及同时感染人类免疫缺陷病毒）和140 万例死亡，包括HIV感染患者中的43万例死亡，有31万耐多药结核病首发病例，由至少对 异烟阱及利福平耐药的微生物所致。运些患者60%W上在中国、印度、俄罗斯联邦、己基斯 坦W及南非。共有84个国家报告了广泛耐药结核病病例，撒哈拉W南非洲有最高的人均活 动性结核病发生率，主要由于HIV的流行所致。病例绝对数最多者来自亚洲，印度和中国在 全球具有最重的疾病负担。目前，我国是当前全球结核病高发国家之一，结核病耐药情况相 当严重，非结核分枝杆菌病也呈现逐年增加的趋势。我国现有活动性肺结核病患者451万， 菌检阳性肺结核患者病人196万，每年死亡人数约13万结核杆菌总耐药率为27. 8%，初始耐 药率为18. 6%，获得性耐药率为46. 5%，耐多药率为10. 7%，其中异烟阱、利福平和链霉素耐 药情况较为严重。
[0003]化嗦酷胺常常会与利福平和异烟阱等一线药物联合使用治疗结核病，可W使患者 的治疗周期9-12月缩短至6个月，可W高效杀死体内耐酸环境中（pH> 5. 5)的菌体，而 其它的药物难W杀死运类菌。在pncA基因编码的化嗦酷胺酶作用下，细胞内的化嗦酷胺转 变为化嗦酸（pyrazinoicacid,P0A)，通过被动扩散和外排作用到达细胞膜表面，质子化 的化嗦酸促使细胞质酸化形成电势差，影响细胞的跨膜运输pncA基因突变引起化嗦酷胺 耐药，该基因长度为561bp，编码化嗦酷胺酶，耐化嗦酷胺菌株中该基因发生突变的频率为 68%-95%〇
[0004] 结核分枝杆菌抵制药物活性的机制，大致通过低细胞膜的通透性和外排累机制， 产生降解或灭活酶类，药物祀位的改变。或者结核杆菌无法通过质粒的介导从其他细菌获 得耐药性，因此染色体介导的耐药性是MTB产生耐药的主要基础。目前对MTB耐药分子机 制的研究主要集中在药物的作用祀位及其相关基因的突变上。因此，新的耐药基因位点的 发现对于快速、高通量、简便检测提供了有效的手段和策略。
[0005] 经文献检索，未见与本发明检测突变位点相同的公开报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌pncA基因突变的方法。
[0007] 本发明提供了用于检测结核耐化嗦酷胺药物pncA基因7个突变位点 (-12TX：、-llA〉G、-7T〉C、c. 3G〉A、c. 233G〉A、c. 408InsA、c. 538-561del和 +l-+18del)的试 剂盒。
[0008] 本发明通过检测来自耐化嗦酷胺结核菌株的样本中是否存在pncA基因的7个突 变，从而判断该患者耐化嗦酷胺药物的耐药分子机制，其中-12T〉C，-11A〉G，-7T乂，C. 3G〉A， c. 233G〉A，c. 408InsA，c. 538-561del和+l-+18del突变为pncA基因的突变，运些突变分别 导致口11〇4基因编码区上游第屯位、第^^一位和第十二位碱基（-12T〉C，-11A〉G，-7TX：)，编 码区第3位和第233位碱基（C.3G〉A，C.233G〉A)发生改变，C.408InsA和C.538-561del和 +l-+18del导致移码突变。运些突变影响了pncA基因表达，改变了该基因的氨基酸组成，或 延长或缩短该基因编码蛋白，从而发挥其抗化嗦酷胺的作用，进而使该菌株产生耐药。
[0009] 发明人用候选基因筛查的方法，在中国16株耐化嗦酷胺结核菌株中进行检测， 在六株耐药结核菌种发现与耐化嗦酷胺相关的pncA基因新突变7个，其中5个为新突变 (-12TX：、-llA〉G、-7T〉C、c. 408InsA、c. 538-561del和+l-+18del)，该突变的频率为43.7〇/〇， 运说明在耐化嗦酷胺的结核菌株中，pncA基因突变具有较高的发生频率，因此pncA基因突 变可W作为临床化嗦酷胺耐药菌株耐药分子机制的诊断依据。并且目前，在国际和国内均 未见其中5个突变的报道。
[0010]本发明用于检测pncA基因 7 个突变（-12T〉C，-11A〉G，-7T〉C，C. 3G〉A，C. 233G〉A， c. 408InsA，c. 538-561del和+l-+18del)的试剂盒，包括用于检测pncA基因的7个突变所 需的试剂和能选用的用于扩增pncA基因的试剂和PCR引物。
[0011]用于检测pncA基因 7 个突变（-12T〉C，-11A〉G，-7T〉C，C. 3G〉A，C. 233G〉A， c. 408InsA，c. 538-561del和+l-+18del)的试剂盒，包括W下一种或几种试剂的组合： (1) 从待检样品中提取DNA的试剂； (2) 用于扩增结核菌样本DNA的pncA基因7个突变的PCR引物和相关的PCR反应试 剂； (3)PCR产物纯化试剂； (4) 对PCR产物进行直接测序的试剂。
[0012]用于检测pncA基因 7 个突变（-12T〉C，-11A〉G，-7T〉C，C. 3G〉A，C. 233G〉A， c. 408InsA，c. 538-561del和 +l-+18del)的试剂盒，所用的PCR引物为： pncA-F:5' -TGTCGCTCACTACATCACC-3'pncA-R:5, -TCGTAGGTCATAGCGTAGG-3' 用于检测pncA基因 7 个突变（-12T〉C，-11A〉G，-7T〉C，c. 3G〉A，c. 233G〉A，c. 408InsA，c. 538-561del和+l-+18del)的试剂盒，所述检测PCR扩增产物的试剂选自测序检测试剂、 限制性内切酶长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂及SNP 分型检测试剂。
[001引采用PCR扩增-直接测序的方法来检测样本的突变情况，具体操作步骤如下： (1) 采集待测个体的样本，为培养的结核菌样本，提取全基因组DNA; (2) W提取的DNA为模板，队本发明设计的针对pncA基因编码区及上下游区域的引物 进行DNA序列的扩增，得到相应的PCR扩增产物； (3)将得到的PCR产物纯化后，进行直接测序分析，将所测得的序列与pncA基因及其上 下游的正常序列进行比对，确定7个突变是否存在； (4)根据W上实验结果分析患者是否为pncA基因突变导致的耐化嗦酷胺结核分枝杆 困困株； (5) 按照正常编码序列阅读框对突变序列进行翻译，进一步确定错义突变和移码突变 的存在。
[0014] 发明人在收集耐药结核分枝杆菌进行实验的过程中，收集到16株耐化嗦酷胺的 结核菌株，在取得患者同意的前提下，对患者感染的结核分枝杆菌进行基因检测。同时，我 们还收集了患者的基本信息和临床信息，详细询问了其感染和发病过程，建立了结核分枝 杆菌耐药株的样本库。将灭活的结核分枝杆菌冻存于-80 °C冰箱。用柱吸附的方法提取结 核菌的基因组DNA，保存于-40°C冰箱，每份DNA样本具有对应的患者资料和耐药信息。用引 物设计软件Prime巧和01 igo6设计PCR扩增引物，包括了结核菌pncA基因编码区上游161 位碱基到编码区下游321位碱基的DNA片段，用于PCR扩增。PCR扩增产物直接用PCR引物 进行正反向测序(测序所用仪器为ABI公司3730型DNA测序仪)。将得到的序列与GenBank 中的序列进行比对，确定pncA基因突变的存在。
[001引pncA基因突变的核巧酸或氨基酸序列如下：
pncA基因突变的核巧酸和氨基酸序列中，用方框标出的是突变的碱基或氨基酸，用开 放框标出的是移码突变后的氨基酸，用横线标出的是起始密码子；位于pncA基因编码序列 前的第7 (T乂)，11 (A〉G)和12 (T〉C)位碱基的突变，使pncA基因上游的调控序列发生变 化，导致pncA蛋白的转录和翻译发生改变