一种沙门氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法
【专利说明】-种沙口氏菌的核酸恒溫扩増检测试剂盒及检测方法 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种针对沙口氏菌核酸的恒溫扩增快速检测技术，适合对沙口氏菌的 定性检测。 (二）【背景技术】
[0002] 沙口氏菌广泛存在于自然界，至今已经发现的血清型就有2500种W上，我国已发 现216个。与人类疾病有关的血清型主要集中于A~E群，包括：伤寒沙口氏菌、甲、乙、丙型 副伤寒沙口氏菌、鼠伤寒沙口氏菌、猪霍乱沙口氏菌、肠炎沙口氏菌、鸭沙口氏菌、新港沙口 氏菌等，其中W鼠伤寒沙口氏菌、肠炎沙口氏菌及猪霍乱沙口氏菌最为常见。沙口氏菌引起 的食物中毒在日本、欧美占首位，亦是我国细菌性食物中毒的常见菌。在我国内陆地区，有 70%~80%细菌性食物中毒是由沙口氏菌引起的，是对人类和动物健康有极大危害的一类 食源性病原菌。
[0003] 沙口氏菌的传统检测多采用细菌培养、生化和血清学鉴定等方法，此类方法操作 繁琐、费时费力、所需试剂繁多，经济成本高。随着免疫学和分子生物学的发展，现在已建立 了W抗原为主的免疫学检测方法如化ISA法，W及WPCR为基础的检测技术。ELISA操作 较为繁琐，费时较长；PCR检测方法快捷，灵敏，准确度较高，但是需要一定的设备和技术要 求，且试剂费用较贵，难W推广普及。为了实现基层能广泛进行肠炎沙口氏菌的快速检测， 有效防控该类细菌引起的食物中毒，建立实用、简便、快速、准确的肠炎沙口氏菌检测方法 十分必要。
[0004] 近年来，LAMP方法受到关注，该方法W特定核酸为目标在等溫条件下通过有链置 换酶活性的DNA聚合酶作用而扩增，具有特异性高、灵敏性强，而且简便快速成本低廉的特 点。已在微生物检测等诸多领域广泛应用。本发明技术研制了恒溫扩增沙口氏菌核酸，并 结合核酸试纸条显色来判定结果的检测方法，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条 流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。研究表明该沙口氏菌恒溫扩 增-核酸试纸条检测方法具有特异性强、敏感度高、对仪器要求简单、检测时间短等优点， 所W非常适用在基层检验机构使用，同时在突发公共卫生事件的现场检测与临床上的床边 诊断上也具有很好的应用前景。 (Ξ)
【发明内容】
阳〇化]本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测沙口氏菌核酸的恒溫扩增检测试 剂盒及其检测方法。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种沙口氏菌的核酸恒溫扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组 成：
[0008] (l)DNA提取试剂（优选Takara公司的BacterialGenomicDNAExtraction Kit(货号DV810A);
[0009] (2)恒溫扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩 增引物、lX化ermolbuffer、M拆04、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：
[0010] 所述的外围引物分别为：
[0011] 所述正向外围引物为：5' -AACAGTGCTCGTTTACGACC-3'(沈QIDNO. 2); 阳01引 反向外围引物为：5' -CTGATCGATAATGCCAGACG-3'(沈QIDNO. 3);
[0013] 所述两条探针的序列分别为：
[0014] 正向 5'端Biotin标记探针：5' -Biotin-AGGTAGGTAATGGAATGACGA-3'(沈QID NO. 4)；
[0015]反向 5'端Fite标记探针 5' -Fitc-CGTTCTACATTGACAGAATCCTCAG-3'(SEQID NO. 5)；
[0016] 所述两条扩增交叉引物分别为：
[0017] 扩增正向引物： 阳0化]5 ' -GCGATCAGGAAATCAACCAGATAGAATGGTGATGATCATTTCTATGTTC-3 '(沈QID NO.6)；
[0019] 扩增反向引物：
[0020] 5f-CGTACTGGCGATATTGGTGTTTATATTMCAGTACCGCAGGAAAC-3f(沈QIDNO. 7); 阳02U做阳性对照冶有沙口氏菌invA基因片段的DM质粒； 阳0巧 （4)阴性对照巧菌双蒸水。
[0023] 进一步，本发明所述的1XThermolbuffer组成为：20mM的Tris-肥1、lOmM的 KCl、10mM的（NH4)2S〇4、2mM的Μ拆〇4^及质量浓度为 0. 1% 的TritonX-100，pH7. 5。
[0024] 进一步，本发明所述阳性对照为含有长238bp的沙口氏菌invA基因序列的片段， 所述片段的核巧酸序列如下（SEQIDNO. 1): 阳0巧]AACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTC ATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTC GTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCAT TATCGATCAGTACCA
[00%] 进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：
[0027]W包含扩增区域的沙口氏菌invA基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩 增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒（Promega)对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩 增产物通过T-easy质粒转染试剂盒（Promega)构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分 光光度计对所抽提的质粒测A2S。定量并10倍稀释，-2(TC保存。
[0028] 进一步，本发明所述恒溫扩增反应液组成为：两条外围引物各自1化mol,两条探 针各自 20pmol，两条交叉引物各自 40pmol，lXThe;rmolbuffer,Μ拆〇4为6mmol，dNTPs溶 液各0. 4mmol，BstDM聚合酶8U，无菌双蒸水组成补足至25μ1。
[0029] 本发明还提供一种所述沙口氏菌的恒溫扩增检测试剂盒的检测方法，所述检测方 法为： W30]a)用DNA提取试剂从待检测的标本中提取DNA;
[0031]b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板加入到装有恒溫扩增反应液的PCR管中，在 65°C下扩增反应35分钟；标准阳性模板（即阳性对照）加入阳性对照PCR管中，标准阴性 模板（即阴性对照）加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为含有沙口氏菌invA基因 片段的质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；
[0032]C)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置（杭州优思达生物技术公 司3号装置）中进行检测，2分钟W后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含 有沙口氏菌核酸。该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序设有样品垫、有色颗粒结合 物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，其中有 色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗Fite抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗 Fite抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。
[0033] 在本发明提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。本试 剂盒中的6条寡聚核巧酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA 合成不断的自我扩增循环。在本发明提供的沙口氏菌核酸的恒溫扩增检测试剂盒中，对不 同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg2+浓度，反应溫度等的优化，并将本发明 与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了沙口氏菌核酸恒溫扩增定性检测的方法。该试 剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10个拷贝，可W满足快速检测沙口氏菌核酸的要 求。
[0034] 本发明与现有技术相比，具有W下优点和效果：
[00对 （1)本发明所述沙口氏菌的核酸恒溫扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤 简单，可重复性高；
[0036] (2)反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1小时左右；
[0037] 做整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；整 个反应过程不需要复杂的仪器。 (四）
【附图说明】
[0038] 图1为核酸检测试纸条原理示意图。
[0039] 图2为本发明试剂盒用于检测沙口氏菌的特异性结果，图中1-13分别表示伤寒沙 口氏菌CMCC50071、鼠伤寒沙口氏菌CMCC50115、福氏志贺氏菌CMCC51572、铜绿假单胞 杆菌（绿脈杆菌）ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922、阴 沟肠杆菌ATCC13047、副溶血性弧菌ATCC17802、空肠弯曲菌ATCC33291、单增李斯特氏 菌ATCC19111、艰难梭菌ATCC9689、阳性对照品、阴性对照品的实验结果。 W40] 图3为本发明试剂盒用于检测沙口氏菌的灵敏度，图中1-6分别表示104拷贝/微 升、1〇3拷贝/微升、102拷贝/微升、101拷贝/微升、10°拷贝/微升、阴性对照品的实验结 果。 (五）
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0042] 实施例1本发明试剂盒的组成与配制
[0043]a)DNA提取试剂（优选Takara公司的BacterialGenomicDNAExtraction Kit(货号DV810A);
[0044] b)沙口氏菌核酸恒溫扩增反应液：两条外围引物（1化mol)，两条探针（2化mol)和 两条交叉引物（40pmol)，lXT