磁性分离偶联rt-pcr法ev71核酸检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种磁性分离偶联RT-PCR法EV71核酸检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]肠道病毒EV71是引起手足口病的主要病原体，以夏秋季节发病为主，发病年龄以婴幼儿为主，目前的检测方法以RT-PCR为主，检测标本主要为鼻咽部拭子，应用咽拭子的洗脱液直接应用于RT-PCR的检测，由于常规的核酸提取方法的灵敏度的限制，在临床检测中容易造成阳性标本的漏检，从而造成假阴性，特别是在疾病的后期由于病毒载量的下降，更易出现假阴性，不利于疾病的诊断治疗。
【发明内容】
[0003]本实用新型的目的在于提供一种应用磁性免疫分离技术对样本中的病毒颗粒进行分离浓集再行PCR检测，并且在PCR检测过程中加入内参同时扩增，可以大大提高检测灵敏度和可靠性的磁性分离偶联RT-PCR法EV71核酸检测试剂盒。
[0004]本实用新型为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案，其特征在于:盒体I上方连接有盒盖2，盒体I的底部放置有海绵衬垫3，海绵衬垫3上开有与存放不同试剂瓶直径相同的盲孔，分别用于存放磁颗粒溶液4、Trizol试剂5、无水乙醇6、异丙醇溶液7、DEPC水8、EV71 RT-PCR反应液9、逆转录酶系10、Taq酶系11、阴性质控12、阳性质控13试剂瓶。
[0005]本实用新型还可以采用如下技术方案:
[0006]1.所述的磁颗粒溶液表面也可包被二或三种不同EV71高亲和力单克隆抗体。
[0007]2.所述的EV71 RT-PCR反应液中也可换用GAPDH作内参。
[0008]3.所述的用于存放磁颗粒溶液、Trizol试剂、无水乙醇、异丙醇溶液、DEPC水、EV71 RT-PCR反应液、逆转录酶系、Taq酶系、阴性质控、阳性质控的塑料瓶瓶身均贴有相应的标示，或瓶盖采用不同的颜色以示区别。
[0009]本实用新型具有的优点和积极效果是:检测方法为应用磁性免疫分离技术对样本中的病毒颗粒进行分离浓集再行实时荧光定量PCR检测，并且在PCR过程中加入了内参，显著提高了检测灵敏度及结果的可靠性，有利于肠道病毒71型感染的早期诊断和治疗。
【附图说明】
[0010]图1是本实用新型整体结构示意图。
[0011]图1中:1.盒体；2.盒盖；3.海绵衬垫；4.磁颗粒溶液；5.Trizol试剂；6.无水乙醇；7.异丙醇溶液；8.DEPC水；9.EV71 RT-PCR反应液；10.逆转录酶系；11.Taq酶系；
12.阴性质控；13.阳性质控。
【具体实施方式】
[0012]为能进一步了解本实用新型的
【发明内容】
、特点及效果，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下，请参阅图1。
[0013]如图1所示:盒体I上方连接有盒盖2，用硬质纸质或塑料制成的盒体I的底部放置有3cm厚海绵衬垫3，海绵衬垫3上开有与存放不同试剂瓶直径相同的盲孔，分别用于存放磁颗粒溶液4、Trizol试剂5、无水乙醇6、异丙醇溶液7、DEPC水8、EV71 RT-PCR反应液
9、逆转录酶系10、Taq酶系11、阴性质控12、阳性质控13各一瓶；使用时，首先用专用采样棉签，拭抹患者咽后壁和两侧扁桃体部位，放入采样管中并加入3?5mL PBS，震荡后分离洗脱液，磁颗粒溶液1yL与被检咽拭子洗脱液1500 μ L混合，置于摇摆振荡器上富集I小时以防磁颗粒沉淀并促进病毒抗原与抗体的接触，用磁性分离器分离磁性颗粒，以PBS洗液洗磁颗粒沉淀2次并恢复为100 μ L磁颗粒悬液，加入1.5mL EP管中，加入200 μ L Trizol及100 μ L氯仿，强力震荡20秒后静置3分钟，然后12000rpm离心2分钟，取出上层无色液体，转移至新的1.5mL EP管中，加入10yL异丙醇溶液混匀，12000rpm离心5分钟，弃上清，向沉淀加入DEPC水配制的75%乙醇200 μ L，混匀，8000rpm离心5分钟，弃上清，将沉淀室温干燥15分钟，加入30 μ L DEPC水，重悬后为核酸模板；将提取后的核酸模板、阴性对照和阳性对照各5 μ L分别加入相应的反应管内；EV71 RT-PCR反应液15 μ L，逆转录酶系2 μ L，Taq酶系3 μ L于PCR反应管中，8000rpm离心数秒，放入PCR扩增仪，PCR扩增仪循环条件设置:40°C 25分钟，一个循环；94°C 3分钟，一个循环；93°C 15s — 57°C 45s，40个循；结果判断值〈38为阳性，G值多38为阴性。
[0014]其优点是:将具有富集病毒功能的磁性免疫分离技术与RT-PCR技术结合在一起来检测咽拭子洗脱液中的EV71病毒，并且在PCR过程中加入了内参，显著提高了检测灵敏度及结果的可靠性，有利于肠道病毒71型感染的早期诊断和治疗。
[0015]以上所述的实施例仅是对本实用新型的优选实施方式进行描述，并非对本实用新型的范围进行限定，在不脱离本实用新型设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本实用新型的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本实用新型权利要求书确定的保护范围。
【主权项】
1.磁性分离偶联RT-PCR法EV71核酸检测试剂盒，其特征在于:盒体(I)上方连接有盒盖(2)，盒体(I)的底部放置有海绵衬垫(3)，海绵衬垫上开有与存放不同试剂瓶直径相同的盲孔，分别用于存放磁颗粒溶液(4)、Trizol试剂(5)、无水乙醇(6)、异丙醇溶液(7)、DEPC水(8)、EV71 RT-PCR反应液(9)、逆转录酶系(10)、Taq酶系(11)、阴性质控(12)、阳性质控(13)各一瓶。
2.根据权利要求1所述的磁性分离偶联RT-PCR法EV71核酸检测试剂盒，其特征在于:所述的磁颗粒溶液含有超顺磁性纳米颗粒，颗粒表面包被抗EV71多克隆抗体，直径L 5 μ m0
3.根据权利要求1所述的磁性分离偶联RT-PCR法EV71核酸检测试剂盒，其特征在于:所述的EV71 RT-PCR反应液(9)包含dNTPs、Mg2+、EV71特异性引物及其荧光探针、β -actin内参引物及其荧光探针。
4.根据权利要求1所述的磁性分离偶联RT-PCR法EV71核酸检测试剂盒，其特征在于:所述的Taq酶系(11)含有Taq DNA聚合酶和UNG酶。
5.根据权利要求1所述的磁性分离偶联RT-PCR法EV71核酸检测试剂盒，其特征在于:所述的逆转录酶系(10)含有mMLV逆转录酶和RNA酶抑制剂。
【专利摘要】本实用新型公开了磁性分离偶联RT-PCR法EV71核酸检测试剂盒，盒体上方连接有盒盖，用硬质纸质或塑料制成的盒体的底部放置海绵衬垫，其上开有与存放不同试剂瓶直径相同的盲孔，盲孔内分别存放装有磁颗粒溶液、Trizol试剂、无水乙醇、异丙醇、DEPC水、EV71 RT-PCR反应液、逆转录酶系、Taq酶系、阴性质控、阳性质控各一瓶。优点是：本实用新型提供的磁性分离偶联RT-PCR法EV71核酸检测试剂盒在核酸提取前增加了病毒的富集过程，并且在PCR过程中加入了内参，显著提高了检测灵敏度及结果的可靠性，有利于肠道病毒71型感染的早期诊断和治疗。
【IPC分类】C12M1-00, C12R1-93, C12Q1-68, C12Q1-70
【公开号】CN204490862
【申请号】CN201520130734
【发明人】王学超, 魏荣华, 王高升, 傅金瑞, 张超, 张晨磊, 李会萍
【申请人】天津市宝坻区人民医院
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月9日