用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于检测BRCA1mRNA的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于，检测体系PCR反应液包括PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、检测用上下游引物BRCA1-F/BRCA1-R和探针BRCA1-Probe、参照用上下游引物Actin-F/Actin-R探针Actin-Probe；其中，BRCA1-F：CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA；BRCA1-R：GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT；BRCA1-Probe：FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA；Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT；Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT；Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
【专利说明】用于检测BRCAImRNA的核酸检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属生命科学和生物【技术领域】，特别是ー种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技木，能够对人类乳腺癌中的BRCAl表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提闻检测精度。
【背景技术】[0002]乳腺癌作为女性的常见肿瘤，已成为癌症死亡的第二大原因。其诊断主要建立在影像学检查基础上，缺乏实验室特异性诊断指标，给早期诊断带来困难，容易漏诊或误诊，而手术切除又是乳腺癌首选治疗方法，但是术后影响形态，美观不佳，对患者造成较大困扰，更有部分患者因此产生的心理阴影，严重影响她们的生活质量。目前多认为乳腺癌应采取多种方法结合的综合治疗，原发病灶的彻底清理是乳腺癌治疗的关键。另外早期诊断也显得尤为重要，早发现是争取其良好预后的关键。
[0003]乳腺癌I 号基因(breast cancel susceptibility gene I, BRCA I)是世界上第一个被发现的家族性乳腺癌抑癌基因，定位于17号染色体长臂上，由包括22个编码外显子和2个非编码外显子。目前研究发现，DNA修复是钼类化疗耐药性产生的主要机制之一。临床运用表明钼类药物的疗效存在显著的个体差异，部分患者获益，部分患者耐药并出现毒副作用。大量临床研究已经证实:钼类药物的疗效与肿瘤组织中BRCAl基因mRNA表达水平密切相关，即BRCAl基因表达水平低的患者对钼类药物敏感，反之表达水平高的患者表现耐药。然而，抗微管类化疗药是作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的。这类药物时常出现治疗有效率低和副作用大的问题，而且存在显著的个体差异。大量的临床研究显示，抗微管药物的疗效与肿瘤组织中BRCAl基因的mRNA表达水平密切相关，即BRCAl基因表达水平高的患者对抗微管类药物敏感，反之表达水平低的患者表现耐药。因而，BRCAl表达水平对于后期的用药有很重要的指导作用。
[0004]在实际应用中，用于检测BRCAl表达的方法主要为免疫组化，尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题，才促使我们探索新的方法来检测BRCAl表达水平。
[0005]实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR进行实时在线检測，反应BRCAl在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间，还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本发明采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于BRCAl基因检测。
【发明内容】
[0006]鉴于现有技术中检测BRCAl的不足，本发明设计了检测内參/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测BRCAl基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了ー种用于检测BRCAlmRNA的核酸检测试剂盒。
[0007]用于检测BRCAlmRNA的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于:
[0008]检测体系PCR反应液包括PCR缓冲液、d NTP、Mg2+、检测用上下游引物BRCAl-F/BRCAl-R 和探针 BRCAl-Probe、參照用上下游引物 Actin_F/Actin-R 探针 Actin-Probe ;其中，
[0009]BRCAl-F: CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA
[0010]BRCAl-R: GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT
[0011 ] BRCAl-Probe:FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA
[0012]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0013]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0014]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG_TAMRA。
[0015]进ー步地，检测用上下游引物和探针的比例优选为:BRCA1-F: BRCAl-R:BRCAl-Probe 的摩尔比为 2: 2:1。
[0016]參照用上下游引物和探针的比例优选为:Actin-F: Actin-R: Actin-Probe的摩尔比为2:2:1。
`[0017]所述阳性对照品为含有BRCAl基因组的溶液；所述阴性对照品为无BRCAl基因组的溶液。
[0018]RNA提取液可用商业产品QIAGEN RNeasy FFPE Kit石蜡RNA抽提试剂盒替代。
[0019]使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，可以对BRCAlmRNA进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。利用双标准曲线法，将检测结果与正常人的表达水平(0.75)相比，能衡量受测者体内BRCAl基因表达水平是否正常，该方法是ー种新型的用于评价患者BRCAl表达水平的方法，也有助于患者的后期治疗方案的确定。由于引入了“正常人”替代了原有的单纯个体检测，不但能够对受测者体内BRCAl基因表达量进行检测，同时还能够与正常水平进行比较，指导后期用药，可用于辅助临床上乳腺癌的早期诊断、早期预防及高危人群的筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是阳性检测结果示意图；
[0021]图2是阴性检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0022]实施例1
[0023]本发明的用于检测BRCAlmRNA的核酸检测试剂盒，包括:
[0024]红细胞裂解液；
[0025]RNA 提取液:QIAGEN RNeasy FFPE Kit。
[0026]检测体系PCR 反应液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2 X )(包括 PCR 缓冲液、d NTP、Mg2+)、BRCAl 引物各 0.8uM、BRCAl-probe (探针)0.4uM ；Actin 引物各 0.8uM、Actin-probe (探针)0.4uM ;其中，
【权利要求】
1.ー种用于检测BRCAlmRNA的核酸检测试剂盒的使用方法，所述核酸检测试剂盒包括红细胞裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，使用方法包括以下步骤: (I)抽提组织RNA; (2 )将步骤(I)的RNA反转录为cDNA ； (3)配置检测体系PCR反应液；所述检测体系PCR反应液包括PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、检测用上下游引物BRCAl-F / BRCAl-R和探针BRCAl-Probe、參照用上下游引物Actin-F/-Actin-R 探针 Actin-Probe ;其中，
BRCA1-F: CAGCTACCCTTCCATCATAAGTGA
BRCA1-R: GGCCATGTATATGCGAATCTTTTT
BRCAl-Probe:FAM-TTCTGCCCTTGAGGACCTGCGAAAT-TAMRA
Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ； (4)将样品加入步骤(3)所述的检测体系PCR反应液中； (5)利用实时荧光PCR仪对样品进行检测； (6)检测结果判断。
2.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于BRCAl-F: BRCAl-R: BRCAl-Probe的摩尔比为2: 2:1。
3.根据权利要求1所述的使用方法,其特征在于Actin-F: Actin-R: Actin-Probe的摩尔比为2: 2:1。
4.根据权利要求1诉述的使用方法，其特征在于所述阳性对照品为含有BRCAl基因组的溶液；所述阴性对照品为无BRCAl基因的溶液。
【文档编号】G01N21/64GK103451282SQ201310365818
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年4月27日 优先权日:2012年4月27日
【发明者】方国伟, 周晓犊, 王淑一 申请人:杭州艾迪康医学检验中心有限公司