一种基于rpa的日本血吸虫核酸检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于RPA的日本血吸虫核酸检测试剂盒 及检测方法。
【背景技术】
[0002] 血吸虫病是世界上第二大寄生虫病，是一种人畜共患的寄生虫病，流行于亚洲、非 洲和拉丁美洲的76个国家和地区，是世界上重要的公共卫生问题之一。现主要存在6种寄生 于人体的血吸虫，其中我国流行的日本血吸虫病对人体健康危害最严重，且防治难度最大。 日本血吸虫病不仅影响个人健康，而且影响整个血吸虫病流行区域的经济发展。我国已于 2004年将其列为乙类传染病，与传染性非典型肺炎、艾滋病处于同等重要的防治位置。
[0003] 我国的血吸虫病分布在江苏、浙江、上海、安徽、江西、湖南、湖北、四川、云南、广 西、广东、福建等12个省的433个县(市、区），共有钉螺面积148亿平方米，累计感染者达1160 万例，受威胁人口在1亿以上。经过60年的积极防治，全国的血吸虫病疫情已得到有效控制， 但近年来由于生物、自然、社会经济、人口流动、政策保障等因素变化较大，一些地方呈现血 吸虫病疫情扩散蔓延的态势，表现为老疫区血吸虫病患者增加，钉螺扩散明显，新钉螺区出 现，感染性钉螺分布范围扩大，部分已达血吸虫病传播控制和传播阻断的地区可能出现疫 情回升，各地输入性血吸虫病病例增加，说明我国的血吸虫病防治工作还任重道远。
[0004] 国家对血吸虫病的防治非常重视，每年针对血吸虫患者及疫水要进行大量的资金 投入用于血吸虫的防控。目前用于血吸虫诊断的方法主要有病原学诊断、免疫学诊断和超 声诊断等。传统病原学诊断方法是诊断血吸虫病最为可靠、经典，是判断血吸虫病患病与否 的金标准，尤其Kato-Katz涂片奠检法以及毛蝴孵育法。Kato-Katz法是从患者奠便中查找 血吸虫虫卵，较为费时、费力，且疫区群众依从性下降，且易造成漏检。MHT法包括尼龙袋法、 顶管法、集孵法与促孵法等，该方法检出率高于常规方法，但用时太长，工作量大，且同样存 在不能早期诊断和群众依从性差等问题。免疫诊断方法具有较高的敏感性以及疫区群众的 依从性较高等优点，已为广大专业人员和疫区群众所接受，并在对疫区化疗对象的大规模 筛查和血清流行病学调查以及防治效果的评价等方面起到了极为重要的作用，已形成了皮 试、尾蝴膜试验、环卵沉淀试验（C0PT)、间接血凝试验（IHA)、多种酶联免疫吸附试验 (ELISA)和直接免疫检测等方法。C0PT，对于非疫区健康人群具有较高的敏感性和较低的假 阳性率，但对疫区的反复化疗的人群其敏感性为72%，这一方法的NPV较高，超过87%，而 PPV较低32%-70%，这一方法费时且相对复杂，需要显微镜。IHA，仍是社区诊断常规的方 法，用于化疗人群的筛选，同Kato-Katz法及MHT法相比，其敏感性高，简便，快速。然而在反 复化疗的地区，这一方法的PPV较低，低于37 %，其敏感性从69-100 %，其特异性从35-94%， 此外这一方法同卫氏并殖吸虫有64-84%的交叉反应。这限制了其应用。ELISA法包括了 Dot-ELISA，SPA-ELISA等，其敏感性从65-100%，但是大多数报道的特异性均小于60%， ELISA的NPV较高，超过88%，但是大多数报道的PPV非常低。血吸虫病的超声诊断是非损伤 性诊断方法，操作简便，能准确发现肝脏血吸虫病的病理改变，可评估病情的严重程度。在 现场短期内可检查大量人群，立即可获结果，若使用标准化方法，具有可比性。但是对于早 期血吸虫病人无效。
[0005] 疫区每年都要进行大规模的疫水鉴定、灭螺工作。目前，我国对疫水的鉴定工作 主要是依靠:①收集钉螺，然后在光照条件充足的情况下孵育出毛蝴镜检;②采用"哨鼠"的 办法判定该水浴是否有尾蝴;③采集牛粪"奠检"血吸虫虫卵。从钉螺中孵育毛蝴对钉螺的 条件要求高，如果钉螺保存不当导致其体内寄生的胞蝴死亡或者活力下降，将导致假阴性 的产生；另一方面，镜检毛蝴也需要一定的专业技术，对检验人员要求较高，否则也会导致 漏检等。"哨鼠"更是一种耗时长且敏感性较低的检验方法，该方法首选选定水域，然后让小 白鼠在该水域水面游泳一定时间（4小时/天，共2天）；游泳过的小白鼠经过6个周左右的培 养以后，检测该小白鼠是否感染血吸虫，从而来鉴定该水域是否疫水。"哨鼠"方法判定疫水 的工作在时间上有一种严重的滞后感，往往疫情已过而鉴定结果却还没有出来。
[0006] 相比，血吸虫病的核酸诊断理论上是最佳的诊断方法，它既可有效地确诊血吸虫 病患者又可对环境中的感染因素包括钉螺，疫水及牛粪中是否含有血吸虫做出判定，目前 已有多种日本血吸虫的核酸诊断方法包括PCR，Q-PCR以及LAMP等检测方法。PCR及Q-PCR法 依赖于热循环仪器，对操作环境及人员有较高的要求，而LAMP法反应目前存在的一大问题 就是其产物对环境的严重污染，会导致阴性对照产生阳性结果。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种基于RPA的日本血吸虫核酸检测试剂盒及检测方法。
[0008] 一种基于RPA的日本血吸虫核酸检测试剂盒，该试剂盒包含:RPA冻干颗粒，缓冲 液，醋酸镁，RPA反应引物，RPA反应探针。
[0009] 所述试剂盒还包含双蒸水和日本血吸虫基因组DNA。
[0010] 所述RPA冻干颗粒包含噬菌体重组酶UvsX，辅助因子UvsY，DNA聚合酶，单链DNA结 合蛋白，dNTPS。
[0011 ]所述缓冲液为Rehydration Buffer。
[0012] 所述RPA反应引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2所示。
[0013] 所述RPA反应探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。
[0014] 一种利用上述基于RPA的日本血吸虫核酸检测试剂盒检测日本血吸虫核酸的方 法，包括以下步骤：
[0015] (1)在RPA冻干颗粒中加入29.5yL Rehydration BufTer，2· lyL ΙΟμΜ Primer A， 2.1yL 10μΜ Primer B，0.6yL 10μΜ探针，10.7yL双蒸水，2.5yL模板，在反应管盖上加醋酸 镁2.5yL，上下颠倒反应管使之充分混匀后离心，放置于TwistDX荧光检测器内，仪器自动升 温至38°C孵育，在5-20分钟内通过观测荧光曲线进行结果判读；
[0016] (2)结果判定:含有日本血吸虫基因组DNA的反应管荧光曲线上升，阴性对照为平 滑的直线；
[0017] 所述Primer A的序列如序列表SEQ ID No. 1所示；所述Primer B的序列如序列表 SEQ ID No. 2所示;所述探针的序列如序列表SEQ ID No.3所示;所述模板为日本血吸虫基 因组DNA。
[0018] 本发明的有益效果:本发明利用RPA技术建立日本血吸虫的检测方法。这一方法同 现有检测技术相比，其灵敏度与特异性与Q-PCR法相当，远远高于Kato-Katz法、毛蝴孵育 法、ELISA以及IHA。然而Q-PCR需要昂贵的热循环仪器，对环境及人员要求较高，整个反应需 要90min以上，相比RPA所需仪器轻巧便携，整个反应时间在10-20min内完成，结果判定仅需 通过荧光曲线的改变来判定。该检测试剂盒具有灵敏，特异，结果判定简便，快捷等优点。不 仅适用于床边诊断而且可以用于现场研究，环境评估。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例2实验1检测日