核酸的检测方法以及试剂盒、装置的制造方法
【专利说明】核酸的检测方法从及试剂盒、装置
[0001] 本申请是申请日为2010年3月15日、申请号为201080012366.0的中国发明申请"核 酸的检测方法W及试剂盒、装置"的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及能够对通过核酸扩增方法扩增的核酸进行检测的核酸检测方法和试 剂盒、装置。
【背景技术】
[0003] 在分子生物学研究领域、基因检查等临床应用领域中，特异性扩增祀标核酸片段 的方法成为非常重要的技术。在运样的基因扩增方法中，除了最通用的PCR法(Polymerase Chain Reaction) W外，还开发出了无需PCR法中不可缺少的复杂溫度控制的LAMP化oop-Mediated Isothermal Amplification)法、ICANQsothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法等的等溫扩增方法。
[0004] 作为通过PCR法、LAMP法、ICAN法等扩增出的特定核酸区域的检测方法，大致可W 分为对作为扩增产物的DNA进行检测的方法、和对作为副产物的焦憐酸(二憐酸)进行检测 的方法运两类。
[0005] 检测双链核酸的最一般方法已知有对扩增反应后的溶液实施琼脂糖电泳，使之结 合化Mdium Bromide、SYBR Green等巧光性嵌入剂，并观察特异性的巧光的方法(非专利文 献1)。但是，电泳后用化hidium Bromide等巧光性嵌入剂进行染色的方法需要30分~1小时 左右的泳动时间，而且需要用于检测巧光的紫外线照射装置、巧光检测器等昂贵的机械。
[0006] 此外，作为无需进行电泳、而对PCR产物进行检测和定量的方法，已知有通过预先 在PCR开始前的反应液中添加巧光性嵌入剂，并使用巧光分光光度计测定巧光强度，来测定 扩增DNA量的方法(专利文献1)。但是，巧光性嵌入剂与引物等单链核酸结合，因而导致不依 赖于双链核酸量的背景信号增强、检测灵敏度降低的问题。与此相对，已知有通过用优先与 结合了单链核酸的嵌入剂反应的化合物进行处理，来降低背景信号的方法(专利文献2)。但 是，在采用运些方法的情况下，需要用于检测巧光的装置、设备。
[0007] 作为上述W外的方法，例如已知有使用巧光标记的引物进行核酸扩增反应、并通 过巧光偏光来检测该核酸扩增产物的方法(专利文献3)。但是，运需要对未进入扩增产物的 巧光标记引物的分离操作，不仅烦杂，而且由于引物的分离操作，存在所得核酸扩增片段的 收获量减少、结果导致检测灵敏度降低的隐患。此外，一般而言，标记核巧酸、标记引物非常 昂贵，在成本方面也存在问题。
[000引此外，还已知使偏振光通过核酸扩增反应中的反应液，并通过测定该偏振光的旋 光度或圆偏光二色性来检测核酸扩增产物的方法(专利文献4)。但是，旋光度、圆偏光二色 性的测定需要特殊装置。
[0009]现有技术文献 [0010] 专利文献
[0011] 专利文献I:特开平5-237000号公报
[0012] 专利文献2:国际公开第2002/103053号
[0013] 专利文献3:特开平9-187275号公报
[0014] 专利文献4:特开2002-186481号公报
[0015] 非专利文献
[0016] 非专利文献 1 =Molecular Cloning second edition, vol. 1,6.15(1989)
【发明内容】
[0017]发明所要解决的问题
[0018] 本发明的课题是提供:无需特殊装置、简便且高精度地目测检测采用核酸扩增方 法扩增的核酸的核酸检测方法、和核酸检测装置或试剂盒。
[0019] 解决问题的方法
[0020] 本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现:通过在核酸扩增反应的前 或后添加因与核酸结合而色调发生变化的染料，通过在可见光下进行观察，能够检测核酸 扩增的有无。而且独立发现:通过添加与结合双链核酸的染料相比、优先和与单链核酸结合 了的染料、未与核酸结合的染料反应的化合物，改变或者消除来源于除了与双链核酸结合 了的染料W外的色调，能够简便且高精度地目测检测上述核酸扩增片段。而且，还制作了利 用本方法的目测核酸检测试剂盒、装置，从而完成了本发明。
[0021] 目P，本发明设及包含在被检物中的核酸的检测方法，其包括：
[0022] (1)使被检物与染料接触并反应的步骤；
[0023] (2)在可见光下观察该反应生成的物质，目测判定核酸的存在的步骤。
[0024] 优选在所述步骤(1)的前或后包括使与染料反应的物质与被检物接触的步骤(3)。
[0025] 所述染料优选是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱或抑缓冲剂的处理而发生变化的 染料。
[0026] 此外，本发明设及包含在被检物中的核酸的检测装置或试剂盒，其包含：
[0027] (a)保持了能够与核酸结合的染料的载体；
[00%] (C)被检物通过载体(a)的路径;和
[0029] (d)在可见光下观察由被检物与染料的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存 在的判定部位。
[0030] 优选在所述载体(a)与判定部位(d)之间具有(b)保持与染料反应的物质的载体。
[0031] 所述染料优选是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱、或pH缓冲剂的处理而发生变化 的染料。
[0032] 所述染料优选是选自=苯基甲烧类染料、嚷嗦类染料、6激嗦类染料、叮嗦类染料、 夹氧杂蔥类染料、和菲晚输盐类染料中的1种W上的染料。
[0033] 此外，所述染料优选是选自结晶紫、龙胆紫B、维多利亚蓝B、甲基紫、夜光蓝、甲基 绿、甲苯胺蓝0、天青B、亚甲基蓝、亮甲酪蓝、甲基澄、派洛宁Y、漠化乙锭和中性红中的巧中W 上的染料。
[0034] 所述与染料反应的物质优选是选自氧化剂、还原剂、酸、碱、或抑缓冲剂中的巧中W 上的化合物。
[0035] 所述酸优选是选自盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、甲酸、草酸、巧樣酸和乳酸中的1种W上 的酸。
[0036] 所述碱优选是选自氨氧化钢、氨氧化钟、碳酸氨钢、碳酸钟、氨和=乙基胺中的1种 W上的碱。
[0037] 所述氧化剂优选是选自过氧化氨、高儘酸钟、氯酸钟、重铭酸钟、漠酸钢、漠酸钟、 面素、浓硫酸、硝酸、次氯酸钢、二氧化氯、氯胺、四氧化饿、二甲基亚讽和间氯过苯甲酸中的 1种W上的氧化剂。
[0038] 所述还原剂优选是选自棚氨化钢、氯化棚氨化钢、亚硫酸氨钢、亚硫酸钢、次硫酸 钢、焦亚硫酸钟、硫代硫酸钢、谷脫甘肤、抗坏血酸、2-琉基乙醇、Dk二硫苏糖醇、1-硫代甘 油、半脫氨酸、=下基麟、氨基乙硫醇和=2-簇基乙基麟中的1种W上的还原剂。
[0039] 所述抑缓冲剂优选是选自戈氏缓冲液(Good's Buffers)、甘氨酸、憐酸、邻苯二甲 酸、巧樣酸、己比妥酸、班巧酸、乙酸、和碳酸中的1种W上的pH缓冲剂。
[0040] 此外，本发明设及核酸的检测装置或试剂盒，其包含：
[0041] (e)保持能够与核酸结合的染料、并具备能够因外力而形成开口从而释放出染料 的开口部的载体；
[0042] (f)将释放出的染料引导向判定部位的路径;和
[0043] (d)保持导入的被检物、在可见光下观察因从载体(e)经由路径(f)导入的染料与 保持的被检物之间的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位。
[0044] 优选存在于所述判定部位的被检物还包含与染料反应的物质。
[0045] 所述染料优选是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱、或pH缓冲剂的处理而发生变化 的染料。
[0046] 发明效果
[0047] 根据本发明的方法，无需使用特殊的检测仪器，即可在核酸扩增后通过染料的色 调变化目测检测核酸扩增的有无。而且，通过氧化剂、还原剂、酸、碱、pH缓冲剂引起的染料 的色调变化，能够目测检测核酸扩增的有无。此外，由于能够用可见光进行检测，能够提供 使用可见区域分光光度计(其是一种通用性高的装置)等的简便的核酸检测方法。
【附图说明】
[0048] [图1]显示本发明的色谱型核酸检测装置的一个例子的示意图。
[0049] [图2]显示本发明的滤器型核酸检测装置的一个例子的示意图。
[0050] [图3]显示本发明的吸引型核酸检测装置的一个例子的示意图。
[0051] [图4]显示本发明的流路型核酸检测装置的一个例子的示意图。
[0052] [图引显示本发明的管型核酸检测装置的一个例子的示意图。
[0053] [图6 ]在实施例5中，向LAMP反应液中添加了甲基绿时的吸收光谱图。
[0054] [图7]在实施例5中，向LAMP反应液中添加甲基绿后、再添加了KOH时的吸收光谱 图。
[0055] [图引在实施例6中，向LAMP反应液中添加了甲苯胺蓝加寸的吸收光谱图。
[0056] [图9]在实施例6中，向LAMP反应液中添加甲苯胺蓝0后，再添加了亚硫酸钢时的吸 收光谱图。
[0057] 发明的【具体实施方式】
[0058] W下对本发明进行具体说明。
[0化9] 1.核酸的检测方法
[0060] 本发明的包含在被检物中的核酸的检测方法包括：
[0061] (1)使被检物与染料接触并反应的步骤、
[0062] (2)在可见光下观察该反应生成的物质，目测判定核酸的存在的步骤。
[0063] 在使被检物与染料接触并反应的步骤(1)中，只要被检物与染料接触、两者之间发 生反应即可，可W W任何形式接触。
[0064] 在本发明中，检测对象是核酸，双链核酸包括双链DNA、双链RNA、DNA与RNA的杂合 链、W及PNA等人工核酸的双链。而且，即使是单链核酸，当其多个混合存在、且能被染料染 色时，也能够采用本发明的检测方法进行确认。
[0065] 对被检物没有特殊限制，只要包含核酸即可。不但可W是核酸扩增方法的反应液， 也可W是来自微生物、动物细胞或植物细胞的抽提液，还可W是来自食品的抽提液。
[0066] 核酸扩增方法只要是WPCR法为代表的扩增核酸序列的方法即可，可W是任何核 酸扩增方法。例如，除了 PCR法W外，可W示例出LCR(Ligase畑ain React ion)法、SDA (Strand Displacement Amplification)法、RCA(Rolling Circle Amplification)法、CPT (Cycling Probe Technology)法、Q-Beta Replicase Amplification Technology法、ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids)法、 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of DNA)法、NASBA(Nucleic acid Sequence-based