核酸制剂的检测试剂及核酸制剂检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸制剂的定量检测方法，属于生物医学技术领域。
【背景技术】
[0002] 核酸作为药物、在基因治疗和基因沉默的基础研宄和临床应用日益广泛。核酸，包 括DNA、RNA的应用应为其带有强的负电荷及不稳定性受到限制。因此，核酸的应用需要载 体保护其不受酶的水解和携带其进入靶组织。纳米颗粒技术的发展，在很大程度上促进了 核酸在研宄及开发核酸药物的应用。而药理作用取决于核酸分子包裹程度。因此，核酸分 子包裹量的测定变得尤其重要。因为核酸分子被酶水解的不稳定性，在颗粒表面的核酸分 子，是可被水解，不能发生生物效应。只有在纳米颗粒内部的核酸才有可能到达靶组织和细 胞，发挥效应，测定其剂量。核酸是易溶于水的物质，最常用的方法是将被包裹的核酸分子 溶于水中，直接在紫外吸收光谱法UV260下测其光吸收。根据其消光系数，就可以直接计算 出溶液中核酸含量。而在纳米颗粒中，由于纳米化合物的包裹或相互作用，有些纳米颗粒中 的核酸不能溶出在水中，不能直接用光谱测量。目前常用的方法测量纳米颗粒尤其是脂质 体包裹的核酸的方法有以下几种：第一种技术方案应用核酸染料，先利用TritonX-100将 脂质体破碎，加入核酸结合焚光染料RiboGreen。然后在kex= 500nm,kem= 525nm下测 定荧光的量，推算出核酸在纳米颗粒中的含量。此方案手续繁琐，需要荧光色谱仪和荧光染 料，成本较高，且变量较大；第二种技术方案采用层析法：对于脂质体而言，可先利用层析 柱将游离的和结合的核酸分子分开，然后将其溶于酒精，直利用光谱在260nm下测定核酸 的量。这种方案需要层析柱，避免不了样品稀释，同时，如果纳米颗粒带有阳电荷，核酸分子 将可能与其结合，不能完全游离，加上有些成分在酒精中溶解度较低，均会影响核酸的准确 定量。其他技术方案还包括酶保护法、超速密度离心及毛细管电泳，上述方案均需要特殊技 术或昂贵设备，且准确性也应手续复杂而打折扣。因此，为解决以上问题，亟待研发一种新 的定量方法。
【发明内容】
[0003] (一）要解决的技术问题
[0004] 为解决上述问题，本发明提出了一种核酸制剂的定量检测方法，简化了纳米颗粒 中核酸的定量方法，比现有的方法更经济、快速、且保持了准确性、不需要特殊的设备。
[0005] (二）技术方案
[0006] 本发明提供一种用于核酸的定量检测的CK介质，其由水1-10份、水溶型有机溶剂 20-80份和水不溶型有机溶剂2-20份制成。
[0007] 进一步地，其由水2-5份、水溶型有机溶剂25-40份和与水不溶型有机溶剂10-18 份制成。
[0008] 进一步地，其由水2份、水溶型有机溶剂30份和与水不溶型有机溶剂15份制成。
[0009] 进一步地，水溶型有机溶剂选自乙醛、乙酸、丙酮、乙腈、1，2-丁二醇、1，3-丁二 醇、1，4-丁二醇、2-丁氧基乙醇、丁酸、二乙醇氨、二乙烯三胺、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲 醚、二甲亚砜、1，4-二氧六环、乙醇、乙胺、乙二醇、甲酸、糠醇、甘油、甲醇、甲基二乙醇氨、甲 基异腈、1-丙醇、1，3-异丙醇、戊醇、2-丙醇、丙酸、丙二醇、吡啶、四氢呋喃、三乙二醇中的 一种或两种以上的组合。
[0010] 进一步地，水不溶型有机溶剂选自己烷，甲苯六氢化苯，乙酸乙酯、醋酸异丙酯、 甲基异丁酮、正辛醇、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯甲烷，、四氯化碳、氯仿、1，1，1-三氯乙烷、 一氟二氯甲烷、氟三氯甲烷、四氟化碳中的一种或两种以上的组合。
[0011] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，氯仿15份混合。
[0012] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，二氯甲烷15份混合。
[0013] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，氯仿15份混合。
[0014] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，二氯甲烷15份混 合。
[0015] 本发明还提供一种核酸制剂的定量检测方法，所述方法包括如下步骤：
[0016] 步骤一：配制CK介质：取水1~10份、与水溶型有机溶剂20~80份和水不溶型 有机溶剂2~20份混合；
[0017] 步骤二：将纳米颗粒加入到配制好的CK介质中，得到混合溶液；
[0018] 步骤三：取混合溶液，放置于紫外分光光度计下进行测量，测定纳米颗粒包裹的核 酸的吸光值；
[0019] 步骤四：重复步骤二及步骤三的操作，并完成三次测量；
[0020] 步骤五：根据步骤四测量得到的三组吸光值，取平均值后，按照常规的计算方法， 按照纳米颗粒包裹的核酸的消光系数，并计算得到纳米颗粒包裹的核酸的量。
[0021] 进一步地，所述步骤二具体如下：将纳米颗粒的样品稀释至合适的浓度，得到样品 液；各取2ml配制好的CK介质至2支比色皿中，调零；取Xul样品液放入测量的比色皿内， 使该样品液完全溶解于CK介质，并混合均匀。
[0022] 进一步地，所述步骤三具体如下：将紫外分光光度计开启预热后，进入调光度模 式，并调节波长为260nm;取混合溶液于UV260nm的紫外分光光度计下进行吸光测定，并测 量得吸光值。
[0023] 进一步地，所述步骤一中的水溶型有机溶剂是酒精或异丙醇；和水不溶型有机溶 剂是氯仿或二氯甲烷。
[0024] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，氯仿15份混合。
[0025] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，酒精30份，二氯甲烷15份混合。
[0026] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，氯仿15份混合。
[0027] 进一步地，所述CK介质的配制具体包括：水2份，异丙醇30份，二氯甲烷15份混 合。
[0028] (三）有益效果
[0029] 与现有技术相比，本发明的核酸制剂的定量检测方法，简化了纳米颗粒中核酸的 定量方法，不需要添加任何设备，利用实验室常用的溶剂就可以完成操作，成本低，准确性 较高。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明的定磷法标准曲线的示意图；
[0031] 图2是本发明的超纯水稀释标准siRNA样品的配制方法的示意图；
[0032] 图3是本发明的CK介质中标准siRNA样品的配制方法的示意图；
[0033] 图4是本发明的标准品41110-Agalh的色谱图；
[0034] 图5是本发明的样品纳米制剂，批号R14032的色谱图；
[0035] 图6是本发明的样品纳米制剂，批号R14061的色谱图；
[0036] 图7是本发明的样品纳米制剂，批号R14079的色谱图；
[0037] 图8是本发明的样品纳米制剂，批号R14133的色谱图；
[0038] 图9是本发明的样品纳米制剂，批号R14134的色谱图；
[0039] 图10是本发明的样品纳米制剂，批号R14135的色谱图；
【具体实施方式】
[0040] 实施例1定磷法测定标准品未包裹的siRNA的含量
[0041] 准确称取干燥标准siRNA(本实验室固相合成）样品A= 36mg，B= 24mg，C= 62mg，分别溶于lmL无菌水中。
[0042]制备标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110°C烘至恒重（4小时），准确称取0. 8775g溶 于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液每lml含磷400yg， 稀释20倍（20yg/ml)。定磷试剂需要：17%硫酸、2. 5%钼酸铵溶液及10%抗坏血酸溶液， 上述三种溶液贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可使用，呈深黄甚至棕色即失效，临时制备 定磷试剂时将上述三种溶液与水按如下比例混合：17%硫酸：2. 5%钼酸铵溶液：10%抗坏 血酸溶液：水=1:1:1:2(V:V)。
[0043] 取干燥试管7支，按0~6依次编号，根据表1所示加入试剂，加毕摇匀；在45°C 水浴中保温l〇min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度；如图1所示为以磷含量为 横坐标，吸光度为纵坐标所作的定磷法标准曲线图；
[0044] 表1 :标准曲线测定数据：
[0047] 标准曲线：y= 0? 483x+0. 0024
[0048] 标准品测定方法：取50毫升凯氏烧瓶2只，做平行样，分别取标准siRNA样品，置 于各凯氏烧瓶内，分别加入6mol/L硫酸1.OmL置消化架用酒精灯加热消化15min，（溶液呈 褐色甚至更深），稍加冷却，加入2mol/L硝酸2滴，再继续加热5min(逸出白色烟雾，溶液无 色透明，表示消化完成时为止）。待凯氏烧瓶冷却后，分别加入1.OmL蒸馏水，置沸水浴蒸煮 5min，使焦磷酸分解。凯氏烧瓶从沸水浴中取出，待其冷却，将瓶内的消化液分别移入两