汉坦病毒rt-lamp核酸检测引物及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测技术应用领域，具体地说涉及血液样本中汉坦病毒（Hantaan virus)汉滩型核酸检测用引物及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 汉坦病毒归属布尼亚病毒科，是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，为单负链RNA 病毒，分3个片段，由核衣壳包绕，有包膜。病毒增殖时，以负链RNA为模板产生正链RNA和 mRNA，由正链RNA复制子代病毒基因组，出芽释放获得包膜。基因组包括L、M、S 3个片段，分 别编码L聚合酶蛋白、Gl和G2糖蛋白、核蛋白。汉坦病毒包括引起肾综合征出血热（HFRS) 的汉坦病毒（Hantaan virus，HTNV)、汉城病毒（Seoul virus，SE0V)、普马拉病毒（Puumala virus，PUUV)、多不拉伐病毒（Dobrava virus，D0BV)及引起汉坦病毒肺综合征（HPS)的无 名病毒（Sin Nombre virus，SNV)、纽约病毒（New York virus，NYV)等。
[0003] 汉坦病毒能感染野生啮齿动物和人类，引发人类的肾综合征出血热（HFRS)和汉 坦病毒性肺综合症（HPS);这些病遍及亚洲、欧洲、非洲、美洲、大洋洲等70多个国家，其流 行之广，危害之重，已成为全球性的公共卫生问题。我国汉坦病毒的感染情况更为严重，世 界汉坦病毒感染每年报告的病例数大约在150, 000~200, 000之间，而我国发病人数则占 世界报道病例数的90%以上，是受汉坦病毒危害最为严重的国家。我国流行的主要是肾综 合征出血热，近十年来我国年报告发病人数一直稳定在4~6万人，而且新疫区不断出现， 并时有爆发。
[0004] 汉坦病毒的检测方法主要有病毒分离、血清学检测方法和基因检测方法。基因检 测方法主要是反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)、反转录荧光定量PCR检测（RT-Real-time PCR)，与血清学抗体检测相比在灵敏性和特异性上的都大幅度提高。目前，现有的基因检测 方法存在的问题主要是检测结果都依赖于检测仪器（凝胶成像系统、荧光定量PCR仪），大 大限制了检测方法的推广及快速检测应用。
[0005] 环介导等温核酸扩增技术（LAMP)是由日本学者Notomi于2000年开发的一种新 颖的恒温核酸扩增方法，该技术利用3对不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，通 过一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)在等温条件下进行祀序列高效快速扩增。 近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。
[0006] 由于LAMP的扩增产物是白色焦磷酸镁沉淀，用肉眼难以观察，日本已研制出专门 对LAMP产物进行实时监控的浊度仪。但是浊度仪的使用不但增加了费用，而且不方便携 带；有学者利用向反应后的体系中加入SYBR Green I染料的方法来检测扩增产物，但是这 样观察又必需开盖处理，LAMP扩增的高效性及高敏感性使得产物中含有大量目的片段，开 盖添加染料极其容易污染环境。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测汉坦病毒的RT-LAMP 引物。
[0008] 本发明的第二个目的在于提供一种包含上述引物的检测汉坦病毒的RT-LAMP可 视化试剂盒。
[0009] 本发明的第三个目的在于提供一种汉坦病毒的RT-LAMP检测方法。
[0010] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0011] 本发明提供了一组检测汉坦病毒的引物，该组引物由序列表SEQ ID No. 1至序列 表SEQ ID No. 6所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No. 1为正向外引物，SEQ ID No. 2为反向外引物，SEQ ID No. 3为正向内引物，SEQ ID No. 4为反向内引物，SEQ ID No. 5 为正向环引物，SEQ ID No. 6为反向环引物。详见表1。
[0012] 表1引物序列
[0015] 进一步地，本发明还提供了一种检测汉坦病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其包括用 于检测汉坦病毒的一组引物，具体地，该组引物包括序列表SEQ ID No. 1所示的正向外引物 (F3)，序列表SEQ ID No.2所示的反向外引物（B3)，序列表SEQ ID No.3所示的正向内引 物（FIP)，序列表SEQ ID No. 4所示的反向内引物（BIP)，序列表SEQ ID No. 5所示的正向 环引物（LF)，序列表SEQ ID No. 6所示的反向环引物（LB);所述引物均委托上海生工生物 技术有限公司合成。
[0016] 进一步地，上述检测汉坦病毒的RT-LAMP检测试剂盒还包括完成RT-LAMP反应的 ThermoPol缓冲液、dNTPs、MnCl2、MgS04、链置换DNA聚合酶、AMV逆转录酶、甜菜碱和钙黄绿 素（Calcein)等。
[0017] 本发明还提供了一种汉坦病毒的RT-LAMP检测方法，该方法包括以下步骤：
[0018] (1)提取待测样品的RNA ;可采用现有技术中已知的提取试剂或自制试剂进行RNA 提取；
[0019] (2)配制RT-LAMP反应体系：
[0020] 表2 LAMP反应体系
[0021]
[0022]
[0023] (3)反应：将步骤（2)配制好的反应体系进行RT-LAMP反应，条件为63°C恒温反应 60min，反应结束后80°C灭活5min ;
[0024] (4)结果判读：通过自然光照下或紫外光下判读结果或是二者结合判读：
[0025] ①在自然光下反应产物为绿色或橙绿色，说明待测样品含有汉坦病毒；在自然光 下反应产物为橙色，说明待测样品不含有汉坦病毒。
[0026] ②在紫外光下反应产物呈现明显的绿色荧光，说明待测样品含有汉坦病毒，无荧 光或绿色荧光不明显，说明待测样品不含有汉坦病毒。
[0027] ③采用琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳检测有特征性梯状条带，则说明样品中含汉 坦病毒；如没有特征性梯状条带，则说明样品中不含有汉坦病毒。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
[0029] (I)RT-LAMP成本低廉，利用Bst DNA polymerase在63°C实现等温扩增，不需要复 杂且昂贵的PCR仪，因此，本发明提供的试剂盒使用成本低。
[0030] (2)本发明所提供的试剂盒反应迅速，利用AMV反转录酶实现一步法RT-LAMP，无 需增加42°C Ih的反转录过程，可以在60min内完成反应。
[0031] (3)本发明提供的试剂盒得到的反应结果易于观察，阳性反应管在自然光下就会 呈现出绿色，置于紫外光下则呈现强烈的绿色荧光。
[0032] (4)本发明提供的试剂盒特异性好，对汉坦病毒汉坦型以外其它都呈阴性反应； 灵敏度高，最低可以检测到Ipg的RNA模板。
[0033] (5)本发明所述的可视化RT-LAMP试剂盒可快速、灵敏地检测汉坦病毒，其操作简 单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，易于大范围推广应用。
[0034] 下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开 内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
【附图说明】
[0035] 图I LAMP扩增体系的建立。1:阴性对照；2-3 :汉坦病毒67-115。
[0036] 图 2 汉坦病毒 RT-LAMP 灵敏度检测。l:lpg/y I ;2 :10pg/y I ;3 :100pg/y 1 ;4 : Ing/ μ I ;5 :10ng/ μ I ;6100ng/ μ 1 ;7 :1 μ g/ μ 1 ;8 :阴性对照。
[0037] 图 3 汉坦病毒 RT-LAMP 特异性检测。1:汉坦病毒 67-115 ;2 :Seoul 80-39 ;3 :HBV ; 4 :HCV ;5 :HIV〇
【具体实施方式】
[0038] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不 用于限制本发明的保护范围。