用于现场检测多种血清型口蹄疫病毒的引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术 (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术（Lateral Flow Assay)现场检测多种血清型口蹄疫病毒的引物、探针及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV)引起的发生在猪、牛、羊等偶蹄类动物上的急性、 热性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为"A类烈性传染病"，一旦暴发，必须扑杀 感染及接触感染的动物，造成巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及 相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。口蹄疫病毒有7个血清型和65 个以上的血清亚型，血清型之间无交叉免疫现象，因而难以控制。我国为口蹄疫流行国家， 主要流行〇型、A型和Asia 1型口蹄疫。2005年我国大面积爆发了 Asia 1型口蹄疫，2009 年和2013年爆发了 A型口蹄疫，近年来，均有0型口蹄疫的散发和流行，特别是随着我国养 殖业集约化、规模化的迅猛发展，口蹄疫的传播风险也来越大。
[0003] 目前，病毒的分离与鉴定、PCR及其相关的技术是口蹄疫病毒检测的主要方法，口 蹄疫病毒的分离培养要求在生物安全三级以上实验室进行，并需要特殊的仪器设备和专业 的技术人员，在分尚过程中存在病毒扩散的危险，且耗时长。而PCR及其相关的技术可以检 测口蹄疫病毒的核酸，但需要复杂的仪器设备，难以满足非实验室等现场环境下的检测要 求。
[0004] 重组酶等温扩增（recombinase ploymerase amplification, RPA)技术是不同于 PCR的核酸检测技术，RPA是在重组酶介导下模拟体内DNA的复制过程。重组酶与引物结 合形成蛋白-DNA复合物后，寻找到双链DNA同源序列，在单链DNA结合蛋白的作用下，模板 DNA解链，引物与模板DNA配对，并在链置换DNA聚合酶的作用下复制、扩增，单个DNA模板 分子得到大约1〇12扩增产物。它与PCR不同，不需要退火反应过程，可在37°C~42°C等温 条件下，反应20余分钟即可得到扩增产物（Forget et al.，2012)。RPA可以与侧向流动免 疫层析技术相结合，在RPA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探 针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点（dSpacer)，该位点可被nfo核酶识别、切 害J，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的 RPA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测 线。该方法检测时间短，5分钟左右就能目测结果，肉眼判读。
[0005] 但目前对于RPA技术的研宄尚处于起步阶段，国内外还没有将RPA技术应用于 FMDV检测的报道。本发明系首次采用RPA技术建立快速检测FMDV的方法，并通过特异性和 灵敏度评价，可用于临床现场检测，为FMDV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。
【发明内容】
[0006] 针对RPA技术应用于FMDV检测领域的空白，本发明提供了一种准确、快速、简便的 现场检测口蹄疫病毒的RPA检测方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] 一种用于通过RPA-侧流层析技术检测多种血清型口蹄疫病毒的通用引物和探针 组合，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探针序列 如 SEQ ID No. 3 所示。
[0009] 正向引物 2BF:5' -GTCTCGACGAGGCCAAGCCCTGGTACAAACT-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0010] 反向引物 2BR :5' -【Biotin】CGAGGCGACCTTGACCAACCCGGCCAACAGG-3' ；（SEQ ID No. 2)
[0011] 探针序列 2BP :5'-【FAM】GTCTTGAGATTCTGGACAGCACTTTTGTCGTG【dSpacer】 AAAAGATCTCCGACTCG【C3-spacer】3, ；（SEQ ID Νο·3)。
[0012] 需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp， 探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度 的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。 RPA技术正处于起步研宄阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引 物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引 物进行优化、筛选才能得到。
[0013] 本发明还提供了一种检测口蹄疫病毒的试剂盒，该试剂盒中包含有由用于通过 RPA技术检测口蹄疫病毒的引物和探针组成的引物探针液。
[0014] 所述引物探针液的组成为：正向引物2BF和反向引物2BR终浓度均为0. 4μπιο1/ L，检测探针2ΒΡ的终浓度为0. 12 μmol/L，扩增核苷酸序列片段为SEQ ID NO. 4所示。
[0015] 进一步的，该检测口蹄疫病毒的试剂盒中还包括有：标准阳性质粒、缓冲液、酶扩 增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试纸条；
[0016] 所述阳性标准质粒为pEASY-T3_2B，用于检测的阳性对照，以检验反应体系和反应 条件能否正常反应。
[0017] 用于构建阳性标准质粒的引物序列如下：
[0018] FMDV-F :5, -CACTCCCTTACACCGCTCCC-3,（SEQ ID No:5);
[0019] FMDV-R :5, -ACTCTTTCCCTGGCCGGATT-3'（SEQ ID No:6)。
[0020] 所述阳性标准质粒pEASY-T3-2B是以FMDV基因组cDNA为模板，由SEQ ID NO. 5和 SEQ ID NO. 6PCR扩增的核苷酸序列片段（SEQ ID NO. 7)与PEASY-T3载体相连接后得到的 重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。
[0021] PCR 扩增的反应体系为 50 μ L :10XPCR Buffer II (Mg2+Plus) 5 μ L、2. 5mM dNTP M ixture 8 μ L、rTaq 0· 5 μ L (5U/ μ L)、cDNA 模板 2 μ L，10 μ mol/L 的引物 FMDV-F 和 FMDV-R 各2 μ L，灭菌超纯水加至50 μ L。
[0022] 反应程序为 94°C预变性 3min，然后 94°C 20s，55°C 20s，72°C 20s，35 个循环；72°C 延伸5min，4°C保存。
[0023] 所述无菌双蒸水可作为阴性对照或补足反应体系用，其制备方法为双蒸水经高压 灭菌后，分装到灭菌的小管中。
[0024] 所述的缓冲液、酶扩增八联管、反应驱动液、产物稀释液可于市场购买得到。
[0025] 具体的，一种检测口蹄疫病毒的试剂盒，每50yL扩增体系中含有缓冲液 29. 5 μ L、引物探针液4. 6 μ L、无菌双蒸水12. 4 μ L、待测样本cDNA或阳性对照分别为1 μ L 或空白对照1 μ L、反应驱动液2. 5 μ L。（上述阳性对照是指阳性标准质粒，空白对照指无菌 双蒸水）
[0026] 本发明还提供一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测FMDV的方法，步骤如 下：
[0027] (1)提取待测样本的总RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA ;
[0028] (2)设计用于多种血清型口蹄疫病毒检测的通用引物和探针，以cDNA为模板，进 行RPA扩增，扩增条件为：38°C水浴4min后，混匀，再38°C水浴20min ;
[0029] (3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测，当试纸条出现两条棕色条带，一条位 于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有口蹄疫病毒核酸；当试纸条 只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有口蹄疫 病毒核酸。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] (1)采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对FMDV进行检测的方法，具有较 高的灵敏度、特异性和重复性。
[0032] 本发明选用的口蹄疫病毒2B基因引物是经大量实验筛选获得的，特异性好，与 牛、猪的其他病毒包括牛肠道病毒、牛流热病毒、牛病毒性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传 染性鼻气管炎病毒、猪疱瘆病毒、猪瘟病毒等病毒无交叉反应。
[0033] RPA能够将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约 IO12扩增产物；本发明所建立检测方法可检测5TCID 5(|的FMDV病毒。
[0034] (2)本发明的RPA技术并结合侧流层析技术检测FMDV的方法，既具有分子生物学 检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器， 尤适于基层实验室和现场的口蹄疫病毒快速筛查检测。
[0035] (3)检测速度快：与常规PCR相比，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，RPA反应的 最适温度在37°C -42°C之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。
[0036] (4)不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测。本发明所建立检测方法可以在常温 等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不要PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽等复杂 的仪器设备，而且RPA不需复杂的样品处理，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。
【附图说明】
[0037] 图1为RPA引物、探针组的筛选结果，其中1为引物2BF、2BR和探针2BP组，2为 引物2CF、2CR和探针2CP1组，3为2CF、2CR和探针2CP2组，4为3AF、3AR和探针3AP组，5 为3CF、3CR和探针3CP组，6为3DF