μ L (10 μ mol/L)，探针 0· 6 μ L (10 μ mol/L)，缓冲液 29. 5 μ L，模板 cDNA 14 1^，用(1(1!120 12.4 4 1^将上述混合液加入到含有冻干酶粉的0.21111^￥18七41即11；1；'〇八联反 应管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2. 5yL的醋酸镁（280mmol/L)启动反 应。38°C 4min，混匀后，再 38°C 20min。
[0081] 每个梯度的模板浓度做三个重复，通过RPA侧流层析试纸条检测，验证RPA侧流层 析试纸条方法的批内重复性；另外，每间隔2d重复一次，共进行3次重复，验证RPA侧流层 析试纸条方法的批间重复性。所获得的RPA产物分别进行侧流层析试纸条检测。结果表明， 2B引物探针组可检测到的5TCID 5Q的cDNA，见图2。
[0082] 2. RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性分析
[0083] 参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取牛传染性鼻气管炎病毒和猪疱瘆病毒 的DNA ;提取牛肠道病毒、牛流热病毒、牛病毒性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、猪瘟病毒RNA， 参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。
[0084] 按照上述步骤建立的2B引物探针组的RPA方法进行特异性试验，分别以A型、0 型、Asial型口蹄疫病毒的cDNA、牛传染性鼻气管炎病毒DNA、牛肠道病毒cDNA、牛流热病毒 cDNA、牛病毒性腹泻病毒cDNA、水痕性口炎病毒cDNA、猪痕病毒cDNA、猪痕疼病毒的DNA为 模板，以CldH 2O为阴性对照，进行RPA扩增，试验重复3次。
[0085] 所有的RPA产物进行侧流层析试纸条检测，如图3所示，1 :0型口蹄疫病毒；2 :A 型口蹄疫病毒；3 :Asia 1型口蹄疫病毒；4 :标准阳性质粒；5 :牛肠道病毒；6 :牛流热病毒； 7 :牛病毒性腹泻病毒；8 :水疱性口炎病毒；9 :猪瘟病毒；10 :猪疱瘆病毒；11 :牛传染性鼻 气管炎病毒；12 :ddH20。从图中可以看出，1~4试纸条在检测区有阳性条带和质控条带， 而5-12则无阳性检测条带，仅有质控条带，证实所优化的2B引物、探针组扩增口蹄疫病毒 特异性好，与其它检测病毒无交叉反应。因此，经优选出的口蹄疫病毒通用引物2BF、2BR和 探针2BP，用于建立检测口蹄疫病毒的RPA侧流层析试纸条方法，适用于鉴定未知样本是否 存在口蹄疫病毒的核酸。
[0086] 实施例4 :RPA侧流层析检测试剂盒的组装与灵敏度、重复性试验
[0087] 将引物2BF和2BR各200 μ L、探针2BP 60 μ L混合，分装50 μ L/管，作为引物探针 液；然后与标准阳性质粒、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、侧流免疫层析 试纸条、产物稀释液组装成RPA侧流层析检测试剂盒。
[0088] 利用所组装的RPA侧流层析检测试剂盒，按实施例3中的5TCID5(I口蹄疫病毒进 行灵敏度检测，反应体系为：引物探针液4. 6 μ L，缓冲液29. 5 μ L，模板cDNA 1 μ L，CldH2O 12. 4 μ L，将上述混合液加入到酶扩增八联管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加 入2. 5yL的反应驱动液启动反应。38°C4min，混匀后，38°C20min。做三个重复，取IyL 的RPA扩增产物用49 μ L的产物稀释液稀释，侧流免疫层析试纸条进行检测。结果表明，所 组装的RPA侧流层析检测试剂盒可检测到的5TCID5(I 口蹄疫病毒cDNA，试验重复3次，结果 见图4。
[0089] 实施例5:临床样本的检测
[0090] 1.样本的处理
[0091] 采集感染疑似口蹄疫病毒牛的流涎、水疱液等拭子样本及血液、血清、气溶胶等样 本，拭子样本浸于500 μ L的含PBS溶液的离心管中，反复挤压、搅拌，取出上清液于新的离 心管中，置于冰上备用。
[0092] 2.磁珠法快速提取总RNA
[0093] (1)在1.5mL无核酸酶的离心管中加入20yL蛋白酶K、3yL Carrier RNA和 15 μ L磁珠悬液G，加入300 μ L缓冲液RLCK，再加入200 μ L的处理后的样本上清液\血液 \血清等，移液器混匀。
[0094] (2)室温孵育lOmin，期间每3min上下颠倒混匀，使磁珠与核酸充分混合。
[0095] (3)将离心管置于磁力架上lmin，小心去除液体，加入500 μ L漂洗液PW I，混匀， 磁力架上静置30sec，去除液体；再加入500 μ L漂洗液PW II，混匀，磁力架上静置30sec， 去除液体；然后再重复用PW I和PW II各洗1次，磁力架静置30sec，尽量去除液体。
[0096] (4)将离心管置于磁力架，晾干5-10min。
[0097] (5)取下离心管，加入50 μ L无 RNAase的双蒸水，震荡混勾，56°C孵育2min，磁力 架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新管中，置于冰上备用。
[0098] 3.反转录制备cDNA
[0099] 参照反转录试剂盒说明书进行反转录，5XRT buffer 2 μ L、随机引物1 μ L、AMV反 转录酶I UL、粗提的RNA 6 yL。30°C 10min，42°C 30min，95°C 5min，将反应管置于冰上。
[0100] 4.临床样本的检测
[0101] 待测样本为经本实验室利用荧光定量方法检测过阳性流涎、鼻拭子等样本17份 和4份阴性样本。利用磁珠法快速提取总RNA，反转录cDNA。以提取的21份样本的cDNA分 别为模板，以阳性质粒为阳性对照、CldH 2O为阴性对照，利用实施例4组装的RPA侧流层析检 测试剂盒进行检测。引物探针液4.6 μ L，缓冲液29. 5 μ L，模板cDNA IyUddH2O 12. 4 μ L， 将上述混合液加入到酶扩增八联管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2. 5 μ L 的反应驱动液启动反应。38°C 4min，混匀后，38°C 20min。取1 μ L的RPA扩增产物用49 μ L 的产物稀释液稀释，侧流免疫层析试纸条进行检测。若试纸条的检测区出现阳性检测条带， 则待测样本中含有口蹄疫病毒；若试纸条的检测区未出现阳性检测条带，待测样本中没有 口蹄疫病毒。
[0102] 经RPA侧流层析检测试剂盒检测，呈阳性的17份，呈阴性的样本4份，说明样品中 有17份为口蹄疫病毒阳性，4份样品为口蹄疫病毒阴性，即不含有口蹄疫病毒，见图5。其 中阳性样本1、4、9为气溶胶收集液，2、3、7为流涎，5、6为水疱液，8、IO、11为血液，12、13为 血清，14、17为奶样，15、18为鼻拭子样本，16为阳性质粒，19-22分别为阴性的气溶胶、血 液、血清、奶样样本，23为ddH 20。将此结果与本实验室的SYBR Green I荧光定量PCR检测 结果对照，结果完全一致。
【主权项】
1. 一种用于通过RPA-侧流层析技术检测口蹄疫病毒的通用引物和探针组合，其特征 在于，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探针序列 如 SEQ ID No. 3 所示。2. 权利要求1所述的引物和探针组合在制备检测口蹄疫病毒的检测试剂中的应用。3. -种检测口蹄疫病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含由权利要求1所述的引 物和探针组成的引物探针液。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针液的组成为：正向引物和反 向引物终浓度均为〇? 4 ymol/L，探针的终浓度为0? 12 ymol/L〇5. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括有：标准阳性质粒、缓冲 液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试纸条。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准质粒是以FMDV基因组cDNA 为模板，由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6扩增的核苷酸片段，与pEASY-Tj^体相连接后得 到的重组质粒。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，扩增的核苷酸片段的序列如SEQ ID NO. 7 所示。8. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，扩增的反应体系为50 y L :10XPCR Buffer II 5 y L、2. 5mM dNTP Mixture 8 y L、rTaq 0? 5 y L、cDNA 模板 2 y L，10 y mol/L 的 引物FMDV-F和FMDV-R各2 y L，灭菌超纯水加至50 y L。9. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，反应程序为94°C预变性3min，然后 94°〇2〇8,551：2〇8,721：2〇8,35个循环 ；721：延伸5111111，41：保存。10. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，每50 yL扩增体系中含有缓冲液 29. 5 y L、引物探针液4. 6 y L、无菌双蒸水12. 4 y L、待测样本cDNA或阳性对照分别为I y L 或空白对照I y L、反应驱动液2. 5 y L。
【专利摘要】本发明公开了一种用于通过RPA-侧流层析技术检测口蹄疫病毒的通用引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明还公开了用于口蹄疫病毒检测的试剂盒。采用本发明的引物和探针进行检测，仅需通过对临床样品进行病毒RNA的提取，以及一步法反转录成cDNA后进行等温扩增，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时间短等优点，适用于牛场快速、准确、简便的进行口蹄疫病毒的检测。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN104946795
【申请号】CN201510292514
【发明人】王洪梅, 何洪彬
【申请人】山东省农业科学院奶牛研究中心
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月1日