1、3DR1和探针3DP1组，7为3DF1、3DR1和探针3DP2组， 8为3DF2、3DR2和探针3DP3组；a为FMDV cDNA，b为阴性对照；
[0038] 图2RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏性试验，其中1为1X107TCID 5Q、2为 I X 106TCID5(I、3 为 I X 105TCID5(I、4 为 I X 104TCID5(I、5 为 I X 103TCID5(I、6 为 I X 102TCID5(I、7 为 10TCID5Q、8 为 5TCID50。。
[0039] 图3为RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性试验，其中1为O型口蹄疫病毒；2 为A型口蹄疫病毒；3为Asia 1型口蹄疫病毒；4为标准阳性质粒pEASY-T3-2B ;5为牛肠道 病毒；6为牛流热病毒；7为牛病毒性腹泻病毒；8为水疱性口炎病毒；9为牛传染性鼻气管 炎病毒；10为猪疱瘆病毒；11为猪瘟病毒；12为ddH 20。
[0040] 图4为RPA侧流层析检测试剂盒的灵敏度和重复性试验，口蹄疫病毒滴度为 5TCID 50〇
[0041] 图5为临床样本的RPA侧流层析检测试剂盒的检测结果，其中阳性样本1、4、9为 气溶胶收集液，2、3、7为流涎，5、6为水疱液，8、10、11为血液，12、13为血清，14、17为奶样， 15、18为鼻拭子样本，16为阳性质粒，19-22分别为阴性的气溶胶、血液、血清、奶样样本，23 为(IdH 2O0
【具体实施方式】
[0042] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解 释本发明，并不对其内容进行限定。
[0043] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044] TwistAmp nfo Kits 购自 TwistDX 公司，Genline Hybridetect-llateral flow strips购自Milenia GmbH(Germany)，反转录试剂盒（Code No. :D2639A)购自宝生物工程 (大连）有限公司，磁珠法提取病毒DNA/RNA试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司； 通用检测引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。
[0045] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的 《分子克隆：实验室手册》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2〇01)中所 述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
[0046] 实施例1 :阳性标准质粒的制备
[0047] 1.引物的设计与合成
[0048] 通过对GeneBank中口蹄疫病毒2B基因进行序列比对，确定保守区域，设计1对通 用引物，为序列表中的SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5,可对口蹄疫病毒7个血清型检测，扩增 出PCR片段，用于阳性标准质粒的构建；所有引物由上海生工生物技术有限公司合成。
[0049] 2. 口蹄疫病毒cDNA的制备
[0050] 参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，分别提取0型、A型、Asia 1型口蹄疫病毒 RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。
[0051] 3.阳性质粒的制备
[0052] 以上述方法制备的cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为50 μ L : 10 X PCR Buffer II(Mg2+Plus)5yL、2.5mM dNTP Mixture 8yL、rTaq 0.5 4 1^(5"以1^)、。0嫩模板 2 μ L，分别加入10 μ mol/L的引物FMDV-F和FMDV-R各2 μ L，灭菌超纯水加至50 μ L。反应 程序为 94°C预变性 3min，然后 94°C 20s，55°C 20s，72°C 20s，35 个循环；72°C延伸 5min，4°C 保存。
[0053] PCR扩增产物为1148bp，经1%琼脂糖凝胶电泳回收，克隆至pEAST-T3载体连接， 转化，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，用引物FMDV-F(SEQ ID No. 5)和FMDV-R(SEQ ID No. 6) 进行菌落PCR验证。将阳性重组菌摇菌培养，试剂盒提取质粒DNA，送交上海生工生物工程 有限公司测序，将测序正确（SEQ ID No. 7)的重组菌摇菌培养，试剂盒提取质粒DNA，获得阳 性质粒，将其命名为pEASY-T3-2B。
[0054] 实施例2 : 口蹄疫病毒RPA侧流层析试纸条检测方法的优化与建立
[0055] LRPA引物与探针的设计
[0056] RPA扩增的关键在于扩增引物和探针的设计。有关RPA引物和探针设计相关数据 少，目前尚无用于设计的软件或成熟的原则。PCR引物并不适用于RPA，RPA引物比一般PCR 引物长，约30-35个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度；而引物长 度增加容易形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增 加。因此，用于RPA扩增的引物需要经过大量的实验进行筛选与优化。
[0057] -般情况下引物、探针的设计需参考以下因素：（I)GC含量在40%~60% ; (2)尽 量避免引物内部出现二级结构；（3)避免引物出现重复序列。
[0058] RPA探针的长度一般46~52个碱基，尽量避免与引物重叠、形成异二聚体。探针 5'端标记FAM基团，中间THF替代G或C(dSpacer)，且dSpacer两侧尽量避免G、C，dSpacer 修饰与5'端至少30碱基，与3'端至少15碱基，3'端C3-Spacer修饰。
[0059] 本实施例针对口蹄疫病毒不同基因保守区设计了一系列的RPA引物与探针，具体 见表1。
[0060] 表1针对口蹄疫病毒不同基因保守区设计的RPA引物与探针
[0061]
[0062] 备注：@表示Biotin修饰；*表示FAM标记；阴影表示dSpacer，为THF替换碱基； &表不C3_spacer修饰。
[0063] 2.利用RPA扩增反应筛选引物和探针
[0064] 取IO7TCID5tl的口蹄疫病毒，试剂盒提取RNA，反转录cDNA，以cDNA为模板用于PRA 方法扩增口蹄疫病毒的不同基因序列。具体步骤：
[0065] (1)于离心管管底中分别加入各检测基因的上下游引物各2· 1μL(10μπι〇1/ L)，LF 探针 0· 6 μ L(10 μ mol/L)，缓冲液 29. 5 μ L，模板 cDNA 1 μ L，用 CldH2O 补足到体积 47. 5 μ L，吹打混匀；每对引物探针组均设立无菌双蒸水为阴性对照，模板cDNA为反转录的 原液。
[0066] (2)将47. 5 μ L缓冲液转移到含有冻干酶粉的0· 2mL TwistAmp nfo八联反应管 中，经移液器反复吹打直至完全溶解。
[0067] (3)向每个反应管液体内加入2. 5 μ L的醋酸镁（280mmol/L)溶液，混匀后反应即 刻发生。
[0068] (4)将反应管放入38 °C的恒温水浴锅中，处理4min。
[0069] (5)反应4min后，取出反应管，再次混匀后继续放入38°C的恒温水浴锅中反应 20min〇
[0070] (6)取检测管，在其中加入扩增产物I μ L和49 μ L的产物稀释液，混合均匀后，放 入检测试纸条，3~5min后，通过试纸条的显色进行判读。
[0071] 3.弓丨物和探针的筛选结果
[0072] 表1所示的引物探针组经RAP扩增后，经过试纸条检测，如图1所示，2B引物探针 组的检测组的RPA产物为阳性，试纸条在检测区和质控区出现条带，而阴性对照RPA产物在 检测区未出现条带，仅质控区出现条带。而其他引物探针组的检测组和阴性对照组RPA产 物均在检测区出现条带，通过将下游引物与相应的探针混合后进行试纸条检测，发现在检 测区出现阳性条带，表明这些引物探针组形成了引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现 阳性反应，因此，这些引物探针组不能应用于RPA的检测。
[0073] 4. RPA扩增反应体系的优化
[0074] 首先，将2B的引物、探针组按表2所示，进行RPA反应的引物和探针使用量的优 化，优化结果表明，2B的上下游引物各为2 μ L、探针为0. 6 μ L，效果较好。另外，还针对醋酸 镁溶液的使用量设置了 7个浓度梯度。在50 μ L RPA反应体系中加入浓度为280mM/ μ L醋 酸镁的量分别为〇 μ UO. 5 μ L、1 μ L、l. 5 μ L、2 μ L、2. 5 μ L和3 μ L，结果显示，醋酸镁用量 过少将导致扩增的失败，反应体系中加入1 μ L及以上醋酸镁可以得到的扩增产物，并且产 物随着醋酸镁量的增加而增加，但添加2. 5 μ L和3 μ L的醋酸镁差别不明显。最终确定反 应体系中加入2. 5 μ L醋酸镁溶液。
[0075] 经优化后的RPA反应体系为：上下游引物各2. 0 μ L (10 μ mol/L)，探针 0· 6 μ L (10 μ mol/L)，缓冲液 29. 5 μ L，模板 cDNA 1 μ L，ddH20 12. 4 μ L，将上述混合液加入 到含有冻干酶粉的〇.2mL TwistAmp nfo八联反应管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。 最后加入2. 5 yL的醋酸镁（280mmol/L)溶液启动反应。38°C 4min，混匀后，再38°C 20min。
[0076] 表2RPA反应引物和探针使用量组合优化表
[0078] 实施例3 : 口蹄疫病毒RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度、重复性、特异性检 测
[0079] I. RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度分析及重复性检测
[0080] 将滴度为107TCID5(I/100 μ L的口蹄疫病毒液用PBS进行10倍系列稀释后，应用试 剂盒提取病毒的RNA，反转录cDNA ;以优化的RPA条件，利用2Β引物探针组进行RPA扩增： 上下游引物各 2. 0