用于‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度鉴定的引物及方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定 ‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度的 SSR 分子标记组，SSR分子标记组由BOE456和BOE622组成。利用该分子标记组中的BOE456和BOE622的引物序列进行PCR验证，可对‘秋绿芥蓝’杂交种子和其母本、父本种子进行有效区分，快速、准确检测出杂交种子纯度。本方法具有快速、准确、低成本、操作简单等优点。
【专利说明】
用于‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度鉴定的引物及方法
技术领域
[0001]本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种用于‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度鉴定的引物及方法。
【背景技术】
[0002]芥蓝是起源于华南地区的一种特色叶菜，为甘蓝的一个变种。‘秋绿芥蓝’是以612早为母本(自交不亲和系)，Sb06F为父本育成的一代杂交种。具有生长势强，产量高，抗病抗逆型强的特点。是华南地区推广面积较多的品种。但是由于有限的亲本资源以及杂交品种的不断涌现，使得品种间，尤其是杂交品种之间的遗传差异越来越小，蔬菜种子的真实性与品种纯度鉴定也越来越难，加之‘秋绿芥蓝’是利用自交不亲和系配制而成的杂交一代，母本在制种过程中有少量的自交结实率，常常会出现假杂种，导致种子纯度下降，给生产造成巨大损失。为了避免这种损失，需要对种子的纯度和真伪进行鉴定。目前品种的纯度和真伪鉴定是以形态学标记为依据，这种鉴定方法虽然从农业生产角度具有稳定可靠的优点，但是在大规模检测中存在耗时较多，错误率较高的缺点，因而不利于大规模推广。
[0003]因此为了保证优良品种发产生最大的经济效益，因此一种快速、准确、有效的品种鉴定方法非常重要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于利用SSR分子标记技术提供一种用于快速、准确鉴定“秋绿芥蓝”杂交种子纯度的引物及方法。
[0005]本发明所采取的技术方案是:一种用于鉴定‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度的SSR分子标记组，SSR分子标记组由B0E456和B0E622组成。
[0006]优选的，SSR分子标记B0E456的引物对序列如下所示:
B0E456-F: 5’- GATGCTTTCGTTTCTGGTGATGG -3’(SEQ ID NO:3)
B0E456-R: 5’- TCTGATTGTGGCTGCTGGTATGTT-3’(SEQ ID NO:4)。
[0007]优选的，SSR分子标记B0E622的引物对序列如下所示:
B0E622-F: 5’- GTCTCGCTCGCCTAACACTT -3’ (SEQ ID NO:5)
B0E622-R: 5’- AGAGCGGGAGGAGGGATGGT -3’ (SEQ ID NO:6)。
[0008]—种用于‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度鉴定的方法，包括如下步骤:
1)提取芥蓝幼苗基因组DNA;
以芥蓝基因组DNA为模板，使用B0E456和/或B0E622的SSR引物进行PCR扩增；
2)对扩增的产物进行凝胶电泳；
对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株为杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种。
[0009]本发明的有益效果是:将‘秋绿芥蓝’杂交种子与其母本、父本种子区分开来，快速检测出杂交种子的纯度。本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
【附图说明】
[0010]图1为引物B0E456‘秋绿芥蓝’种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱(Pl:母本a ；P2:父本b:Fl为杂交一代种子)；
图2为引物B0E622‘秋绿芥蓝’种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，其中I孔为M，2孔父本，3孔母本，其它15株分别是杂交种的1-15个单株；
图3为‘秋绿芥蓝，商品种种植后取叶片DNA进行电泳跑胶的图片，其中I孔为Marker，2孔父本，3孔母本，其它20株分别是杂交种的1-20个单株，其中19株为假杂种。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0012]实施例1‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度检测方法的建立
1、筛选纯度鉴定的SSR引物。
[0013]从所公布的甘蓝SSR引物及EST-SSR引物在双亲间进行筛选，选出共显性差异标记条带的两对引物序列如下所示:
B0E456-F: 5’- GATGCTTTCGTTTCTGGTGATGG -3’(SEQ ID NO:3)
B0E456-R: 5’- TCTGATTGTGGCTGCTGGTATGTT-3’(SEQ ID NO:4)
B0E622-F: 5’- GTCTCGCTCGCCTAACACTT-3’(SEQ ID NO:5)
B0E622-R: 5’- AGAGCGGGAGGAGGGATGGT-3’(SEQ ID NO:6)
二种标记带型清晰、重复性好。引物能产生的母本特异性标记和的父本特异性标记。
[0014]2、利用上述特异性引物对‘秋绿芥蓝’杂交种子进行纯度鉴定。
[0015](I)芥蓝DNA的提取
实验材料为‘秋绿芥蓝’商品种及其母本、父本幼嫩真叶DNA ο步骤如下:
①用液氮在2ml的离心管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入100yL 2%CTAB提取缓冲液，混匀后置于65°C水浴中温浴50min(每隔5min摇动一次)。
[0016]②静置至室温后在4°C下12000rpm离心lOmin，将上清(约800yL)转移到新的2ml离心管。
[0017]③加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),颠倒混匀，静置3_5分钟，在4°C下12000rpm离心lOmin，将上清液转入新的1.5mI离心管中。
[0018]④加2/3体积340yL预冷的异丙醇，缓慢混匀(缓慢颠倒20次)，置于一20°C下培养30mino
[0019]⑤在4°C下13000rpm离心10111；!_11，弃上清，加入200-30(^1^预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀(两次)，微干。
[0020]⑥加入10yL无菌水溶解。
[0021](2)SSR-PCR 扩增:
PCR 体系(20yL)
DNA 模板:5ng引物-F:0.25 mmol.L—1引物-R:0.25 mmol.L—1dNTP^^mmol-r1Mg2+:0.15mmo1.L—11XPCR buffe: 2.0yLTaq酶:0.2UddH20补足至20yLPCR扩增程序
94°C预变性5min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，35个循环后，72°C保持7min，然后置于4°C保存待检测。
[0022](3)凝胶电泳
扩增产物在双垂直非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120V稳压1.5个小时，电泳结束后进行0.l%AgN03银染15min ；银染后用2%Na0H、0.4%甲醛、0.04%Na2C03显色，显色后在灯箱上拍照分析。
[0023](4)扩增结果
两种引物在‘秋绿芥蓝’父母本及杂交种子分别能扩增出两条特异带;其中B0E456引物母本Pl扩增出的a条带，母本p2号扩增出b的条带(见图1);B0E622引物扩增出来的条带如图2所示。
[0024]回收B0E456引物扩增出来的特异条带，送上海生物工程有限公司测序。条带的序列如SEQ ID NO: 1-2所示，杂交种子中与父本、母本扩增产物的序列相符。
[0025]实施例2检测准确度验证
采用实施例1的方法对从白云基地的种子纯度鉴定田取的100株‘秋绿芥蓝’，对其单株编号，提取单株DNA进行检测(部分电泳图见图3)，种子纯度为99%，与田间调查结果一致，准确率为100%。
[0026]以上实施例表明，本发明的方法可将‘秋绿芥蓝’杂交种子与其父母本种子进行有效区分，快速、准确检测出种子纯度。并且选取任何一个引物均能准确鉴别。
【主权项】
1.一种用于鉴定‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度的SSR分子标记组，SSR分子标记组由B0E456和B0E622组成，SSR分子标记B0E456包括母本612早和父本Sb06F，其母本612早的核苷酸序列如SEQ ID勵:1所示，父本51306?的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，SSR分子标记 B0E622可由引物对:B0E622-F:5’_ GTCTCGCTCGCCTAACACTT -3 ’ 和 B0E622-R: 5’-AGAGCGGGAGGAGGGATGGT -3 ’ 扩增得到。2.—种用于鉴定‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度的引物组，由用于扩增SSR分子标记B0E456的弓I物对和用于扩增SSR分子标记B0E622的弓I物对共同组成。3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于:SSR分子标记B0E456的引物对序列如下所示: B0E456-F: 5’- GATGCTTTCGTTTCTGGTGATGG -3’(SEQ ID NO:3) B0E456-R: 5’- TCTGATTGTGGCTGCTGGTATGTT-3’(SEQ ID NO:4)。4.根据权利要求2或3所述的引物组，其特征在于:SSR分子标记B0E622的引物对序列如下所示: B0E622-F: 5’- GTCTCGCTCGCCTAACACTT -3’ (SEQ ID NO:5) B0E622-R: 5’- AGAGCGGGAGGAGGGATGGT -3’ (SEQ ID NO:6)。5.—种用于‘秋绿芥蓝’杂交种子纯度鉴定的方法，包括如下步骤: 提取芥蓝幼苗基因组DNA; 以芥蓝基因组DNA为模板，使用权利要求3和/或4所述的SSR引物进行PCR扩增； 对扩增的产物进行凝胶电泳； 对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株为杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种。
【文档编号】C12Q1/68GK106011280SQ201610578398
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】陈汉才, 李桂花, 王亭亭, 张艳, 黎庭耀
【申请人】广东省农业科学院蔬菜研究所