人胃肠肿瘤中piezo2基因的检测试剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了人胃肠肿瘤中PIEZO2基因的检测试剂，该检测试剂为一对特异性引物，其上游引物的核苷酸序列为GGAGTTAGGC GGGAGTATAG TAC，下游引物的核苷酸序列为：TTCTTCAAAA ATAACTAATA CCGAA；该检测试剂针对人胃肠肿瘤中PIEZO2基因，PIEZO2基因目前与肿瘤的关系尚不清楚，但我们发现在胃肠肿瘤中，癌变组织与癌旁组织之间PIEZO2基因在荧光定量甲基化检测中PIEZO2基因甲基化程度不同，癌变组织PIEZO2基因甲基化程度明显高于癌旁组织，该检测试剂具有检测灵活快速，简单方便，针对性强，准确可靠、效率高，经济节约的优点，有利于结直肠癌和胃癌的早期发现和及时治疗。
【专利说明】
人胃肠肿瘤中P/fZ 口 2基因的检测试剂
技术领域
[0001] 本发明设及消化系统肿瘤的检测试剂，具体设及人胃肠肿瘤中基因的 检测试剂。
【背景技术】
[0002] 消化系统肿瘤中主要是恶性胃癌和结直肠癌，在所有消化系统恶性肿瘤死亡病例 中，约有一半的患者死于胃癌，结直肠癌近年来的发病率有明显上升趋势。现用于诊断消化 系统中恶性肿瘤的方法主要包括消化内镜检查，影像学检查，生化和免疫学检查及基因诊 断。免疫学检查中胃癌的标记物主要有〔4199、〔64、〔4242、〔4125、4。？、肥5等，结直肠癌的标 记物主要有CA19-9、CEA、P53、K-ras等。基因诊断是近年来兴起的检测技术，具有快速、特异 和灵敏的优点，如授权公告号为CN102787174的发明专利，就公开了针对与胃肠肿瘤相关折 抑癌基因 CPG表观突变的检测试剂，其中用25对引物测序CPG基因的启动子区，基因启动子 区域高甲基化可导致抑癌基因表达沉默，致使肿瘤的发生，从而确认胃肠肿瘤。但该发明专 利需要对胃肠肿瘤DNA进行25对引物的PCR检测，检测时间长，检测过程复杂，延缓了病患的 确诊和救治时间。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种人胃肠肿瘤中P 基因的检测 试剂，该检测试剂具有检测灵活快速，简单方便，针对性强的优点。
[0004] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:人胃肠肿瘤中基因 的检测试剂，该检测试剂为一对特异性引物，该对特异性引物核巧酸序列如下： 上游引物的核巧酸序列为:5 ' - GGAGTTAGGC GGGAGTATAG TAC -3 '， 下游引物的核巧酸序列为:5'- TTCTTCAAAA ATAACTAATA CCGAA -3'。
[0005] 与现有技术相比，本发明的优点在于人胃肠肿瘤中P / i?之0 基因的检测试 剂，该检测试剂为一对特异性引物，其上游引物的核巧酸序列为GGAGTTAGGC GGGAGTATAG TAC，下游引物的核巧酸序列为:TTCTTCAAAA ATAACTAATA CCGAA;该检测试剂针对人胃肠肿 瘤中P/i?スOJ?基因，户/i?スOJ?基因目前与肿瘤的关系尚不清楚，但我们发现在胃 肠肿瘤中，癌变组织与癌旁组织之间P /i?之0 基因在巧光定量甲基化检测中 户/ i?之0 基因甲基化程度不同，癌变组织P / i?之0 基因甲基化程度明显高于癌旁 组织，该检测试剂具有检测灵活快速，简单方便，针对性强，准确可靠、效率高，经济节约的 优点，有利于结直肠癌和胃癌的早期发现和及时治疗。
【具体实施方式】
[0006] W下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0007] 实施例1 人胃肠肿瘤中P / i?之0 基因的检测试剂，该检测试剂为一对特异性引物，其上 游引物的核巧酸序列为：5'- GGAGTTAGGC GGGAGTATAG TAC -3'，下游引物的核巧酸序列 为：5'- TTCTTCAAAA ATAACTAATA CCGAA -3'。是针对P /怎之0 ^基因的启动子区域设 计的巧光定量甲基化特异性扩增上游引物和巧光定量甲基化特异性扩增下游引物，经过我 们大量筛选施验确认得到，引物由上海生功生物工程股份有限公司合成。
[000引实施例2 利用实施例1的一对引物进行病例检测，具体检测过程如下： 1、DNA提取:我们从宁波第Ξ人民医院采集5例胃癌石蜡样本和对应的癌旁组织石蜡样 本，用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(购于Qiagen, Hilden，德国）DNA提取试剂盒提取DNA 样本，我们从宁波第Ξ人民医院采集5例结直肠癌石蜡样本和对应的癌旁组织石蜡样本，同 样提取，得到DNA样本，DNA样本要求DNA的吸光度(A)的比值(A260/A280)约为1.80。
[0009] 2、DNA样本甲基化:采用EZ DNA甲基化试剂盒（购于幻mo公司，美国）对样本DNA进 行亚硫酸氨盐转化，用重亚硫酸盐处理DNA样品后，可使发生甲基化的胞喀晚(C)碱基保持 不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿喀晚（U)，然后通过巧光定量进行PCR反应，测序 户/ ^之0 ^基因甲基化率。
[0010] 3、PCR反应：取DNA样本1.6ul加入到lOul SYBR Green混合液（购于Roche公司， 美国）中，再加入6.8ul无 DNA和RNA酶水，并加入上述一对P ^基因的特异性 扩增引物，进行巧光定量PCR甲基化扩增；所采用的巧光定量甲基化程序为：首先95Γ lOmin的变性;接着95°C 20s，59°C 30s，72°C 30s，共45个循环的退火反应;反应完成后是 95°C Imin，59°C 30s，95°C 80s进入烙解曲线分析，判断产物的特异性。
[00川 4、完毕后，利用2-AG巧法分析各样本户/怎之口之基因甲基化程度，其中ACT = CT C訂W -CT心rs-CT阳性对照，^ C Γ公（管家基因，购于上海生功生物工程股份有限公司）、 阳性对照（甲基化标准品DNA，购于幻mo公司）的检测同步骤2、3，采用SPSS 16.0对数据进行 整理分析，我们发现：结直肠癌变组织与癌旁组织之间，胃癌癌变组织与癌旁组织之间的 DNA甲基化水平均存在显著差异如表1。
[0012]表1:癌变组织基因与癌旁组织基因甲基化率比较表
' 从表1中可W看出，在胃癌和结直肠癌病症患者中，通过P / i?之0 基因的检测试' 剂检测，其癌变组织的甲基化率明显高于癌旁组织。
【主权项】
1.人胃肠肿瘤中2基因的检测试剂，该检测试剂为一对特异性引物，其特征 在于该对特异性引物核苷酸序列如下： 上游引物的核苷酸序列为：GGAGTTAGGC GGGAGTATAG TAC， 下游引物的核苷酸序列为：TTCTTCAAAA ATAACTAATA CCGAA。
【文档编号】C12N15/11GK106011278SQ201610564373
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月18日
【发明人】叶孟, 李锦芸, 周重昌, 倪超, 杨平, 陈思, 毕旭儿
【申请人】宁波大学医学院附属医院