一种用于快速检测咖啡驼孢锈菌的引物对、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于快速检测咖啡驼孢锈菌的引物对，其序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。本发明还提供了一种包含上述引物对的用于快速检测咖啡驼孢锈菌的试剂盒，以及使用上述引物对进行快速检测咖啡驼孢锈菌的方法。使用本发明的引物对可以在待测样品浓度达10pg时成功检测出咖啡驼孢锈菌，具有较高的灵敏性，符合日常检测的要求。同时，通过本发明的检测引物可以缩短对咖啡驼孢锈菌进行鉴定的时间，较快地鉴定出咖啡驼孢锈菌，从而克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长等问题。使用本发明的引物对进行检测，具有灵敏度高、特异性强的特点，且本发明的检测方法具有高效、快速和敏感度高的优点。
【专利说明】
-种用于快速检测咖啡驼抱诱菌的引物对、试剂盒及检测 方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体而言，本发明设及一种用于快速检测咖啡驼抱诱 菌化emileia vastatrix)的引物对、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 咖啡为茜草科（Rubiaceae)咖啡属（Coffea)植物（Bridson and Verdcou;rt, 1988)。在世界Ξ大饮料作物（咖啡、茶叶、可可）中，咖啡其产量、产值及消费量均居Ξ大饮 料作物之冠。咖啡驼抱诱菌是一种专性寄生病原菌，侵染咖啡叶部（Muthappa，1975; ￥曰116旨曰曰11(1化1曰阿99曰，1964;化曰161曰1.，2000)，引起咖啡叶部黄诱病。在适宜的气候 条件下，该病可^导致叶片损失最多可达50%，浆果损失可高达70%(0日1巾日311?1111日1115， and Rajana化a. ,2009)。该病害于1869年首次于印度报道。随后，该病害在斯里兰卡与印度 尼西亚大量发生，给当地小粒咖啡造成毁灭性的灾害。历史上由于该病的出现，使得斯里兰 卡咖啡年产量由最初的42百万公斤急剧下降至3百万公斤，W致于到1890年，几乎所有的咖 啡种植园被废弃(Alwora GO.and Gichuru邸.，2014)。目前，在该国茶已替代了咖啡大面 积种植。总之，在短短不到28年的时间内，该国的咖啡出口贸易已不复存在。近年来，咖啡叶 诱病袭击了拉下美洲的咖啡庄园，造成农民约10亿美元的经济损失并使整个中美洲咖啡产 量减少了一半。目前我国咖啡主产区主要分布在云南与海南两省。近年我国咖啡产业发展 迅速。仅2014年，我国咖啡种植面积达到12.86万hm2，年产咖啡豆12.6万吨，均创历史新高。 然而，由咖啡驼抱诱菌化emileia vastatrix)引起的咖啡黄诱病是我国咖啡种植区最严重 的毁灭性病害，严重威胁我国咖啡产业的稳定、健康、安全发展。
[0003] -直W来，咖啡诱菌的检测与鉴定，依赖常规的形态学并结合传统的鉴别寄主法。 该方法需经过病原菌的分离(获得)一形态鉴定一回接与再分离等过程，同时需要具备专业 的分类学知识W及丰富的经验。可见，其结果的准确性和可信度易受外界因素的影响，难W 满足快速、高通量鉴定与检测的实际需求。事实上，即使是在适宜的气候条件下，咖啡驼抱 诱菌从侵入到轻微显症大约需要20到30天(Silva MC et al. ,2006)，简而言之，利用传统 的鉴定方法耗时费力。
[0004] 近年来随着分子生物学技术的发展，WPCR技术为代表的分子检测方法得到了迅 速地发展和应用。运类方法普遍具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特 点，现已广泛应用于动植物病害检测及其病原菌鉴定等方面。然而，在咖啡驼抱诱菌检测方 面，国内还未见有简单易行、准确、灵敏的分子检测技术。因此，有必要研发一种能快速、准 确检测咖啡驼抱诱菌的现代分子诊断与检测技术。显然，咖啡驼抱诱菌的快速诊断与检测 技术，将有助于了解我国咖啡诱菌的群体分布，进而对咖啡诱病的及时、有效预测与防治等 方面具有十分重要的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，为了快速、准确地鉴定咖啡诱病病原 菌，本发明提供一对咖啡驼抱诱菌化emileia vastatrix)特异性分子检测引物W及特异性 强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的咖啡驼抱诱菌的快速分子检测方法。
[0006] 本发明的第一个方面是提供一种用于快速检测咖啡驼抱诱菌的引物对，其特征在 于，所述引物对中的上游引物的序列如SEQIDNOa所示，下游引物的序列如SEQIDN0:2所示。 具体地，所述引物对的序列如下所示：
[0007] 上游引物:GGTACACCTGTTTGAGAGTATG(SEQIDNO: 1);
[000引 下游引物：〔4444了4了61^4了40：1'(：1^41'1'(：1'(56910^:2)。
[0009] 本发明的第二个方面是提供一种用于快速检测咖啡驼抱诱菌的试剂盒，其包含本 发明的第一个方面所述的引物对。即本发明的第二个方面的试剂盒中包含具有SEQIDNOa 和SEQIDN0:2所示的核巧酸序列的引物对。
[0010] 本发明的第Ξ个方面是提供如第一个方面所述的引物对或本发明第二个方面所 述的试剂盒在快速检测咖啡驼抱诱菌中的应用。
[0011] 本发明的第四个方面是提供一种用于快速检测咖啡驼抱诱菌的方法，该方法包括 使用本发明第一个方面所述的引物对或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物对进 行PCR扩增的步骤。
[0012] 进一步地，所述方法包括W下步骤：
[0013] 步骤1，从样品中提取DNA;
[0014] 步骤2,用第一个方面所述的引物对或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引 物对进行PCR扩增，得到扩增产物；
[001引步骤3,检测扩增产物，并作出判断。
[0016] 本发明中，提取待测样品的基因组DNA的方法不受特别限制，可W采用任何已知的 基因组DNA提取方法或试剂盒进行。
[0017] 本发明中，将所述待测样品的基因组DNA进行PCR扩增的条件不受特别限制。根据 本发明的一些具体示例，所述的PCR扩增的反应体系为：ddH2〇 14.2μ1; 1〇x民(S的丹 Buffer 化l;2.5mM dNTPs 1.6μ1;10μΜ的上游引物0.5μ1;10μΜ的下游引物0.5μ1; Easyrag?DNA化lymerase 0.2μ1; 20ngAU的DNA模板化1。所述PCR扩增的反应条件为：94 °C 3分钟;94°C 30秒，62 °C 30秒，72 °C 1分钟，35个循环;72 °C 5分钟。由此，能够快速、高效、准 确地扩增，便于后续步骤的进行。
[0018] 本发明中，对所述PCR扩增产物进行检测的方法不受特别限制，只要能够有效获得 PCR扩增产物的大致的碱基对数目即可。根据本发明的一些具体示例，通过凝胶电泳获得大 致的碱基对数目。由此，能够高通量、快速、高效、准确地获得检测结果。
[0019] 本发明中，步骤3中若检测出现396bp左右的特异性条带则判断为检出咖啡驼抱诱 困。
[0020] 本发明的引物对是根据4个自测咖啡驼抱诱菌菌株ITS序列（SEQIDN0:3) W及NCBI 网站化ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)所有咖啡驼抱诱菌Hemileiavas1:at;rixITS基因 序列化F394118~EF394132.1、DQ022191)与其它高同源性的口S序列（Chrysomyxa empetri、Cronartium quercuum、Endocronartium harknessii、Cronartium quercuum f.sp.banksianae、Puccinia andropogonis var.onobrychidis、Aecidium guatteriae、 Cronartium comandrae、Cronartium strobilinum、Puccinia porri、Melampsoridium hiratsukanum、Melampsoridium betulinum、Melampsoridium alni、Puccinia allii、 Cronartium coleosporioides、Chrysomyxa chiogenis、Pucciniastrum boehmeriae、 Pucciniastrum actinidiae、 Pucciniastrum miyabeanum、Pucciniastrum hikosanense、 Pucciniastrum kusanoi)之间的差异位点区域设计得到的。
[0021] 使用本发明的引物对可W在待测样品浓度达lOpg时成功检测出咖啡驼抱诱菌，具 有较高的灵敏性，符合日常检测的要求。同时，通过本发明的检测引物可W缩短对咖啡驼抱 诱菌进行鉴定的时间，较快地鉴定出咖啡驼抱诱菌，从而克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定 周期长等问题。使用本发明的引物对进行检测，具有灵敏度高、特异性强的特点，且本发明 的检测方法具有高效、快速和敏感度高的优点。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明提供的引物对特异性检测的结果:M为化2000marker;l为d地2〇阴性 对照；2~5为分离自我国不同地区的咖啡驼抱诱菌；6为咖啡炭痘病菌Col letotrichum gloeosporioides;7为咖啡诱菌重寄生菌;8为咖啡叶斑病菌;9为鸡蛋花诱菌；10~13分别 为甘薦赤腐病菌、黑穗病菌、环斑病菌、W及剑麻斑马纹病菌。
[0023] 图2为本发明提供的引物对灵敏性检测的结果:M为化2000marker;l~7分别是W 浓度分别为10，1，1〇-1，1〇-2，1〇-3，ΙΟΛ l〇-5ng/化咖啡驼抱诱菌基因组DNA为模板的PCR扩增 产物。
[0024] 图3为本发明提供的引物对检测发病咖啡叶片中驼抱诱菌的结果：Μ为 化2000marker; 1为空白对照，Wd地2〇为模板;2阳性对照，模板为咖啡诱菌DNA; 3~4为阴性 对照，PCR模板为健康咖啡嫩叶DNA，5为已发病咖啡叶片中DNA为模板的扩增结果。
【具体实施方式】
[0025] 下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进步一步的说明，W更好地理解本 发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者 按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市购获得的常规 产品。
[00%] 实施例1
[0027] 1、引物设计：
[002引根据4个实验室测得咖啡驼抱诱菌菌株口 S序列(SEQIDN0:3)与NCBI网站化ttp://WWW.ncbi .nlm.nih.gov/)所有咖啡驼抱诱菌Hemileia vas1:at;rix ITS基因序列巧F394118 ~EF394132.1、DQ022191.1)W及其它高同源性口S序列（C虹ysomyxa empetri、吐011日的1皿 quercuum^Endocronartium harknessii >Cronartium quercuum f.sp.banksianae、 Puccinia andropogonis var.onobrychidis、Aecidium guatteriae、Cronartium comandrae、Cronartium strobilinum、Puccinia porri、Melampsoridium hiratsukanum、 Melampsoridium betulinum、Melampsoridium alni、Puccinia allii、Cronartium coleosporioides、Chrysomyxa chiogenis、Pucciniastrum boehmeriae、Pucciniastrum actinidiae、Pucciniastrum miyabeanum、Pucciniastrum hikosanense、Pucciniastrum kusanoi)之间的差异位点区域，设计咖啡驼抱诱菌的特异性引物，即为本发明的引物对Hv- ITS-F/R，具体为：上游正向引物Hv-ITS-F序列：5 ' -GGTACACCTGTTTGAGAGTATG-3 ' ；下游反向 引物Hv-ITS-R序列：5 ' -CAAAATATGTCATACCTCTCATTCT-3 '。
[0029] 2、引物合成
[0030] 将设计好的上游引物Hv-ITS-F(5 '-GGTACACCTGTTTGAGAGTATG-3 '）与下游引物狀- 1了5-3(5'-〔4444了4了6^4了40：1'(：1'〔41'1'(：1'-3'），委托上海立菲生物技术有限公司（广州）合 成。
[0031] 实施例2:引物对Hv-ITS-F/R检测咖啡驼抱诱菌的特异性
[0032] 用W下菌株验证引物的特异性:4株分离自我国不同地区（云南麻栗坡县1株、云南 瑞丽1株、云南芒市2株)的咖啡驼抱诱菌，1株咖啡炭痘病菌，1株咖啡诱菌重寄生菌，1株咖 啡叶斑病菌；1株鸡蛋花诱菌，W及甘薦赤腐病菌、黑穗病菌、环斑病菌、剑麻斑马纹病菌株 各1株。
[0033] 采用真菌DNA提取试剂盒化.Z.N.A Fungal DNA kit, Omega公司，美国）提取上述 菌株的DNA，其中，咖啡驼抱诱菌与鸡蛋花诱菌直接用其夏抱子(采集已严重发诱病叶片，于 实验室利用接种刀片刮下其表面附着的夏抱子堆而得到)提取DNA，其它菌株则采用菌丝体 提取。
[0034] 采用引物对Hv-ITS-F/R进行PCR扩增验证实验，Wdd出0为阴性对照。
[0035] 其中，PCR扩增的反应体系如下： 加地0: 14.2 μΙ 10^EasyTaq ? Buffer： 2 μΙ 2.5 mM dNTPs 1.6 μΙ
[0036] SEQIDN0.1 (10 μΜ)： 0.5 μΙ SEaiDND.2 ΠΟμΜ)： 0.5 μ I EasyTaq ? DNAPolymerase 0 2 μΙ DMA 撲般（2Qng/pl>; 1 μΙ
[0037] PCR扩增的反应条件为:94 °C 3分钟；94 °C 30秒，62 °C 30秒，72 °C 1分钟，35个循环;72 °C5分钟;15°C保存。
[003引PCR扩增产物用质量百分比浓度为1 %琼脂糖凝胶电泳分析，电泳条件为160V， 25min。具体结果如图1。如图1所示，试验结果与设计分析的相吻合，引物对Hv-ITS-F/R仅能 从咖啡驼抱诱菌DNA中扩增出一条396bp特异性条带，从其它菌株中均扩增不到任何条带， 表明引物对Hv-ITS-F/R可特异性地检测咖啡驼抱诱菌。
[0039] 实施例3:引物对Hv-ITS-F/R检测咖啡驼抱诱菌的灵敏性
[0040] 将咖啡驼抱诱菌菌株基因组DNA浓度调整为lOngAiL，按10的数量级逐步向下稀释 至l(T5ngAiL作为模板，进行PCR扩增。PCR体系和反应程序与实施例2相同，PCR产物用1.0 % 的琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图2。如图2所示，当咖啡驼抱诱菌的DNA浓度大于或等于 lOpg时，利用引物对Hv-ITS-F/R可W特异性的扩增得到39化P的DNA条带，但当浓度小于 lOpg后，则扩增不到条带，由此表明，该引物对可W检测到咖啡驼抱诱菌基因组DM浓度> lOpg。
[0041 ] 实施例4:引物对Hv-ITS-F/R检测发病咖啡叶片中咖啡驼抱诱菌的结果
[0042] 切取病健交界处组织块，采用CTAB法提取发病组织和健康植株叶片的基因组DNA， W引物对Hv-ITS-F/R进行PCR扩增实验。结果表明，Hv-ITS-F/R能够在由咖啡驼抱诱菌引起 的咖啡叶片组织DNA中检测到咖啡驼抱诱菌的存在(图3)，表明该引物对可W应用到咖啡驼 抱诱菌检测中。
[0043] W上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于W上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种用于快速检测咖啡驼孢锈菌的引物对，其特征在于，所述引物对中的上游引物 的序列如SEQIDMM所示，下游引物的序列如SEQIDN0:2所示。2. -种用于快速检测咖啡驼孢锈菌的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的引 物对。3. 如权利要求1所述的引物对、或权利要求2所述的试剂盒在快速检测咖啡驼孢锈菌中 的应用。4. 一种用于快速检测咖啡驼孢锈菌的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的引 物对、或者权利要求2所述的试剂盒中的引物对进行PCR扩增的步骤。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1，从样品中提取DNA; 步骤2,用权利要求1所述的引物对、或者权利要求2所述的试剂盒中的引物对进行PCR 扩增，得到扩增产物； 步骤3，检测扩增产物，并作出判断。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为:CldH2O 14.2 2μ1;2·5πιΜ dNTPs 1·6μ1;10μΜ的上游引物0·5μ1;10μΜ的下游引 物Ο.δμ I ; EasyTag?DNA Polymerase 0·2μ1; 2OngAU的DNA模板ΙμL 〇7. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94°C 3分 钟;94 °C 30秒，62 °C 30秒，72 °C 1分钟，35个循环;72 °C 5分钟。8. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤3中若检测出现396bp左右的特异 性条带则判断为检出咖啡驼孢锈菌。
【文档编号】C12Q1/04GK106011277SQ201610562128
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月18日
【发明人】吴伟怀, 易克贤, 贺春萍, 习金根, 郑金龙, 梁艳琼, 郑肖兰, 李锐, 邓彪龙
【申请人】中国热带农业科学院环境与植物保护研究所