一套用于沙门氏菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一套生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一套用于沙门氏菌检测 的多核苷酸、方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 随着社会的进步和人民生活水平的提高，食品安全已经成为一个全球关注的焦点 问题，由各种食源性病原微生物引起的食物中毒事件，越来越多地引起专家和各国政府的 关注。及时有效地检测和确定致病菌成为食源性疾病预防和治疗的关键。沙门氏菌是一种 重要的食源性致病菌，由沙门氏菌引起的食物中毒事件在世界各国频频报道。2007年2月， 美国发生的"花生酱事件"，2005~2006年间，美国发生的"番茄事件"均是因沙门氏菌引 发。2006年卢森堡公国，沙门氏菌引起133人食物中毒，1人死亡。2005年6~10月之间， 澳大利亚塔斯马尼亚州爆发了5次沙门氏菌引起的食物中毒，感染125人。2005年法国因 牛奶引起的沙门氏菌中毒事件，同时感染100多婴儿。1990~2003年间西班牙加泰罗尼亚 地区，共爆发1078次食物中毒，其中因沙门氏菌引起为871次，14695人感染，1534人住院 治疗，4人死亡，所占比例高达80.8%。在我国，细菌性食物中毒中有70%~80%是由沙门 氏菌引起的，以沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首位。由上可见，食品行业沙 门氏菌的检测尤为重要。
[0003]现有沙门氏菌检测方法主要为生化鉴定和PCR相关方法。生化鉴定方法耗时耗 力，而PCR方法和荧光定量PCR方法具有快速准确、敏感性强的特点，其中实时荧光定量PCR 以其特异性强、灵敏度高、速度快，在沙门氏菌检测中得到广泛应用。
[0004]质粒DNA标准物质是一套含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在 PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定 量分析的标准曲线。目前质粒DNA分子作为基因检测的标准物质得到了越来越多的深入研 究和应用，但是针对沙门氏菌实时荧光PCR检测方法的质粒DNA标准物质还是空白。在实 际沙门氏菌实时荧光PCR时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品， 其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确 度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一套适用于沙门氏菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准 分子及其应用。
[0006]本发明的另一目的是提供一套适用于沙门氏菌实时荧光定量PCR检测的质粒标 准分子及其应用。
[0007]本发明的第一方面，提供了一套分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含沙门氏菌编 码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的irwA基因序列和/或沙门氏菌编码鞭毛抗原的sefA基 因序列。
[0008] 在另一优选例中，所述沙门氏菌invA基因基因序列选自下组：
[0009] (a)序列如SEQIDN0.:1所示的多核苷酸序列；
[0010] (b)核苷酸序列与SEQIDNO. : 1所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0011] (C)序列与SEQIDN0. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQID NO. :1所示序列长度的20% -100% (较佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0012] (d)与（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
[0013] 在另一优选例中，所述沙门氏菌的sefA基因基因序列选自下组：
[0014] (a)序列如SEQIDN0. : 3所示的多核苷酸序列；
[0015] (b)核苷酸序列与SEQIDN0. :3所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0016] (c)序列与SEQIDN0. : 3所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQID NO. : 3所示序列长度的20% -100% (较佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0017] (d)与（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
[0018] 在另一优选例中，所述多核苷酸含有沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白 的invA基因序列和沙门氏菌编码鞭毛抗原的sefA基因序列，以及任选地连接两种基因序 列的接头序列。
[0019] 在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO. : 1所示。
[0020] 在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQIDN0. :3所示。
[0021] 本发明的第二方面，提供了一套分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本发明 第一方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。
[0022] 在另一优选例中，所述DNA构建物中包含沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面 蛋白的invA基因序列和沙门氏菌编码鞭毛抗原的sefA基因序列。
[0023] 在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。
[0024] 在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。
[0025] 在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为沙门氏菌检测的标准分子（质粒标 准分子）。
[0026] 在另一优选例中，所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pUC19,pUC18， pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。
[0027] 在另一优选例中，所述质粒的序列如SEQIDNO:2或4所示。
[0028] 本发明的第三方面，提供了一套试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方面所述 的多核苷酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物。
[0029] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述引物对特异性扩增沙门氏菌 编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的invA基因序列。
[0030] 在另一优选例中，特异性扩增沙门氏菌invA基因序列的所述的引物对选自下组：
[0031]SEQIDN0. :5 和SEQIDN0. :6 所示的引物对；
[0032]SEQIDN0. :7 和SEQIDN0. :8 所示的引物对；
[0033]SEQIDNO. :9 和SEQIDNO. : 10 所示的引物对；和
[0034]SEQIDNO. : 11 和SEQIDNO. : 12 所示的引物对。
[0035] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述引物对特异性扩增沙门氏菌 编码鞭毛抗原的sefA基因序列。
[0036] 在另一优选例中，特异性扩增沙门氏菌的sefA基因序列的引物对选自下组：
[0037]SEQIDN0. : 14 和SEQIDN0. : 15 所示的引物对；
[0038]SEQIDN0. : 16 和SEQIDN0. : 17 所示的引物对；和
[0039]SEQIDN0. : 18 和SEQIDN0. : 19 所示的引物对。
[0040] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列，所述探针序列如SEQ IDN0. : 13 所示。
[0041] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列，所述探针序列如SEQ IDΝα: 20 所示。
[0042] 本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的多核苷酸、本发明第二方面 所述的DNA构建物、或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于沙门氏菌的 检测。
[0043] 在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的。
[0044] 在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。
[0045] 本发明的第五方面，提供了一套沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法，所采用的 标准物质是如本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第二方面所述的DNA构建物。
[0046] 本发明的第六方面，提供了一套多核苷酸产品，所述产品包括：
[0047] (i)沙门氏菌标准品，所述的标准品选自：本发明第一方面所述的多核苷酸或者 本发明第二方面所述的DNA构建物；
[0048](ii)特异性扩增沙门氏菌序列的引物对，所述引物对为：
[0049]SEQIDN0. :5和SEQIDN0. :6所示的序列构成的引物对；和/或
[0050]SEQIDN0. : 14和SEQIDN0. : 15所示的序列构成的引物对。
[0051]在另一优选例中，所述的产品为多核苷酸的组合（combination)，较佳地所述组分 ⑴和（ii)是各自独立的。
[0052] 在另一优选例中，所述的产品为试剂盒形式。
[0053] 本发明的第七方面，提供了一套沙门氏菌的质粒标准分子的制备方法，包括以下 步骤：
[0054] ①人工合成沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的in