检测食品中沙门氏菌的有扩增内标的pcr方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测食品中沙门氏菌的有扩增内标的 PCR方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌引起的沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，是 常见、多发、危害较大的细菌性食源性疾病。一些国家沙门氏菌引起的食源性疾病占细菌性 食源性疾病总数的40% -60%。我国每年都有很多沙门氏菌引起的食源性疾病的发生，严 重地危害人民群众的食品安全与身体健康。沙门氏菌除可感染人外，还可感染很多动物。人 畜感染后均可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死性疾病，它可能加重病态 或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力，造成极大的经济损失。因此，沙门氏菌在食品安全 上具有非常重要的地位，受到普遍的重视。
[0003] 目前，沙门氏菌检测方法主要有培养法、实时荧光定量PCR(real-timePCR)方法、 环介导等温扩增技术（Loopnediatedisothermalamplification，LAMP)方法和酶联免疫 吸附方法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA)等。目前，沙门氏菌的国家标准检 测方法（GB4789. 4-2010)是培养法，培养法采集样品后，先增菌培养8-18h，再用不同的培 养基进行增菌培养，再挑取可疑菌落进行生化鉴定或者运用全自动微生物生化鉴定系统进 行鉴定；其缺点是：培养周期长，需要60h以上，费时费力，而且对于仍然具有致病性的"活 的非可培养状态"（ViableButNon-Culturable，VBNC)的细菌敏感性较低，可导致检测结 果呈假阴性，尤其是冷冻食品假阴性率非常高，造成极大的食品安全隐患。Real-timePCR 方法和全自动微生物生化鉴定系统所用试剂和仪器都较昂贵，而且对操作人员的要求较 高，尤其对于大批量样品的检测成本非常高，常规实验室难以接受；而且Real-timePCR和 LAMP方法可能因为样品存在对酶活性具有抑制作用的物质而导致结果呈现假阴性；LAMP 方法敏感性高，但非常容易造成气溶胶污染，产生假阳性，造成检测结果错误；ELISA免疫 学方法操作复杂，费时费力且不便于标准化及高通量操作。
【发明内容】
[0004] 鉴于上述各种方法的不足，本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种检测周期 短、敏感性高、特异性强、操作简单、成本低廉、可准确地检测食品中沙门氏菌的试剂盒及方 法，可在Id之内得到结果，同时无需昂贵的仪器和复杂的试剂，避免因为样品存在DNA聚合 酶的抑制因子而得到假阴性结果，可用于多种食品中沙门氏菌的检测等。
[0005] 本发明的技术解决方案是：
[0006] -种检测食品中沙门氏菌的试剂盒，
[0007] 该试剂盒包含：无菌去离子水，聚合酶链反应PCR反应预混液，对照品；
[0008] 所述PCR反应预混液含有PCR反应缓冲液，MgC12,脱氧核糖核苷三磷酸，检测用引 物，Taq DNA聚合酶，DNA染料；
[0009] 所述检测用引物为如下4条引物的混合物：
[0010] salF：GGAACGAACTAATTCAGCGATA；
[0011] salR：AGATGTCATTAACCTTGTGGAG；
[0012] 27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；
[0013] 1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT；
[0014] 所述对照品分为阴性对照品和阳性对照品，阴性对照品为无菌去离子水，阳性对 照品为salF/salR和27F/1492R两对引物的扩增产物经凝胶电泳纯化回收得到的DNA片 段。
[0015] 一种检测食品中沙门氏菌的扩增内标PCR方法，其特征在于依次按照如下步骤进 行：
[0016] (a)样品的米集：无菌米集可疑食品；
[0017] (b)增菌培养：将采集的可疑食品混合均匀后无菌取样25g，放入无菌研钵、组织 研磨器内研磨碎或放入均质袋内均质2min，加入无菌的营养肉汤培养基225ml，37 ± 1°C振 荡培养6-8h，得增菌液；
[0018] (c)DNA提取：取培养后的增菌液，振荡混勾，取1. 5ml于离心管中lOOOrpm离心 lmin，除去较大块的食品碎片，取上清lOOOOrpm离心lOmin，除去上清液，用无菌去离子 水重悬、洗绦沉淀，lOOOOrpm离心10min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，沸水浴 5min，冰浴5min，lOOOrpm离心5min，取上清液，得样品模板DNA;
[0019] (d)PCR反应管制备：PCR反应管的制备及PCR反应预混液的融化置于冰上进行；
[0020] 依次取PCR反应预混液24ul、样品模板DNAlul加入至PCR反应管中混合均匀，制 得样品模板DNA的PCR反应管；按样品模板DNA的PCR反应管的制备方法依次制备阴性对 照品和阳性对照品的PCR反应管；阴性对照品的PCR反应管中的样品模板DNA用试剂盒中 的阴性对照品代替，阳性对照品的PCR反应管中的样品模板DNA用试剂盒中提供的阳性对 照品代替；每扩增一次都要至少有一管阴性对照和一管阳性对照。
[0021] (e)扩增检测：将制备好的样品模板DNA、阴性对照品、阳性对照品的PCR反应管置 于PCR仪上进行PCR扩增，得PCR扩增产物，PCR的具体反应程序为：94°C预变性4min;94°C 变性 30s、53. 3°C退火 30s、72°C延伸 90s，30 个循环；72°C延伸 10min;
[0022] (f)检测结果判定：取lg琼脂糖溶于100ml电泳缓冲液中，混合均匀后煮沸，冷 却，倾倒凝胶板；凝胶冷却凝固后，将PCR扩增产物2-5ul加入凝胶孔中进行电泳；电泳结 束后，将凝胶放置于紫外灯下观察，判定结果：①阳性对照的凝胶孔有两条电泳条带而阴性 对照的凝胶孔无任何条带，则PCR反应检测成功；②若阳性对照的凝胶孔没有出现条带，则 说明提取的DNA中含有抑制PCR反应的因素，建议重新提取DNA后再进行检测；③若阴性对 照有2条带，说明PCR反应管制备过程中有交叉污染，结果不可靠，建议重新进行PCR检测； ④阳性对照有2条带，阴性对照没有条带，被检样品的凝胶孔只出现1条约1500bp的电泳 条带与阳性对照的凝胶孔相应条带大小一致，则结果判断为阴性；⑤被检样品的凝胶孔出 现的2条电泳条带与阳性对照的凝胶孔中相应条带大小一致，阴性对照无条带，则判定为 被检样品阳性。
[0023] 本发明的有益效果：与现有的检测方法相比，本试剂盒及检测方法使用方便、可靠 性好、检测周期短、灵敏度高、特异性强、成本低廉、操作步骤简单，适用于高通量操作、标准 化操作，又能鉴别因试剂中存在PCR反应抑制成分而导致的假阴性结果，对提高食品安全 水平具有重要意义。
【附图说明】
[0024] 图1检测成功的结果；
[0025] 图2提取的DNA中有PCR抑制剂时扩增得到的结果；
[0026] 图3PCR反应管制备过程中有交叉污染时扩增得到的结果；
[0027] 图4检测样品中沙门氏菌阴性时扩增得到的结果；
[0028]图5检测样品被沙门氏菌污染，扩增呈阳性时得到的结果。
【具体实施方式】
[0029] 实施例
[0030] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0031] 1.无菌采集可疑食品后取25g，用无菌研钵或研磨器研磨碎，或者用无菌均质袋 均质2min，与225ml无菌营养肉汤增菌液混合，置于37