一种甘蔗梢腐病原菌pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种甘蔗梢腐病原菌PCR检测试剂盒，属于分子生物学PCR遗传鉴定
技术领域。
【背景技术】
[0002] 甘鹿梢腐病（Pokkah Boeng Disease，PBD)是甘鹿生长中一种发生较普遍的、世界 性的甘蔗病害，1921年在印度尼西亚爪哇首次报道。目前，几乎所有甘蔗生产国和地区都有 该病发生。我国甘蔗生产区也常有梢腐病发生，福建、台湾、广西、云南、广东以及海南都曾 报道过，对我国甘蔗生产和糖业发展带来巨大损失。
[0003] 甘蔗梢腐病（PBD)主要通过带病植株和气流传播，感病后甘蔗一般表现为梢部和 幼叶基部缺绿黄化，叶片扭缠或短缩，有明显的褐色皱纹。发病最严重时形成梢腐，生长 点周围组织变软、变褐，心叶坏死，使整株甘蔗枯死。受害蔗株株高比健株平均减少30~ 60cm，受害蔗田每亩平均减产1~2t，甘蔗糖分降低0. 56 %左右，重力纯度降低3 %左右，造 成甘蔗产量和品质下降以及品种种性退化。甘蔗生长最旺盛的7-9月是梢腐病的主要发生 时期，高温高湿、干旱后充分灌水、施用氮肥过多或干旱后遇到降雨，都可引发梢腐病的大 规模发生。
[0004] 甘鹿梢腐病（PBD)的病原菌为 Gibberella fujikuroi (Saw. )Wolle，是一种真菌 性病害。在我国，甘蔗病害的基础性研宄比较薄弱.尤其在甘蔗抗病育种和病害的快速诊 断技术上，与先进国家有较大差距。借鉴或引进国外先进病害检测技术和抗性鉴定技术，提 高甘蔗抗病育种水平和病害诊断水平，是甘蔗梢腐病研宄的重点问题。
[0005] 甘蔗梢腐病（PBD)的诊断技术经历了从内部症状观察一相差显微镜检查一免疫 技术一PCR快速检测4个阶段。我国在这方面的研宄比较落后，诊断方法以内部症状观察 和相差显微镜检查为主，应用免疫技术和PCR检测PBD还处于起步阶段。20世纪80年代 初，免疫学技术在生物医学、动植物病原菌的检测、诊断与防治上得了广泛应用。1984年以 来，国外不少学者将免疫技术应用于甘蔗PBD诊断，以广西主栽品种新台糖22 (ROC)为研宄 对象，利用DNA杂交技术（Tissue blot DNA hybridization和ITS序列分析检测甘鹿梢腐 病病原细菌Gibberella fujikuroi (Saw. )Wolle，也获得了较理想的效果。PCR技术是20 世纪80年代中期建立的一项体外迅速、大量扩增目的基因的技术，已广泛地应用于分子生 物学、医学、农学等学科，用于基因的克隆遗传分析和疾病诊断等。由于PCR能够特异扩增 某一 DNA片段，因此，在病原微生物的检测上，比传统方法有优势，如PCR技术检测生物体 时不需要培养，具有极高的灵敏度、快速等。近10多年来，PCR技术在植物病害检测中得 到了广泛应用，也有不少学者对甘蔗梢腐病（PBD)分子检测技术进行了研宄，如张玉娟利 用甘蔗PBD病原细菌的18S-28S核糖体DNA的ITS区域设计了 1对特异引物（正向引物 为：5' -CTCTTGGTTCTGGCATCG-3'，反向引物为：5' -GTTCAGCGGGTATTCCTA-3'）进行 PCR检测， 检测了 14个PBD样本，获得了大小为545-546DNA特异扩增产物，ITS序列与镰刀菌同源性 尚达99 %。
[0006] 等温扩增技术（Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技 术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物 来达到快速核酸扩增的目的。环介导核酸等温扩增技术（loopnediated isothermal amplification，LAMP)，就是等温PCR技术的一种，是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩 增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在 等温条件（63°C左右）保温30~60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需 要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具 有简单、快速、特异性强的特点。
[0007] 但迄今为止，市面上尚未用于甘蔗梢腐病原菌检测的PCR试剂盒。本发明研制出 一种检测甘蔗梢腐病原菌PCR试剂盒，为我国甘蔗科研、检疫、质检等部门提供快速、灵敏、 准确的病害检测试剂盒产品和技术服务。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的，是提供一种甘蔗梢腐病原菌PCR检测试剂盒。该试剂盒用于甘蔗 梢腐病原菌的检测，具有操作简单、灵敏性高、特异性强等特点，且检测结果准确、客观、快 捷。
[0009] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种甘蔗梢腐病原菌PCR检测试剂 盒，包括盒体和设置在所述盒体开口处的盒盖，所述盒体包括内盒、外盒、以及位于内盒和 外盒之间的腔体，所述盒体的外底部四周设置有减震胶板，所述内盒内部设置有用于装载 试剂瓶的泡沫垫和1份使用说明书，所述泡沫垫上设有2个对照标准品和14瓶试剂，2个 对照标准品分别为阳性标准品和阴性标准品，14瓶试剂分别为1瓶上游引物、1瓶下游引 物、1 瓶 dNTPs Mixture、1 瓶Bst 2. ODNA Polymerase、2 瓶 IX Isothermal Amplification Buffer和8瓶ddH20,所述腔体内放有多个冰袋，所述盒盖的一侧与盒体的开口处转动连 接，另一侧向下弯折形成连接部，所述连接部朝向盒体的侧壁设有铁片，所述盒体的侧壁设 有与铁片相对应的磁铁，所述盒盖的内表面设有电子温度计。
[0010] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0011] 进一步，所述阳性标准品为甘蔗梢腐病原菌提取的DNA，所述阴性对照 品为不含有甘蔗梢腐病原菌的样品提取的DNA，所述上游引物的引物序列为： 5'-CTCTTGGTTCTGGCATCG-3'，所述下游引物的引物序列为：5'-GTTCAGCGGGTATTCCTA-3'。
[0012] 进一步，所述泡沫垫包括位于内盒内部靠上的第一泡沫垫、位于内盒内部居中的 第二泡沫垫和位于内盒内部靠下的第三泡沫垫，且所述第一泡沫垫、第二泡沫垫和第三泡 沫垫上下平行设置，所述第一泡沫垫上开有6个分别放置阳性对照标准品、阴性对照标准 品、上游引物、下游引物、dNTPs Mixture和Bst 2. ODNA Polymerase试剂瓶的圆形的凹槽， 在所述第一泡沫垫上还设有两个圆形的可伸进手指的通孔用于取出第一泡沫垫，所述第二 泡沫垫上开有5个分别放置两个IX Isothermal Amplification Buffer以及三个ddH20试 剂瓶的圆形的凹槽，在所述第二泡沫垫上还设有两个圆形的可伸进手指的通孔