一种耐大观霉素淋球菌的检测方法及试剂盒的制作方法

专利名称：一种耐大观霉素淋球菌的检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及实时荧光PCR检测。
背景技术：
淋病的病原体是淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae，简称为淋球菌或NG)，它对人的感染力强，既无有效疫苗，治愈后又无持久的免疫力，该病除了可引起泌尿生殖系统化脓性感染外，还会引起淋菌性眼炎、咽喉炎、直肠炎、盆腔炎等合并性或播散性感染。根据世界卫生组织估计，全球每年淋病发病数约为2500万；我国淋病的发病率较长期居性病发病率的前两位，2003年淋病报病数为59776例，居需传报传染病发病率第四位。
正确和规范使用抗生素，能快速治愈淋病，避免淋病慢性化及迁延化，是淋病防治的主要手段。但是，由于抗生素的大量不规范运用，以及NG基因突变(如质粒介导耐药、染色体突变耐药)，致使临床经常发现淋病对多种抗生素产生耐药，导致了淋病在人群中的长期存在和流行。美国CDC认为当一种抗生素对细菌的耐药率大于5％，该药就不应作为治疗该病的第一线用药，以按此为标准，现我国仅剩两个临床一线用药(大观霉素和头孢三嗪)，上述药物在我国的耐药率分别为0.36％，0.46％，耐大观霉素淋球菌在世界范围内目前仍然少见。我国已加入了全球淋病耐药监测网，以密切监测淋病对常见药物耐药性的动态变化，指导临床用药，具有重要意义。
常用药敏试验有纸片扩散法、琼脂稀释法、测β—内酰胺酶、耐药基因检测探针等，其中琼脂稀释法是WHO的标准方法，该方法测定各种抗生素对淋球菌的最小抑菌浓度(MIC)，前两种方法先通过培养患者的样本鉴定为淋球菌后，再用纯菌来培养检测，该方法培养周期长，试验过程繁琐；纸片扩散法受人为因素影响大，重现性和定量性不足；测β—内酰胺酶能检测耐药性的一个指标；耐药基因检测探针特异性强、灵敏度高、准确度好，是一个好的检测耐药性的方法。尤其是近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技术可弥补上述不足。荧光定量PCR灵敏度高，特异性好，速度快，已在基因表达水平分析、病原体的定性检测和定量检测等方面得到广泛应用，是当前病原体核酸检测和序列分析的主要方法。国内目前也已有合格的乙肝、艾滋病、结核检测的PCR试剂盒。
对于聚合酶链式反应来说，选择待扩增的靶DNA的碱基序列是最为重要的。16S rRNA是原核生物中高度保守基因序列，大小为1500碱基对左右，具有(1)保守性高，在生物进化中比其他基因演变得慢，有“分子化石”之称；(2)保守性是相对的，不同科、属、种间都有不同程度的差异；(3)不能侧向转移；(4)大小适度，能满足进行比较、扩增的要求。所以，通过聚合酶链式反应扩增检测淋球菌，16SrRNA基因具有一定优势。在此基础上设计的引物，可以对淋球菌高效扩增。
据最近的报道，导致淋球菌产生大观霉素耐药性的突变也发生在16SrRNA基因，突变区域与扩增区域的一致使得定量检测和突变鉴定同时进行成为可能，但是目前尚未有报道确定可用于检测耐大观霉素淋球菌的特异性遗传标记物序列，也没有见到相应的方法或试剂盒能够同时完成对淋球菌的检测和耐大观霉素突变区的鉴定。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种既能够有效检测淋球菌又可有效鉴定耐大观霉素突变株的聚合酶链式反应方法及试剂盒。
技术方案本发明从淋球菌基因组中有目的的选出了一段约1500个碱基对的16S核糖体RNA基因(16S ribosomal RNA gene)(ANTIMICROBIAL AGENTS ANDCHEMOTHERAPY，May.2000，p.1365-1366)，适合作为特异性PCR检测的扩增靶序列。
如本文所用，术语“16S ribosomal RNA gene”或“16S核糖体RNA基因”指编码淋球菌16S核糖体RNA的核苷酸序列，其GenBank登录号X07714，具体序列示于SEQ ID NO1。
本发明还提供一种同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法，反应的步骤依次为
(1)抽提样品的DNA；(2)将抽提的DNA作为模板，用一对正反引物进行PCR扩增；(3)检测扩增产物以确定样品中是否存在淋球菌株；(4)鉴定扩增产物是否存在突变以检测大观霉素耐药性；其中，正引物与SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，反引物与SEQ ID NO1中所示的部分序列互补，长度范围均为15-35个核苷酸。
本发明进一步提供同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的优选方案，即正反引物设计于SEQ ID NO2的两端。
本发明提供上述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的一种优选方案为，所说引物中的一个为5’CATTAGTTGC CATCATTCG3’，另一个为5’CCCTCTGTAC CGACCATT 3’。
本发明还提供上述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法另一种优选方案，即所述反应还含有两个长度为15-30个核苷酸的探针，其中一个探针的序列与SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，另一个探针的序列与SEQ ID NO1中所示的部分序列互补。
上述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的进一步优选方案为，所述的两个DNA探针序列分别为5’ACGTCAAGTC CTCATGGC3’和5’CGTGTGAAGC CCTGGTCAT 3’。
本发明还提供所述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的优选方案，其反应的扩增产物的长度为70-160个核苷酸对。
本发明的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的进一步优选方案为，所述的步骤(3)是通过检测荧光信号的强弱来定量检测样品中的淋球菌。
本发明的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的进一步优选方案为，所述的步骤(4)是通过检测另一种荧光信号并与步骤(3)的荧光信号进行比对来定性检测样品中淋球菌的突变情况。
基于SEQ ID NO1和2，本发明不仅提供了一种利用聚合酶链式反应扩增16S核糖体RNA基因检测耐大观霉素淋球菌的方法，还提供一种快速定量检测耐大观霉素淋球菌的荧光定量PCR试剂盒。
本发明提供的含有上述的检测淋球菌的遗传标记物的试剂盒，试剂组成包括DNA裂解液、荧光定量反应液、定量校准品、阳性对照品、阴性对照品、突变对照品，其中，定量校准品是含有所述的SEQ ID NO2的136个核苷酸序列的质粒。
本发明的关键是使用了特异性扩增耐大观霉素淋球菌遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且一个引物的序列SEQ ID NO3与SEQID NO1所示的部分序列相同，且另一个引物的序列SEQ ID NO4与SEQ ID NO1所示的部分序列互补，且扩增产物的长度为136bp。SEQ ID NO3和4分别对应于SEQ ID NO1的1120和1238bp位置。
本发明所述的特异性扩增耐大观霉素淋球菌的引物以及检测用探针，可根据遗传标记物的序列SEQ ID NO1或2进行设计，并通过常规的DNA合成方法获得，例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成。
本发明的这些引物可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。
为了减少假阳性，并完成耐大观霉素突变区的检测，还需对扩增产物用淋球菌特异性探针和耐大观霉素突变特异探针同时进行杂交。一种优选的探针是Taqman探针(见下文说明)，它可在PCR反应中直接实时地通过荧光信号反映扩增产物的存在与否以及产物拷贝数量的高低。
本发明的探针TaqMan是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此Taqman探针检测的是积累荧光。
本发明提及的探针序列5’端用报告荧光基团如FAM(Carboxyfluorescein，6-羧基荧光素)或TET(Tetrachloro fluorescein，四氯-6-羧基荧光素)标记，3’端用淬灭荧光基团如TAMRA(Tetramethylrhodamine，6-羧基四甲基若丹明)或Dabcyl(4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)标记后即可用于对耐大观霉素淋球菌检测的PCR反应。
虽然引物和探针与模板序列的完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。利用这些有错配碱基的相似引物、或者含有这些引物的试剂盒、以及使用这些引物的检测方法都在本发明技术方案范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物包含有本发明的淋球菌16S核糖体RNA基因或其片段。
虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为7O-1000bp，较佳地为90-500bp，更佳地为100-300bp。
在一个优选例中，本说明书提供一种快速定量检测耐大观霉素的荧光PCR试剂盒，该试剂盒的组成包括a)DNA裂解液，b)荧光定量反应液，c)定量校准品，d)阳性对照品，e)阴性对照品，f)突变对照品，具体为1)荧光定量反应液含有PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl2溶液，特异性扩增淋球菌16S核糖体RNA基因遗传标记物的引物和荧光探针(例如引物序列为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，荧光探针序列为SEQ ID NO5，SEQ ID NO6)；SEQ ID NO5荧光探针5’端标记的荧光报告基团是TET，SEQ ID NO6荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，SEQ ID NO5、SEQ ID NO6荧光探针3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA；2)定量校准品是含有SEQ ID NO2中136个核苷酸片段构成的pGEM-T载体，且该载体可在大肠杆菌中增殖。阳性对照品是淋球菌标准菌株NCTC83785(英国伦敦国家标准培养物收藏中心)培养物。突变对照品是临床耐药株培养物，从性病门诊有症状淋病患者中分离。
在本发明的一个优选方案中，荧光定量反应液包含50mM KCl，10mMTris-HCl pH8.3(25℃)，2mM MgCl2，3％甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmol，荧光探针各0.5pmol，0.2mM dNTPs、无菌双蒸水和1.5个单位的Taq酶(ROCHE公司，瑞士)。其中引物为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，荧光探针为SEQ ID NO5，SEQ ID NO6所示的核苷酸序列，两个荧光探针5’端标记的荧光报告基团分别是FAM、TET，3’端标记的荧光淬灭基团都是TAMRA。
在本发明的一个优选方案中，定量校准品是含有SEQ ID NO2共136个核苷酸片段构成的pGEM-T载体，且该载体可在大肠杆菌中增殖。贮存浓度为4×109拷贝/μL，使用前10倍梯度稀释。含有目的片段的质粒转化大肠杆菌增殖后，用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释至4×109拷贝/μL，-20℃保存。
在本发明的一个优选方案中，DNA裂解液包含10mM Tris-HCl pH8.0，0.05mM EDTA，1％NP-40，1％Triton，0.05M NaCl。
在本发明提供的检测耐大观霉素淋球菌的荧光定量PCR试剂盒中，有两条两端标记有荧光基团的特异性探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离靠近，5’端报告基团产生的荧光应为荧光共振能量转移(FRET)而被3’端淬灭基团淬灭，故体系中检测不到荧光。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切活性对荧光探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的FRET，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量PCR仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈正比例关系。这种探针的设计即被称为Taqman探针。
对淋球菌的定量可以通过与定量校准品的循环阈值(Ct，ThresholdCycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量底循环数。Ct值与起始模板数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多；相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用梯度定量校准品的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
本发明提供的检测耐大观霉素的荧光定量PCR试剂盒，经过对各组分，如引物浓度、荧光探针浓度、Mg2+浓度、退火温度等的优化，将FQ-PCR技术和实时荧光PCR系统(icycler，Rotorgene)相结合。通过优化方案，反复实验，试剂盒完全可以满足快速特异检测耐大观霉素淋球菌的实际需求。
本发明还进一步具体提供一种利用本发明试剂盒检测耐大观霉素淋球菌的方法，该方法包括如下检测步骤a)用DNA裂解液从阳性对照品和待测样本中提取DNA；b)分别取上步提取的DNA、梯度定量校准品加入荧光反应液中用实时荧光PCR仪进行扩增，同时在510nm和550nm条件下分别检测；c)通过比较待测样品和标准品510nm下的循环阈值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。
d)通过比较待测样品550nm下的循环阈值和510nm下的循环阈值而对待测样品的突变情况进行定性。
有益效果本发明从淋球菌基因组中发现一段约1500个碱基对的16S核糖体RNA基因，该基因为淋球菌本身特有的基因序列，编码16S核糖体RNA。从临床得到的耐大观霉素淋球菌株均在16S核糖体RNA基因上发现了突变。其他物种，如大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌的大观霉素耐药性的原因也被确认是由各自的16S核糖体RNA基因发生突变导致的。因此，选择这一特定的核酸序列作为引物，具有很好的特征性。
根据本发明所述的16S核糖体RNA基因设计的引物可在淋球菌的标准株及临床标本中扩增出相应的DNA片段。而且，该引物未在其他相关病原体上扩增出相应片段，说明以16S核糖体RNA基因为基础设计的PCR反应系统具有良好特异性。
本发明所设计的两条淋球菌专一性核酸引物具有严格的种特异性。用本发明引物进行常规PCR反应，结果能从含有淋球菌的材料的DNA提取物中扩增出大小为136bp特异性PCR产物。因此，以本发明引物进行常规PCR反应，并通过判断相应大小PCR产物的有无可以准确、快速地检测淋球菌，而且所需的样品量很少。
就敏感性而言，16S核糖体RNA基因在基因组中多拷贝存在。当以此序列为基础设计引物并对淋病患者的临床标本进行PCR扩增时，比单拷贝基因序列更能满足临床对检出灵敏度的需要。
根据对临床耐大观霉素淋球菌株的基因序列分析，SEQ ID NO2所示的核苷酸序列包含了临床发现的突变位点，是一种特别优选的适合作为耐大观霉素淋球菌特异性遗传标志的序列。
将本发明的引物与Taqman探针技术结合，便得到了本发明的同时对耐大观霉素淋球菌进行定性检测和定量计数分析方法。本发明第一次揭示了扩增16S核糖体RNA基因检测耐大观霉素淋球菌的可能，同时提供了一种在此基础上快速特异检测耐大观霉素淋球菌的荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒对耐大观霉素淋球菌的检测操作简单，仅需2～3小时。整个操作过程只需一人，一次可检测32～96(实时荧光PCR仪型号决定)个样品，减少了人力资源的浪费。同时，这种分析方法不仅克服了常规定量PCR方法中的误差，而且分析所需的样品量少，检出极限低，灵敏度高。
另外，本发明与现常用的培养法相比具有以下主要优点和效果a)检测速度快，加上DNA的提取，2～3小时完成；b)荧光探针的存在，保证了检测的特异性和灵敏度。
c)操作简单，检测淋球菌存在的同时完成突变鉴定；d)定量准确；
e)可同时进行高通量的样品检测。
本发明成功设计的关键在于导致淋球菌产生大观霉素耐药性的突变发生在相对保守的16S rRNA基因，突变区域与扩增区域的一致使得定量检测和突变鉴定同时进行成为可能，故本发明的方法和试剂盒能够同时完成对淋球菌的检测和耐大观霉素突变区的鉴定。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等著，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1分离用于PCR分析的淋球菌DNA为了从待测样本中分离用于聚合酶链式反应检测的淋球菌DNA，必须使用不影响聚合酶链式反应的简单方法。首先，用灭菌生理盐水漂洗临床样本(生殖泌尿道拭子)，将漂洗液15,000rpm离心15分钟后弃上清，从而漂洗液中可能含有的淋球菌被收集起来。沉淀中加入DNA裂解液后，振荡混匀，100℃沸水浴15分钟，裂解淋球菌释放DNA。最后15,000rpm离心15分钟，DNA溶解至上清液中，取上清液作为用于PCR分析的淋球菌DNA。
实施例2检测试剂盒的制备用常规方法制备一种快速定量检测耐大观霉素淋球菌的荧光PCR试剂盒，该试剂盒包括a)DNA裂解液，b)荧光定量反应液，c)定量校准品，d)阳性对照品，e)阴性对照品，f)突变对照品。其中1)荧光定量反应液含有PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl2溶液，特异性扩增16S核糖体RNA基因遗传标记物的引物序列为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，荧光探针序列为SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO5荧光探针5’端标记的荧光报告基团是TET，SEQ ID NO6荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，SEQ ID NO5、SEQ ID NO6荧光探针3’端标记的荧光淬灭基团都是TAMRA。(扩增产物大小为136bp)
具体地，荧光定量反应液包含50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3(25℃)，2mM MgCl2，3％甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmol，荧光探针各0.5pmol，0.2mM dNTPs、无菌双蒸水和1.5个单位的Taq酶(ROCHE公司，瑞士)。
2)定量校准品是含有SEQ ID NO2共136个核苷酸的pGEM-T载体(该载体购自Promega公司，SEQ ID NO2插入β-内酰胺酶编码区)，且该载体可在大肠杆菌中增殖。阳性对照品是淋球菌标准菌株NCTC 83785(英国伦敦国家标准培养物收藏中心)培养物。突变对照品是临床耐药株培养物，从性病门诊有症状淋病患者中分离。
具体地，定量校准品的贮存浓度为4×109拷贝/μL，使用前10倍梯度稀释。含有目的片段的质粒转化大肠杆菌增殖后，用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释至4×109拷贝/μL，-20℃保存。
3)DNA裂解液包含10mM Tris-HCl pH8.0，0.05mM EDTA，1％NP-40，1％Triton，0.05M NaCl。
实施例3用淋球菌进行聚合酶链式反应分别取实施例2中的荧光反应液各26μL加入到不同的PCR反应管中，将实施例1所得的DNA和定量校准品向荧光定量反应液中加入4μL，总体积30μL。在实时荧光定量PCR仪(澳大利亚Corbett，Rotor-Gene2000)上开始扩增检测。扩增参数设置为变性温度94℃10秒，退火延伸温度63℃30秒的循环下，进行40个循环的PCR扩增。把荧光检测的程序设置在每个循环的退火步骤结束时，检测波长为510nm和550nm。
循环结束后，运用仪器配套软件，510nm读取待检样本拷贝数。结果为定量校准品4×106拷贝数/μL、4×105拷贝数/μL、4×104拷贝数/μL的Ct值分别为23.28、27.21、31.27；待测样本的Ct值范围为17～37，经标准曲线换算定量范围为1.81×108拷贝数/μL～1.2×103拷贝数/μL。具体结果如下表


这表明，本发明试剂盒中可在1.81×108拷贝数/μL～1.2×103拷贝数/μL的广大范围内扩增出耐大观霉素淋球菌。
运用仪器配套软件，550nm读取待检样本拷贝数。结果为定量校准品4×106拷贝数/μL、4×105拷贝数/μL、4×104拷贝数/μL的Ct值分别为24.22、27.93、31.03；待测样本中的550nm下Ct值与510nm下Ct值差异野生型淋球菌≤3，突变型淋球菌＞3。具体结果如下表

这表明，本发明试剂盒可有效鉴别淋球菌耐大观霉素的突变情况。
实施例4用各种病原体进行聚合酶链式反应用实施例1-3相同的方法进行扩增检测，不同点在于本实施例的反应模板选取其他可能出现在相近解剖位置的病原体的DNA，如沙眼衣原体、解脲支原体、人形支原体、金黄色葡萄球菌、人白细胞DNA。
检测结果如下表

如上所述，本实施例对其他相近的病原体基因无交叉反应，可特异地扩增出淋球菌。
实施例5用各种病原体进行聚合酶链式反应重复实施例1-4的相同方法，不同点仅在于用SEQ ID NO7和8所示的引物替换SEQ ID NO3和4所示的引物。
检测结果表明，该引物对同样可以特异地扩增出耐大观霉素淋球菌产物长度305碱基对。同时可以有效地鉴别淋球菌耐大观霉素的突变情况。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海复星医学科技发展有限公司<120>一种耐大观霉素淋球菌的检测方法及试剂盒<130>040291<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1544<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>1tgaacataag agtttgatcc tggctcagat tgaacgctgg cggcatgctt tacacatgca60agtcggacgg cagcacaggg aagcttgctt ctcgggtggc gagtggcgaa cgggtgagta120acatatcgga acgtaccggg tagcggggga taactgatcg aaagatcagc taataccgca180tacgtcttga gagggaaagc aggggacctt cgggccttgc gctatccgag cggccgatat240ctgattagct ggttggcggg gtaaaggccc accaaggcga cgatcagtag cgggtctgag300aggatgatcc gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg360gggaattttg gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgtct gaagaaggcc420ttcgggttgt aaaggacttt tgtcagggaa gaaaaggctg ttgccaatat cggcggccga480tgacggtacc tgaagaataa gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta540gggtgcgagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcggg cgcagacggt tacttaagca600ggatgtgaaa tccccgggct caacccggga actgcgttct gaactgggtg actcgagtgt660gtcagaggga ggtggaattc cacgtgtagc agtgaaatgc gtagagatgt ggaggaatac720cgatggcgaa ggcagcctcc tgggataaca ctgacgttca tgtccgaaag cgtgggtagc780aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccctaaacga tgtcaattag ctgttgggca840acttgattgc ttggtagcgt agctaacgcg tgaaattgac cgcctgggga gtacggtcgc900aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag cggtggatga tgtggattaa960ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggt tttgacatgt gcggaatcct ccggagacgg1020aggagtgcct tcgggagccg taacacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg1080agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc attagttgcc atcattcggt1140tgggcactct aatgagactg ccggtgacaa gccggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc1200ctcatggccc ttatgaccag ggcttcacac gtcatacaat ggtcggtaca gagggtagcc1260aagccgcgag gcggagccaa tctcacaaaa ccgatcgtag tccggattgc actctgcaac1320tcgagtgcat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcaggtca gcatactgcg gtgaatacgt1380tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggggatacc agaagtaggt1440agggtaaccg caaggagtcc gcttaccacg gtatgcttca tgactggggt gaagtcgtaa1500caaggtagcc gtaggggaac ctgcggctgg atcacctcct ttct1544<210>2<211>136<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>2cattagttgc catcattcgg ttgggcactc taatgagact gccggtgaca agccggagga60aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttatgacca gggcttcaca cgtcatacaa120tggtcggtac agaggg136<210>3<211>19<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>3cattagttgc catcattcg19<210>4<211>18<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae
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<212>DNA<213>Neisseria gonorrhoeae<400>8cgtattcacc gcagta1权利要求
1.一种同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法，其特征在于所述反应的步骤依次为(1)抽提样品的DNA；(2)将抽提的DNA作为模板，用一对正反引物进行PCR扩增；(3)检测扩增产物以确定样品中是否存在淋球菌株；(4)鉴定扩增产物是否存在突变以检测大观霉素耐药性；其中，正引物与SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，反引物与SEQ ID NO1中所示的部分序列互补，长度范围均为15-35个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法，其特征在于正反引物设计于SEQ ID NO2的两端。
3.根据权利要求2所述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法，其特征在于所述引物中的一个为5’CATTAGTTGC CATCATTCG3’，另一个为5’CCCTCTGTAC CGACCATT 3’。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法，其特征在于所述反应还含有两个长度为15-30个核苷酸的探针，其中一个探针的序列与SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，另一个探针的序列与SEQ ID NO1中所示的部分序列互补。
5.根据权利要求4所述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法，其特征在于所述的两个探针序列分别为5’ACGTCAAGTCCTCATGGC 3’和5’CGTGTGAAGC CCTGGTCAT 3’。
6.根据权利要求4所述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法，其特征在于所述反应的扩增产物的长度为70-160个核苷酸对。
7.根据权利要求4所述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法，其特征在于所述的步骤(3)是通过检测荧光信号的强弱来定量检测样品中的淋球菌。
8.根据权利要求4所述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法，其特征在于所述的步骤(4)是通过检测另一种荧光信号并与步骤(3)的荧光信号进行比对来定性检测样品中淋球菌的突变情况。
9.含有权利要求1所述的检测淋球菌的遗传标记物的试剂盒，试剂组成包括DNA裂解液、荧光定量反应液、定量校准品、阳性对照品、阴性对照品、突变对照品，其特征在于定量校准品是含有所述的SEQ ID NO2的136个核苷酸序列的质粒。
全文摘要
本发明提供了一种利用遗传标记物来同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法及试剂盒，特别是选取淋球菌16S rRNA的核苷酸序列，设计出了特异性检测的寡核苷酸引物和探针。本发明可方便、快速、准确地定性检测和定量计数淋球菌，同时鉴别是否发生了淋球菌大观霉素的突变。
文档编号C12Q1/04GK1789430SQ20041009305
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月15日 优先权日2004年12月15日
发明者张继伦, 李超, 周煜, 夏懿 申请人:上海复星医学科技发展有限公司