专利名称：检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的试纸条及方法。
背景技术：
大观霉素又称壮观霉素、奇放线菌素、壮观菌素等，为大观链霉菌所产生的一种氨基环醇类抗生素，对革兰氏阴性菌(如布鲁氏菌、克雷伯菌属、变形杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等)有较强作用，对革兰氏阳性菌(链球菌、葡萄球菌等)作用较弱，对支原体亦有一定作用，是一新型特效专治淋病的抗生素，对淋病奈瑟菌有较强的抗菌作用。能促进动物生长，是良好的动物饲料添加剂，作为兽药广泛应用于畜牧业中。一些不法商贩受经济利益的驱使滥用抗生素，使大量抗生素残留在畜产品中，如果长期食用含有抗生素残留的动物源性食品，也就相当于长期低剂量吸收抗生素，使人体内菌株产生抗生素抗性，给患病时使用抗生素治疗带来不良影响，会破坏机体内环境平衡，造成菌群失调，抗生素过敏体质的人会出现过敏反应，引起免疫性溶血，同时造成食品和环境中药物残留污染的一系列问题。链霉素是氨基糖苷类抗生素，在奶牛及奶羊养殖中应用普遍，但由于使用管理不规范，常造成鲜奶及奶粉中链霉素残留。由于链霉素、对人体具有较大的毒副作用，严重时可造成过敏性休克和耳聋，特别是对小孩的危害较大，可透过胎盘进入羊水和胎儿循环，危害胎儿健康。各国对乳制品中的链霉素、双氢链霉素均制定了严格的残留限量，如日本规定奶中链霉素与双氢链霉素的总限量为0.2 mg/kg，美国规定乳及牛奶中双氢链霉素的限量为0.125 mg/kg,中国规定奶中链霉素与双氢链霉素的限量均为0.2 mg/kg,所以对奶粉中的链霉素、双氢链霉素残留量进行检测对于控制奶粉质量，维护人类的饮食健康有重要意义。庆大霉素是由小单胞菌产生的一种氨基糖苷类抗生素，对多种革兰阳性和阴性菌都具有显著的抗菌效果，作为饲料添加剂和治疗疾病的抗生素广泛应用于畜牧业。然而，庆大霉素对人类具有明显的毒害作用，对脑神经、听觉以及肾脏的损害严重。许多国家和国际组织均明确规定了食品中该药物残留的最大残留限量。欧盟规定，牛奶中的最大残留量为100 μ g/kg,肌肉、脂肪中的最大残留量为50 μ g/kg。新霉素属氨基糖苷类抗生素，抗菌谱广，在兽医临床上应用广泛，是重要的抗感染药物，还被普遍用于治疗乳腺炎、角膜炎、结膜炎、耳炎、皮炎、外伤感染、足腐烂等疾病。我国和其它一些国家还将新霉素作为饲料抗生素添加剂使用，用于预防畜禽感染引起的早期损失和肠炎，提高饲料利用率，促进生长。虽然新霉素在兽医和畜牧上使用取得了巨大的成功，但其对人和动物存在潜在的耳毒性和肾毒性，为此，我国和欧盟等国家均制定了动物源性食品中新霉素最高残留限量。目前免疫分析领域缺乏能够同时检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素这四种药物的技术及其应用。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、检测药物种类多、适合大规模推广的检测方法。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种同时检测检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的试纸条。本实用新型所提供的试纸条包括微孔条、微孔试剂、微孔塞和试纸，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂的冻干有大观霉素特异性抗体-胶体金标记物、链霉素特异性抗体-胶体金标记物、庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物和新霉素特异性抗体-胶体金标记物；反应膜上具有包被有大观霉素-载体蛋白偶联物、链霉素-载体蛋白偶联物、庆大霉素-载体蛋白偶联物以及新霉素-载体蛋白偶联物的四条检测线和包被羊抗鼠抗抗体的一条质控线。四条检测线和一条质控线互相平行，大观霉素检测线靠近样品吸收垫一端，质控线靠近吸水垫一端。链霉素检测线、庆大霉素检测线、新霉素检测线在大观霉素检测线和质控线之间。其中大观霉素检测线用检测线(Tl)表示，链霉素检测线用检测线(T2)表示，庆大霉素检测线用检测线(T3)表示，新霉素检测线用检测线(T4)表示，质控线用质控线(C)表示。质控线(C)距离反应膜的末端与吸水垫相连的一端为5-8mm，检测线(T4)距离质控线(C) 4_6mm，检测线(T3)距离检测线(T4) 4_6mm，检测线(T2)距离检测线(T3) 4-6mm，检测线(Tl)距离检测线(T2) 4_6mm。保护膜粘贴样品吸收垫上的检测端，上面有MAX标记线。在装有冻干有大观霉素特异性抗体-胶体金标记物、链霉素特异性抗体-胶体金标记物、庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物和新霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔条上具有微孔塞。为了便于运输和使用，试纸条还有固定用具及其固定于其中用于盛装试纸和冻干有大观霉素特异性抗体-胶体金标记物、链霉素特异性抗体-胶体金标记物、庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物和新霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔条的试剂桶，所述试剂桶上具有密封盖。本实用新型试纸条中试纸底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试纸条盒体为硬纸盒；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料。本实用新型试纸条具有如下有益效果:1.灵敏度高:传统的试纸卡均具有固定试纸条的卡壳固定装置,卡壳固定装置紧紧地将试纸固定其中，在对样品检测时，由于卡壳与试纸结合的比较紧密，致使检测样品溶液不能够充分渗透到样品吸收垫一段，并在试纸上进行层析的速度十分缓慢，导致检测样品中的药物不能够与检测线上包被的包被原充分接触，致使试纸卡的灵敏度下降。本实用新型试纸条比传统试纸卡的检测灵敏度高，由于本实用新型试纸条的试纸为裸条状，无需壳体紧固装置，检测样品可以直接接触试纸的样品吸收垫一端，并且样品在试纸上的层析速度比较快，使样品中的待检药物能够充分的与检测线上包被的包被原结合，从而提高了试纸条的检测灵敏度。大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素检测试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试纸条具有较高的特异性和灵敏度。本试纸条对大观霉素检测灵敏度为:20 μ g/L ;对链霉素检测灵敏度为:80 μ g/L ;对庆大霉素检测灵敏度为:20μ g/L ;对新霉素检测灵敏度为:500 μ g/L。2.操作简便快速:对于以往的试纸卡检测原料奶必须要将原料奶加入稀释液进行稀释才能够点样检测，原因是由于固定试纸的塑料壳体紧紧地把试纸固定在壳体内，而原料奶比较粘稠，所以直接将原料奶在试纸卡的加样孔进行点样检测的话，由于壳体与试纸条结合紧密以及奶液粘稠所致，原料奶样品无法完全渗透到样品吸收垫和结合物释放垫中，并且在试纸上的层析速度比较缓慢，以至于无法检测，故要将原料奶加入稀释液进行稀释后方可检测。使用本实用新型试纸条检测时无需任何其它试剂，检测原料奶时，也不需要对原料奶进行稀释，原因由于本实用新型试纸条中的试纸为裸条状，即无需用壳体对其进行固定，只要将待检样品溶液直接滴加于冻干有大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔中，混匀后，孵育5min，再将试纸标有MAX线标记端向下，插入孵育后的微孔试剂中，试纸可以与样品溶液充分接触，5min后观察结果。对于牛奶样品的检测，本实用新型试纸条比传统试纸卡检测时间短，由于本实用新型试纸条无需对样品进行稀释，可直接对样品进行检测。3.显示检测结果形象、直观准确。检测结果的判定是以试纸条的四条检测线和一条质控线是否显色作为阴性和阳性判断标准。如果反应膜上的大观霉素检测线显示一条红色条带，链霉素检测线显示一条红色条带，庆大霉素检测线显示一条红色条带，新霉素检测线也显示一条红色条带，同时质控线也显示一条红色条带，表示样品中大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素均分别低于试纸条对大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的最低检测限；如果反应膜上链霉素、庆大霉素、新霉素的检测线显示红色条带，同时质控线也显示一条红色条带，而大观霉素检测线不显色，表示检测样品中只有大观霉素含量等于或高于试纸条对大观霉素的低检测限；如果反应膜上大观霉素、庆大霉素、新霉素的检测线显示红色条带，同时质控线也显示一条红色条带，而链霉素检测线不显色，表示检测样品中只有链霉素含量等于或高于试纸条对链霉素的低检测限；如果反应膜上大观霉素、链霉素、新霉素的检测线显示红色条带，同时质控线也显示一条红色条带，而庆大霉素检测线不显色，表示检测样品中只有庆大霉素含量等于或高于试纸条对庆大霉素的低检测限；如果反应膜上大观霉素、链霉素、庆大霉素的检测线显示红色条带，同时质控线也显示一条红色条带，而新霉素检测线不显色，表示检测样品中只有新霉素含量等于或高于试纸条对新霉素的低检测限；如果反应膜上只有质控线显示红色条带，而大观霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素检测线均不显示红色条带，表示检测样品中的大观霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的含量同时等于或高于试纸条对大观霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的最低检测限；如果反应膜上的质控线没有显示红色条带，无论大观霉素、链霉素、庆大霉素和(或)新霉素检测线是否显示红色条带，试纸条检测结果均视为无效。结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。4.成本低，投资少:使用本实用新型试纸条，不需另配仪器设备及其他试剂，也不需要固定试纸条的卡壳固定装置，成本低廉，投资少，见效快，使现场检测一步到位。[0016]5.易于大范围推广应用:试纸条操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如
专业化验、卫生防疫、质量监测、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效.、/■
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图1为本实用新型试纸结构剖面图；图2为本实用新型试纸俯视图；图3为本实用新型冻干有金标抗体的微孔条；图4为本实用新型微孔塞俯视图5为本实用新型微孔塞侧视图；图6为本实用新型试纸条检测结果判定图；图7为本实用新型试剂桶结构示意图；图8为本实用新型固定用具的俯视图；图9为本实用新型盒体与固定用具的侧视图。
具体实施方式
一、大观霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素检测试纸条的组装制备I)试纸样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，保护膜7覆盖在样品吸收垫的检测端，在检测端保护膜上印有MAX标记线。反应膜上的四条检测线和一条质控线互相平行，并且与试纸的长相垂直。检测线4-1即为检测线(Tl)，靠近样品吸收垫一端，质控线5即为质控线(C)，靠近吸水垫一端，检测线4-2即为检测线(T2)，检测线4-3即为检测线(T3)，检测线4-4即为检测线(T4)，在检测线(T)和质控线(C)之间。质控线(C)距离反应膜的末端与吸水垫相连的一端为5-8mm，检测线(T4)距离质控线(C) 4_6mm，检测线(T3)距离检测线(T4)4-6mm,检测线(T2 )距离检测线(T3 ) 4_6mm，检测线(TI)距离检测线(T2 ) 4_6mm。检测线(Tl)包被有大观霉素-载体蛋白偶联物，检测线(T2)包被有链霉素-载体蛋白偶联物，检测线(T3)包被有庆大霉素-载体蛋白偶联物，检测线(T4)包被有新霉素-载体蛋白偶联物，质控线(C )包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。2)冻干有金标抗体的微孔条所述微孔条8的底部冻干有大观霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物，即金标抗体9。微孔条8具有微孔塞10。3)将I)试纸条和2)微孔条装入具有密封塞的试剂桶11中，将试剂桶放置于试纸条盒体13内的固定用具12中。二、试纸条的使用[0034]取待检牛奶样品溶液滴加200 μ I到微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将试纸标有MAX线标记端向下，插入鮮育后的微孔试剂后计时，5min后观察结果。三、检测结果分析阴性(_):C线显色，四条T线均显色，无论颜色深浅，均表示牛奶样本中大观霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素浓度均低于检测限，如图6.a所示。阳性(+ ):C线显色，T1线不显色，表示牛奶样本中大观霉素浓度等于或高于检测限；(:线显色，T2线不显色，表示牛奶样本中链霉素浓度等于或高于检测限；C线显色，T3线不显色，表示牛奶样本中庆大霉素浓度等于或高于检测限； C线显色，T4线不显色，表示牛奶样本中新霉素浓度等于或高于检测限，如图6.a-6.f所示。无效:未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效，如图6.g-6.k所示。四、检测试纸条中用到的材料制备方法如下:1、抗原的制备 I)、大观霉素-载体蛋白偶联物的合成与鉴定a.大观霉素半抗原合成:取大观霉素0.66 g、羧甲基轻胺0.27 g和卩比唳I ml于20 ml DMSO中的混合液，在室温下搅拌反应20小时，蒸除溶剂，柱层析纯化后在乙醇-水体系中重结晶得到大观霉素与羧甲基羟胺的缩合物，分子结构如下:
权利要求1.一种检测大观霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的试纸条，其特征在于包括试纸、微孔条、微孔试剂和微孔塞，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板，所述反应膜上有四条检测线和包被羊抗鼠抗抗体的一条质控线，四条检测线分别包被有大观霉素-载体蛋白偶联物、链霉素-载体蛋白偶联物、庆大霉素-载体蛋白偶联物和新霉素-载体蛋白偶联物，所述微孔试剂为冻干的大观霉素-胶体金标记物、链霉素-胶体金标记物、庆大霉素-胶体金标记物和新霉素-胶体金标记物。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述反应膜上的四条检测线和一条质控线互相平行，并且与试纸条的长相垂直。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述的大观霉素检测线靠近样品吸收垫一端，质控线靠近吸水垫一端，链霉素检测线、庆大霉素检测线和新霉素检测线在大观霉素检测线和质控线之间。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次黏贴在底板上组成。
5.根据权利要求1或4所述的试纸条，其特征在于:所述保护膜粘贴样品吸收垫上的检测端，上面有MAX标记线。
6.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于所述微孔条上具有微孔塞。
7.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于所述试纸条还包括用于盛装试纸和冻干有大观霉素特异性抗体-胶体金标记物、链霉素特异性抗体-胶体金标记物、庆大霉素特异性抗体-胶体金标记物和新霉素特异性抗体-胶体金标记物的微孔条的试剂桶和固定试剂桶的固定用具。
8.根据权利要求7所述的试纸条，其特征在于所述试剂桶上具有密封盖。
9.根据权利要求7所述的试纸条，其特征在于所述试纸条盒体为硬纸盒，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具为硬质支撑材料。
专利摘要本实用新型公开了一种检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的试纸条。试纸条包括微孔条、微孔试剂、试纸条和微孔塞，所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板依次连接组成，所述反应膜上包括四条检测线和一条质控线，四条检测线分别包被有大观霉素-载体蛋白偶联物、链霉素-载体蛋白偶联物、庆大霉素-载体蛋白偶联物和新霉素-载体蛋白偶联物，质控线包被有羊抗鼠抗抗体。用本实用新型试纸条检测大观霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素的方法，简便、快速、直观、准确、便于携带、适用范围广、成本低、易推广使用。
文档编号G01N33/577GK203069593SQ20122051020
公开日2013年7月17日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者万宇平, 罗晓琴, 刘叶, 聂雯莹, 杨秀贤, 郝士元, 陈娟, 韩京朋 申请人:北京勤邦生物技术有限公司