南美白对虾海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其检测与应用
【专利摘要】南美白对虾海藻糖?6?磷酸合成酶基因及其检测与应用，涉及海藻糖。通过提取南美白对虾Litopenaeus vannamei的总RNA，进行逆转录，通过引物扩增，鉴定了1个海藻糖?6?磷酸合成酶基因，根据该序列信息，设计最佳的引物，用于实时定量PCR方法，为检测该基因在对虾中的转录表达水平提供了基础。通过实时定量PCR方法检测海藻糖?6?磷酸合成酶基因在对虾中的转录水平，可以将其应用于评价对虾抗高渗的能力，为其在对虾良种选育与种质资源评价等领域提供信息和方法。
【专利说明】
南美白对虾海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其检测与应用
技术领域
[0001 ] 本发明涉及海藻糖，尤其是涉及南美白对奸(Litopenaeus vannamei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其检测与应用。
【背景技术】
[0002] 海藻糖是一种天然、安全的糖类，它由两个葡萄糖分子以a，a-l，l_糖苷键构成的 非还原性糖，自身性质非常稳定，具有优良的抗逆保护等特殊的生物学功能。许多在逆性环 境下（如干燥脱水、高温、冷冻、高渗等状态)表现非凡耐受力的生物物种，都与它们体内合 成、积累大量海藻糖有直接的关系。海藻糖通过保护生物膜、蛋白质等大分子不被变性失 活，来维持生命体的生命过程和生物特征。外源性的海藻糖对生物体和生物膜、蛋白质等大 分子同样具有突出的保护作用，使得海藻糖可作为生物和医学领域的活性大分子的优良保 护剂，并且在食品加工领域也发挥作用。海藻糖-6-磷酸合成酶是海藻糖合成途径中的关键 酶，对该酶基因的克隆和研究，有助于实现海藻糖在生物体内的富集，是人们研究海藻糖合 成途径的关注点。
[0003] 我国养殖对虾面临种质退化严重、养殖地域环境差异大、主要养殖种类遗传多样 性下降、生长慢且规格不均一、品种抗逆性差(包括耐氨氮和密度胁迫等)等问题。健康优质 苗种繁育缺乏统一的规范和标准，良种配套养殖技术研究滞后，因地域环境差异大，良种示 范推广效果差强人意。另外，近年来，由于一些对虾养殖地区饱受厄尔尼诺之苦，夏季持续 的干旱无雨，使得海区盐度连连爆表，盐度已经突破35%。大关，更有甚者池塘盐度在40% 〇上 下徘徊，这给海水养虾埋下了不少隐患。因此，利用检测海藻糖-6-磷酸合成酶转录水平作 为对虾抗高渗、抗逆评价的方法，将有助于对虾良种选育与种质资源评价。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合 成酶基因；
[0005] 本发明的第二个目的是提供南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合 成酶蛋白序列；
[0006] 本发明的第三个目的是提供南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合 成酶的基因转录水平的检测方法。
[0007] 本发明的第四个目的是提供南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合 成酶在评价对奸抗高渗的应用。
[0008] 所述南美白对奸1^1:〇口61^6118 vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps的分子 类型为cDNA，序列特征:长度为2535bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述南 美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps的序列如下所示，记为 SEQ ID No.l：
[0011] 南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因其核苷酸序列采用 以下方法获得:提取南美白对奸Li topenaeus vannamei的RNA，并将RNA反转录成cDNA，进一 步以cDNA为模板，经PCR扩增得到SEQ ID No. 1的序列；相关的核苷酸序列通过预测获得基 因编码的多肽SEQ ID No.2:
[0014] 南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶LvTPS的分子类型为蛋 白质，序列特征:长度为844aa，类型为氨基酸，所述南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻 糖-6-磷酸合成酶LvTPS的序列如下所示，记为SEQ ID No.2。
[0015] 南美白vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps的检测方法， 包括以下步骤：
[0016] 一个南美白对奸Litopenaeus vannamei总RNA提取的步骤；
[0017] 一个南美白对it!下Litopenaeus vannamei cDNA反转录的步骤；
[0018] 一个南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因转录水平的检 测步骤。
[0019] 所述南美白对ifLitopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因的核苷酸序列 采用以下方法获得:提取南美白对奸Li topenaeus vannamei的RNA，并将RNA反转录成cDNA， 进一步以cDNA为模板，经PCR扩增得到SEQ ID No. 1的序列。根据核苷酸序列设计最佳的引 物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4,用于实时定量PCR方法，检测基因的转录表达水平。
[0020] 所述引物序列SEQ ID No.3:ACAGGTGATTCCCGTGAGGCTGCCT
[0021] 所述引物序列SEQ ID No.4:AATGCTCGTTGACTTGCCTGTAAGC
[0022] 本发明通过提取南美白对奸Litopenaeus vannamei的总RNA，进行逆转录，通过引 物扩增和鉴定了 1个海藻糖-6-磷酸合成酶基因，根据该序列信息，设计最佳的引物，用于实 时定量PCR方法，为检测该基因在对虾中的转录表达水平提供了基础。通过实时定量PCR方 法检测海藻糖-6-磷酸合成酶基因在对虾中的转录水平，可以将其应用于评价对虾抗高渗 的能力，为其在对虾良种选育与种质资源评价等领域提供信息和方法。
[0023] 本发明以南美白对奸Litopenaeus vannamei为研究材料，对高盐度对4下与低盐度 虾的基因转录表达差异进行比较研究，筛选获得了一种海藻糖-6-磷酸合成酶基因。研究发 现高盐度对虾中该基因转录表达水平明显高于低盐度虾，平均达到2倍以上水平，说明南美 白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶的表达与对奸抗高渗存在密切的联 系，具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0024] 图1为南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因实时定量PCR 扩增产物的琼脂糖电泳图谱（1: lkb DNA Marker;2:以对虾cDNA为模版的PCR产物）。
[0025] 图2为南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因实时定量PCR 扩增产物的溶解曲线图谱。
[0026] 图3为南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因在高盐度对 虾与低盐度对虾中转录水平的情况(高盐度对虾为养殖于盐度32%。的海水中对虾，低盐度 对虾为养殖于盐度5%。的海水中对虾）。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如分子克隆实验室手册（1、萨姆布鲁克，拉塞尔（著），黄培堂(译），《分子克隆实验指南》， 科学出版社，2002年，第三版.）中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条 件。
[0028] 为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是：
[0029] 1 ·南美白对it!下Litopenaeus vannamei总RNA的提取
[0030] 取100mg南美白对奸1^1:〇口61^6118 vannamei肌肉组织，加入液氮磨成粉末，加入 lmL TRIzol (Invitrogen公司）混勾后转入1 · 5mL离心管，室温静置5min裂解细胞；加入 0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置10min;4°C，12000g离心15min;将上层液体转移至一新 的无 RNase离心管中，加入0.5mL异丙醇，混勾，室温放置8min; 4°C，12000g离心10min;弃去 液体，加入lmL 75 %乙醇漂洗;4°C，7500g离心5min;弃去液体，沉淀稍加干燥后溶于适量 RNase-free的水中；用微量紫外分光光度计测量总RNA在0D23Q、0D26Q和0D 28Q的吸光度，判定 总RNA的浓度与纯度。
[0031 ] 2.南美白对奸1^1:〇卩611&6118 vannamei cDNA反转录
[0032] 在0.5mL离心管制备cDNA反转录反应液，包括2yg总RNA，lyL 6mer随机引物 (200ng)，lyL dNTP(lOmM)，用DEPC处理过的H20将总体积补至13yL;反应体系65°C处理 5min，立即放入冰浴中lmin;稍离心，加入下列组分:4yL 5 X First-Strand Buffer，lyL DTT(0.1M)，lyL RNase Inhibitor(40U/yL)(TaKaRa公司）和lyL Superscript? III reverse transcriptase(20〇υ/μυ (Invitrogen公司）；反应体系轻弹混勾，稍离心；25°C 5min，50°C 温育 60min，70°C 处理 15min 终止反应。
[0033] 3·南美白对4下1^1:〇口611&6118 vannamei海藻糖_6_磷酸合成酶基因 Lvtps的PCR扩增
[0034] 以南美白对奸Litopenaeus vannamei cDNA为模板，通过引物分别扩增得到海藻 糖-6-磷酸合成酶基因的开放阅读框。
[0035] 在25yL的反应体系中含lyL模板，lyL正反引物（20yM)，2yL dNTP(各2.5mM)，5yL 5 XPrimerSTAR? Buffer，0.5yL PrimerSTAR? HS DNA Polymerase(2.5UAxL)(TaKARa公 司），用H20将总体积补至25μΙ^ΡΟ?反应条件为 ：98°C10s、58°C10s、72°C2min(30cycles);4 °C保存。PCR产物经纯化后与T载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞ToplO中，菌落PCR后选 取有DNA片段的阳性克隆测序。
[0036] 根据扩增获得的核苷酸序列推导出氨基酸序列，分别含有844个氨基酸的多肽，其 氨基酸序列详见SEQ ID No.2。
[0037] 4.南美白对奸1^1：(^61136118 vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps转录水平 的检测方法
[0038] 正向引物：ACAGGTGATTCCCGTGAGGCTGCCT(SEQ ID Νο·3)
[0039] 反向引物：AATGCTCGTTGACTTGCCTGTAAGC(SEQ ID Νο·4)
[0040] 在20yL的反应体系中含模板，0.5yL正向引物（20μΜ)，0.5μL反向引物（20μΜ)， 0.5yLSYBR_Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)(2X)(TaKARa公司），用Η20将总体积补至 20μΙ^ΡΟ?反应条件为：95°(：158、55 1€2〇8、721€2〇8(3(^7(3168);4°(：保存。以南美白对虾 Litopenaeus vannamei看家基因 tubulin的转录水平作为内参对照。
[0041 ] 5.南美白vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因对盐度变化的响 应
[0042] 从对虾养殖场(海水盐度2.8 % )取回凡纳滨对虾后，在高盐池和低盐池中分别对 对虾进行驯养，每天提高或降低〇. 2 %，直至盐度分别达到3.2 %或0.5 %，待对虾充分适应 环境后，分别各取高盐虾和低盐虾5只，取肌肉组织液氮冻存，提取总RNA，去除基因组DNA， 反转录为cDNA，通过实时定量PCR确定不同盐度环境对虾海藻糖-6-磷酸合成酶基因的转录 表达水平，发现该基因在高盐度对虾中水平较高（图1、2、3)，推测其与对虾抗高渗相关。该 基因和检测方法能够被作为评价对虾抗渗能力的指标应用。
【主权项】
1 ·南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps，其特征在于其 分子类型为cDNA，序列特征:长度为2535bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所 述南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps的序列如下所示，记 为SEQID No.l:2.如权利要求1所述南美白对奸1^1：(^61136113￥3111131116；[海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps，其特征在于其核苷酸序列采用以下方法获得：提取南美白对奸Litopenaeus vannamei的RNA，并将RNA反转录成cDNA，进一步以cDNA为模板，经PCR扩增得到SEQ ID No. 1 的序列；相关的核苷酸序列通过预测获得基因编码的多肽SEQ ID No.2:3 ·南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶LvTPS，其特征在于其分子 类型为蛋白质，序列特征：长度为844aa，类型为氨基酸，所述南美白对虾 Litopenaeusvannamei海藻糖_6_磷酸合成酶LvTPS的序列为SEQ ID Νο·2。 4 ·南美白vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps的检测方法，其 特征在于包括以下步骤： 一个南美白对奸Litopenaeus vannamei总RNA提取的步骤； 一个南美白对奸Litopenaeus vannamei cDNA反转录的步骤； 一个南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因转录水平的检测步 骤。5. 南美白对奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因的核苷酸序列，其特 征在于采用以下方法获得:提取南美白对奸Litopenaeus vannamei的RNA，并将RNA反转录 成cDNA，进一步以cDNA为模板，经PCR扩增得到SEQ ID No. 1的序列。根据核苷酸序列设计最 佳的引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4,用于实时定量PCR方法，检测基因的转录表达水平： 所述引物序列SEQ ID No.3:ACAGGTGATTCCCGTGAGGCTGCCT 所述引物序列SEQ ID No.4:AATGCTCGTTGACTTGCCTGTAAGC。6. 如权利要求1所述南美白对奸1^1：(^61136113￥3111131116；[海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps在评价对奸抗高渗能力中应用。7. 如权利要求1所述南美白对奸1^1：(^61136113￥3111131116；[海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps在对虾良种选育与种质资源评价中应用。
【文档编号】C12N9/10GK105950637SQ201610489793
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】阮灵伟, 施泓, 徐洵
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所