转基因作物中新霉素磷酸转移酶(nptⅱ)双抗体夹心elisa定量检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT?II)双抗体夹心ELISA定量检测方法，该检测方法是以体外条件下制备NPT?II蛋白为免疫原，制备兔抗NPT?II多克隆抗体为包被抗体，鼠抗NPT?II单克隆抗体作为捕获抗体，建立并优化了双抗体夹心ELISA方法，以系列含量的NPT?II蛋白作为标准，建立标准曲线，并对该方法各项指标进行验证。具体包括以下步骤：(1)NPT?II基因的克隆与表达；(2)抗NPTII蛋白单克隆抗体的制备；(3)抗NPTII蛋白多克隆抗体的制备；(4)双抗体夹心ELISA方法及标准曲线的建立；该方法灵敏度高、特异性强，并具有良好的重复性和稳定性，操作简单，适用于检测转基因作物中NPT?II含量。
【专利说明】转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II )双抗体夹心ELISA定量检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学及生物【技术领域】，具体涉及一种转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II )双抗体夹心ELISA定量检测方法。
【背景技术】
[0002]自1983年第一例转基因植物问世以来，植物转基因技术为农业生产带来一场新的革命。它克服了传统育种的局限性，打破了物种间遗传壁垒，加快了种质改良进程，取得显著的经济和社会效益。全球转基因作物的种植面积持续扩大，转基因作物的品种也在不断增加。
[0003]但转基因生物安全，尤其是含有抗生素基因的转基因作物的安全问题逐渐成为各国政府、科学界和社会公众关注的焦点。尽管现在的一些研究表明卡那霉素抗性基因是安全的，但有研究表明在叶围土壤中发现并证实了与NPT II基因序列同源性100%阳性片段，而认为转基因抗虫棉中的NPT II能够向叶围细菌漂移，所以尚不能对此下结论。而且世界上首例释放上市的转基因植物距今时间并不长，考虑到转基因产品风险的出现具有长期的滞后性，其长期效应如何、风险性可能有多大等问题目前还无法得出最终的结论，有必要对其进行长期的跟踪监测。
【发明内容】
[0004]为解决上述现有技术的不足，本发明建立了灵敏度高、特异性强、重复性良好、操作简单、快速的转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II )双抗体夹心ELISA定量检测方法，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，为转基因植物的检测提供保障，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。
[0005]为达到上述目的，本发明的技术方案为:
[0006]转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II )双抗体夹心ELISA定量检测方法，包括如下步骤:
[0007](I) NPT II基因的克隆与表达；
[0008](2)抗NPT II蛋白单克隆抗体的制备；
[0009](3)抗NPT II蛋白多克隆抗体的制备；
[0010](4)双抗体夹心ELISA方法及标准曲线的建立；
[0011]通过方阵滴定实验确定包被抗体的最佳包被浓度和酶标抗体的最佳稀释浓度并对ELISA条件进行摸索和优化，最终确定如下体系:
[0012]①用0.1M碳酸盐缓冲液作为抗原包被液将兔多抗体稀释至1:2000 ; 100 μ L /孔包被ELISA板，4°C过夜；
[0013]②用含0.05%Tween20的PBST洗涤液洗涤3次，每孔加入含5%脱脂奶粉的PBST溶液封闭液200 μ L，37°C封闭Ih ；[0014]③用PBST洗涤液洗涤3次后加入待检样品，IOOuL /孔，同时用阴性血清作对照，37 V反应Ih ；
[0015]④3次洗涤后加入100 μ L单抗(1:2500)，37°C反应Ih ;
[0016]⑤用PBST洗涤3次，加入I:5000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG，37°C反应lh，PBST洗涤3次，最后加入100 μ L可溶性TMB底物显色液，室温条件避光反应20min，用2MH2SOJ*止反应，利用酶标仪在450nm下测定吸光值，以抗原浓度为横坐标，以A / '(A为标准蛋白吸光度，Atl为阴性对照吸光度)值为纵坐标，绘制曲线图，根据曲线图最佳线性范围，建立标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中NPTII蛋白浓度。
[0017]所述抗NPT II蛋白单克隆抗体的制备方法为:
[0018]①选择与骨髓瘤细胞Sp2 / O同源的4-6周龄纯系雌性BALB / c小鼠作为免疫动物；
[0019]免疫方案:初次免疫为100 μ g纯化后的NPT II蛋白与等体积弗式完全佐剂乳化完全，小鼠背部皮下多点注射；3周和6周后，取IOOyg NPT II蛋白与等体积弗式不完全佐剂乳化完全，背部皮下多点注射作为第二、三次免疫；融合前四天，腹腔注射100μ g不加佐剂的NPT II蛋白，为加强免疫；
[0020]②加强免疫4天后,取小鼠脾细胞与Sp2 / O骨髓瘤细胞利用PEG1500进行化学法融合，间接ELISA方法检测细胞培养板上的阳性孔，经过三次亚克隆，扩大培养并及时冻存稳定分泌抗NPT II蛋白的杂交瘤细胞株，并利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒确定单克隆抗体的亚型；Western_blot验证单克隆抗体的特异性；
[0021]③选择6—8周龄雌性BALB / c小鼠，腹腔注射弗式不完全佐剂0.5mL /只，一周后注射杂交瘤细胞0.5— I X IO6个/只，7—10天后收集腹水，300 Xg离心取上清，经间接ELISA方法检测腹水效价；腹水经正辛酸-硫酸铵方法纯化后，SDS-PAGE检测纯化效果。
[0022]所述抗NPTII蛋白多克隆抗体的制备方法为；
[0023]选择6只体重约2kg的健康新西兰大耳白兔作为免疫动物，在动物房观察饲养一周；初次免疫采用2mL浓度为Img / mL的免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合并充分乳化，大腿肌肉注射；以后换用弗氏不完全佐剂，每隔2周加强免疫一次，颈背部皮下多点注射；从第3次免疫后开始，每次免疫后7天左右，用ImL无菌注射器从耳边缘静脉取血0.5mL左右，间接ELISA法测定血清效价；当抗血清达到所需的效价时，最后一次加强免疫后7—10天，在无菌状态下颈动脉采全血；于室温下静置2h，再置4°C冰箱中过夜使之充分收凝，300 X g离心取血清，经正辛酸-硫酸铵方法纯化后，SDS-PAGE检测纯化效果；
[0024]所述转基因植物为转基因棉花或木瓜。
[0025]相对于现有技术，本发明的有益效果为:
[0026](I)灵敏度高:通过建立标准曲线可知，此双抗体夹心ELISA方法的最低检测限为
1.97ng / mL。
[0027](2)特异性强:除NPT II阳性的植株蛋白提取液能检测到阳性的信号外，与PAT蛋白植株、CPTI蛋白植株、以及非转基因植株蛋白提取液等均无交叉反应。
[0028](3)重复性好:在线性范围内取108ng / mL、27ng / mL、6.75ng / mL3个浓度点，采用与标准曲线同时测定的方法，在一次实验中每个浓度点测10孔，计算批内变异系数。连续测10批次，计算批间变异系数。该检测方法的批内变异系数为(6.58±0.99) %，批间 变异系数为(7.33±1.15) %，满足批内精密度小于10%，批间精密度小于15%的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1本发明所述转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPT II )双抗体夹心ELISA定量检测方法的标准曲线。以抗原浓度为横坐标，以A / Α0(Α为标准蛋白吸光度，AO为阴性对照吸光度)值为纵坐标。
[0030]图2样品浓度的自然对数与A / Α0(Α为检测样品蛋白吸光度，AO为阴性对照吸光度)之间的线性方程。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和具体实施例对本发明方法做进一步详细说明，但下文所述不用来限制本发明范围，凡本领域技术人员在本发明精神及实质下，对本发明方法，条件或步骤所做的替换和修改均属于本发明范围:
[0032]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0033]实施例中所用的试剂、器材及其来源:表达载体pET28a、pET30a购自德国Novagen公司；pMD18-T购自大连宝生物公司；PCR产物回收试剂盒购自美国OMEGA Bio-Tek公司；限制性内切酶 Bam HI 和 Hind III 购自 Fermentas 公司；High Affinity N1-1DA Resin 购自南京金斯瑞公司；弗式完全佐剂与弗式不完全佐剂、IPTG、Tween20均购自美国Sigma公司；ant1-His Tag兔多抗、羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠IgG-HRP均购自杭州华宝公司；购自杭州华宝公司；融合剂PEG1500购自德国Roche公司；其他所用化学试剂均为分析纯。BL21(DE3)和Sp2 / O瘤细胞株由本实验室保存。
[0034]PCR仪、移液器购自德国eppendorf公司；电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司；凝胶成像分析系统购自美国BIO-RAD公司；Heal Force C02恒温培养箱购自力康生物医疗科技控股有限公司；细胞培养板(6孔、24孔、96孔)、细胞冻存管、15mL细胞离心管、50mL细胞离心管购自美国Corning-Coster公司；高速水平离心机购自美国BECKMAN公司；紫外可见分光光度计购自美国Unico公司。
[0035]实施例1、NPT II基因的克隆与表达
[0036]根据NPTII基因的全编码区序列和pET28a载体上的阅读框和多克隆位点，设计引物(上游引物 5’-CGCGGATCCATGAGCCATATTCAACG-3’；下游引物:5 ’-CCCAAGCTTCATATGTATCCGCTCAT-3’)，以pET30a质粒为模板，扩增条件为94°C5min ；94°C 30s, 54°C 30s, 72°C lmin，36个循环；72°C延伸7min。得到的PCR产物经回收试剂盒纯化，与pMD18_T连接测序。测序正确的重组质粒经过BamHI和HindIII双酶切，连接到经同样双酶切的表达质粒pET28a上，转化表达感受态细胞BL21(DE3)中，经过IPTG诱导，外源基因表达情况经12% SDS-PAGE电泳分析。菌体超声破碎后，经High Affinity N1-1DA Resin纯化,利用抗his标签抗体，Western一blot 验证。
[0037]实施例2、NPT II蛋白单克隆抗体的制备
[0038]选择与骨髓瘤细胞Sp2 / O同源的纯系雌性BALB / c小鼠(4_6周龄)作为免疫动物，免疫方案:初次免疫为100 μ g纯化后的NPTII蛋白与等体积弗式完全佐剂乳化完全，小鼠背部皮下多点注射；3周和6周后，取IOOyg NPT II蛋白与等体积弗式不完全佐剂乳化完全，背部皮下多点注射作为第二、三次免疫。融合前四天，腹腔注射100 μ g不加佐剂的NPT II蛋白。细胞利用PEG1500进行化学法融合，间接ELISA方法检测细胞培养板上的阳性孔，经过三次亚克隆，扩大培养并及时冻存稳定分泌抗NPT II蛋白的杂交瘤细胞株，并利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒确定单克隆抗体的亚型。Western-blot验证单克隆抗体的特异性。
[0039]选择6— 8周龄雌性BALB / c小鼠，腹腔注射弗式不完全佐剂0.5mL /只，一周后注射杂交瘤细胞0.5-1 X IO6个/只，7 —10天后收集腹水，300Xg离心取上清，经间接ELISA方法检测腹水效价。腹水经正辛酸-硫酸铵方法纯化后，SDS—PAGE检测纯化效果。
[0040]实施例3、抗NPT II蛋白多克隆抗体的制备
[0041]选择6只体重约2kg的健康新西兰大耳白兔作为免疫动物，在动物房观察饲养一周。初次免疫2mL免疫原(lmg / mL)与等量的弗氏完全佐剂混合并充分乳化，大腿肌肉注射；以后换用弗氏不完全佐剂，每隔2周加强免疫一次，颈背部皮下多点注射。从第3次免疫后开始，每次免疫后7天左右，用ImL无菌注射器从耳边缘静脉取血0.5mL左右，间接ELISA法测定血清效价。当抗血清达到所需的效价时，最后一次加强免疫后7 —10天，在无菌状态下颈动脉采全血。于室温下静置2h，再置4°C冰箱中过夜使之充分收凝，300Xg离心取血清，经正辛酸-硫酸铵方法纯化后，SDS-PAGE检测纯化效果。
[0042]实施例4、双抗体夹心ELISA方法的建立
[0043]ELISA条件的优化和选择
[0044](I)配对抗体的选择
[0045]初步选择兔多抗抗4E5、2B6作为捕获抗体，单抗3E8作为检测，进一步进行最佳抗体配对的选择。将抗体4E5、2B6用抗原包被液稀释至2 μ g / mL，100 μ L /孔，4°C包被过夜，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。每孔加封闭液200 μ L，37°C封闭2h，PBST洗涤3次，每次3min,拍干。每孔加入重组NPT II蛋白IOOyL /孔(I μ g / mL), 37°C孵育30min,PBST洗涤3次，每次3min，拍干。将检测抗体3E8用封闭液稀释至I =1000,100 μ L /孔，力口到酶标板中，37°C孵育30min，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。加入可溶性TMB底物显色液，避光显色15min，每孔加入50-100 μ L2M H2SO4终止反应，在450nm处用酶标仪测定每孔OD值。以P / N值作为选择最佳配对抗体的依据。
[0046](2)包被抗体和酶标抗体最佳配对浓度确定
[0047]选择配对效果最佳的抗体，包被抗体浓度和酶标抗体工作浓度采用方针滴定方法确定，横排做捕获抗体倍比稀释，纵列做检测抗体倍比稀释，每孔加入重组NPT II蛋白(lyg / mL)作为标准品，100 μ L /孔，确定包被抗体最佳包被浓度和酶标抗体工作浓度。具体步骤如下:
[0048]①用抗原包被液按比例稀释捕获抗体至16μ g / mL，滴加到酶标板第一竖列，IOOyL /孔，其余每列孔均加入100 μ L抗原包被液，横向做倍比稀释，4°C包被过夜。
[0049]②加洗涤液PBST200 μ L /孔，洗涤3次，每次3min，拍干。
[0050]③5%脱脂乳溶液200 μ L /孔封闭非特异性结合位点，37°C封闭lh。PBST洗涤3次，每次3min,拍干。
[0051]④将纯化后的NPT II蛋白稀释至I μ g / mL，100μ L /孔，37°C温箱孵育lh，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。用非转基因棉花组织提取液作为阴性对照。[0052]⑤检测抗体用封闭液稀释100倍，加到酶标板第一横排，IOOuL /孔，其余每一横排孔加封闭液100 μ L，竖列做倍比稀释。
[0053]⑥37°C温箱孵育lh，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。
[0054]⑦加入1:5000稀释的商品化HRP标记的羊抗鼠IgG,100yL /孔，37°C孵育Ih,PBST洗涤3次，每次3min，拍干。
[0055]⑧加入可溶性TMB底物100 μ L /孔，避光显色反应15min，然后加入50-100 μ L2MH2SO4终止反应，450nm处用酶标仪测定每孔OD值。
[0056]最终确定捕获抗体最佳工作浓度为1:2000，检测抗体最佳工作浓度为1:2500。
[0057](3)抗原的孵育时间和检测抗体反应时间的确定
[0058]选取3份阳性NPT II蛋白抗原，3份阴性抗原分别于37°C孵育30min、60min、2h ；酶标单抗用封闭液稀释至最佳工作浓度，分别于37°C孵育30min,45min,60min ;显色并终止后，450nm处用酶标仪测定每孔OD值，根据P / N值确定抗原孵育时间和检测抗体孵育时间。
[0059]最终确定抗原孵育时间和检测抗体孵育时间均为60min。
[0060](4)封闭液的优化
[0061]以捕获抗体最佳包被浓度包被酶标板，以最佳工作浓度稀释酶标抗体，分别用
0.5% BSA，1% BSA，5%脱脂乳做为封闭液。选取3份阳性NPT II蛋白抗原，3份阴性抗原，测定其在450nm处的OD值，根据P / N值确定合适的封闭液。
[0062]最终确定最优封闭 液为5%脱脂乳。
[0063]通过方阵滴定实验确定包被抗体的最佳包被浓度和酶标抗体的最佳稀释浓度并对ELISA条件进行摸索和优化，最终确定如下体系:(I)用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将兔多抗体稀释至1:2000。IOOyL /孔包被ELISA板，4°C过夜。(2)用洗涤液(0.5mL / L Tween20,pH7.4PBST)洗涤3次，每孔加入含5%脱脂奶粉的PBST溶液封闭液200yL，37°C封闭lh。(3)用PBST洗涤液洗涤3次后加入待检样品，100 μ L /孔，同时用阴性血清作对照，37°C反应lh。(4) 3次洗涤后加入100 μ L单抗(1:2500)，37°C反应lh。
(5)用PBST洗涤3次，加入I:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C反应lh, PBST洗涤3次，最后加入100 μ L可溶性TMB底物显色液，室温条件避光反应20min，用2M H2SO4终止反应，450nm处读取吸光值。
[0064]实施例5、双抗体夹心ELISA方法的考核
[0065](I)检测限:计算20个阴性孔的平均值(X)和标准差(S)，以x+3s从滴定曲线中找到该相应值的最低浓度，即为方法的检测限，根据标准曲线相关系数!.> 0.99的线性相关的部分确定最佳检测范围。
[0066](2)精密度:在线性范围内取108ng / mL、27ng / mL、6.75ng / mL3个浓度点，采用与标准曲线同时测定的方法，在一次实验中每个浓度点测10孔，计算批内变异系数。连续测10批次，计算批间变异系数。该检测方法的批内变异系数为(6.58±0.99)%，批间变异系数为(7.33±1.15) %，满足批内精密度小于10%，批间精密度小于15%的要求。
[0067](3)特异性:用建立的ELISA分别检测新霉素磷酸转移酶阳性样品20份，阴性样品10份，其他蛋白阳性样品及阴性对照10份，检测ELISA的特异性。结果显示，除NPTII阳性的植株蛋白提取液能检测到阳性的信号外，与PAT蛋白植株、CPTI蛋白植株、以及非转基因植株蛋白提取液等均无交叉反应。
[0068](4)回收率:在空白检测基质中加入高(108ng / mL)、中(27ng / mL)、低(6.75ng / mL)不同剂量的NPT II，按检测程序测定，计算实测值与理论值比值，求出平均回收率。结果说明本方法能敏感地检测出NPTII蛋白，回收率分别为104.69%、96.11%和103.26%，满足要求。
[0069]实施例6、已知浓度NPTII蛋白标准品的检测。
[0070]1、NPTII蛋白标准品的制备
[0071]①取非转基因苗期棉株新展开叶Ig加入2.5mL蛋白质提取液(1M Tris-Hcl pH8、甘油、聚乙烯吡咯烷酮)用液氮研磨；
[0072]②研磨后再加入3.5mL蛋白质提取液冲洗研钵；
[0073]③冰面放置4h，800 Xg离心20min，取上清。
[0074]④将外源制备的NPTII蛋白(C=1730ng / mL)按比例加入到非转基因棉株蛋白提取液中，建立三个浓度点:108ng / mL、27ng / mL、6.75ng / mL。
[0075]2、双抗体夹心ELISA方法检测
[0076]①用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将兔多抗体稀释至1:2000。IOOyL /孔包被ELISA板，4°C过夜。
[0077]②用洗涤液(0.5mL / L Tween20, pH7.4PBST)洗涤3次，每孔加入含5%脱脂奶粉的PBST溶液封闭液200 μ L，37°C封闭Ih。
[0078]③用PBST洗涤液洗涤3次后加入待检样品，IOOuL /孔，同时用阴性血清作对照，37°C 反应 Ih。
[0079]④3次洗涤后加入100 μ L单抗(1:2500)，37°C反应lh。
[0080]⑤用PBST洗涤3次，加入I:5000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG，37°C反应Ih，PBST洗涤3次，最后加入100 μ L可溶性TMB底物显色液，室温条件避光反应20min，用2M H2SO4终止反应，450nm处读取吸光值。每个浓度点重复检测5次。以抗原浓度为横坐标，以A /A0(A为标准蛋白吸光度，A0为阴性对照吸光度)值为纵坐标，绘制曲线图，根据曲线图最佳线性范围，建立标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中NPTII蛋白浓度。
[0081]由图1得知，标准品的浓度与可检测到吸光度信号的循环数呈显著的线性关系，其相关系数R2=0.998，线性方程为y=3.4766χ_2.1616，有效检测范围为3.37-108.125ng /mL(如图2)。此双抗体夹心ELISA方法的最低检测限为1.97ng / mL。结果说明本方法能敏感地检测出NPTII蛋白，回收率分别为104.69%、96.11%和103.26%，满足要求。
[0082]实施例7:以转基因抗虫棉GK19为检测材料，并以非转基因棉株蛋白为阴性对照。
[0083]1、植物蛋白的提取
[0084]①取GK19苗期棉株功能叶Ig加入2.5mL蛋白质提取液(1M Tris-Hcl pH8、甘油、聚乙烯吡咯烷酮)用液氮研磨；
[0085]②研磨后再加入3.5mL蛋白质提取液冲洗研钵；
[0086]③冰面放置4h，800 Xg离心20min，上清作为夹心ELISA方法的待检溶液。
[0087]2、双抗体夹心ELISA方法检测
[0088]①用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将兔多抗体稀释至1:2000。IOOyL /孔包被ELISA板，4°C过夜。[0089]②用洗涤液(0.5mL / L Tween20, pH7.4PBST)洗涤3次，每孔加入含5%脱脂奶粉的PBST溶液封闭液200 μ L，37°C封闭Ih。
[0090]③用PBST洗涤液洗涤3次后加入待检样品，IOOuL /孔，同时用阴性血清作对照，37°C 反应 Ih。
[0091]④3次洗涤后加入100 μ L单抗(1:2500)，37°C反应lh。
[0092]⑤用PBST洗涤3次，加入1:5000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG，37°C反应Ih，PBST洗涤3次，最后加入100 μ L可溶性TMB底物显色液，室温条件避光反应20min，用2M H2SO4终止反应，450nm处读取吸光值。
[0093]结果
[0094]样品10次重复测定，OD45tl平均值A=2.61，阴性对照平均值AO=0.19，根据标准曲线代入标准方程可得GK19苗期功能叶含量平均达到580.24ng / g.Fw。
[0095]实施例8:以华农I号番木瓜为检测材料，并以非转基因木瓜叶蛋白为阴性对照。
[0096]1、植物蛋白的提取
[0097]①取番木瓜苗期新展开叶Ig加入2.5mL蛋白质提取液(1M Tris—Hcl pH8、甘油、聚乙烯吡咯烷酮)用液氮研磨；
[0098]②研磨后再加入3.5mL蛋白质提取液冲洗研钵；
[0099]③冰面放置4h，800 Xg离心20min，上清作为夹心ELISA方法的待检溶液。
[0100]2、双抗体夹心ELISA方法检测
[0101]①用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将兔多抗体稀释至1:2000。IOOyL /孔包被ELISA板，4°C过夜。
[0102]②用洗涤液(0.5mL / L Tween20, ρΗ7.4PBST)洗涤3次，每孔加入含5%脱脂奶粉的PBST溶液封闭液200 μ L，37°C封闭Ih。
[0103]③用PBST洗涤液洗涤3次后加入待检样品，IOOuL /孔，同时用阴性血清作对照，37°C 反应 Ih。
[0104]④3次洗涤后加入100 μ L单抗(1:2500)，37°C反应lh。
[0105]⑤用PBST洗涤3次，加入I:5000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG，37°C反应Ih，PBST洗涤3次，最后加入100 μ L可溶性TMB底物显色液，室温条件避光反应20min，用2M H2S04终止反应，450nm处读取吸光值。
[0106]结果
[0107]样品10次重复测定，OD45tl平均值A=2.28，阴性对照平均值AO=0.19，根据标准曲线代入标准方程可得华农I号番木瓜苗期功能叶含量平均达到351.36ng / g.Fw。
[0108]结果说明本方法能有效地检测转基因抗虫棉GK19及华农I号番木瓜苗期叶片NPTII表达量。
【权利要求】
1.转基因作物中新霉素磷酸转移酶(NPTII)双抗体夹心ELISA定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)NPTII基因的克隆与表达； (2)抗NPTII蛋白单克隆抗体的制备； (3)抗NPTII蛋白多克隆抗体的制备； (4)双抗体夹心ELISA方法及标准曲线的建立； 通过方阵滴定实验确定包被抗体的最佳包被浓度和酶标抗体的最佳稀释浓度并对ELISA条件进行摸索和优化，最终确定如下体系: ①用0.1M的碳酸盐缓冲液作为抗原包被液将兔多抗体稀释至1:2000 ;100μ L /孔包被ELISA板，4°C过夜； ②用含0.05% Tween20的PBST溶液洗涤3次，每孔加入含5%脱脂奶粉的PBST溶液封闭液200yL，37°C封闭Ih ； ③用PBST洗涤液洗涤3次后加入待检样品，IOOyL/孔，同时用阴性血清作对照，37°C反应Ih ； ④3次洗涤后加入100μ L单抗(I:2500)，37°C反应Ih ； ⑤用PBST洗涤3次，加入I:5000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG，37°C反应lh，PBST洗涤3次，最后加入100 μ L可溶性TMB底物显色液，室温条件避光反应20min，用2M H2SO4终止反应，利用酶标仪在450nm下测定吸光值，以抗原浓度为横坐标，以A / A0（A为标准蛋白吸光度，Atl为阴性对照吸光度)值为纵坐标，绘制曲线图，根据曲线图最佳线性范围，建立标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中NPTII蛋白浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗NPTII蛋白单克隆抗体的制备方法为: ①选择与骨髓瘤细胞Sp2/ O同源的4一6周龄纯系雌性BALB / c小鼠作为免疫动物； 免疫方案:初次免疫为100 μ g纯化后的NPTII蛋白与等体积弗式完全佐剂乳化完全，小鼠背部皮下多点注射；3周和6周后，取100 μ g NPTII蛋白与等体积弗式不完全佐剂乳化完全，背部皮下多点注射作为第二、三次免疫；融合前四天，腹腔注射100 μ g不加佐剂的NPTII蛋白，为加强免疫； ②加强免疫4天后,取小鼠脾细胞与Sp2/ O骨髓瘤细胞利用PEG1500进行化学法融合，间接ELISA方法检测细胞培养板上的阳性孔，经过三次亚克隆，扩大培养并及时冻存稳定分泌抗NPTII蛋白的杂交瘤细胞株，并利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒确定单克隆抗体的亚型；Western_blot验证单克隆抗体的特异性； ③选择6—8周龄雌性BALB/ c小鼠，腹腔注射弗式不完全佐剂0.5mL /只，一周后注射杂交瘤细胞0.5—1 X IO6个/只，7 —10天后收集腹水，300 X g离心取上清，经间接ELISA方法检测腹水效价；腹水经正辛酸-硫酸铵方法纯化后，SDS-PAGE检测纯化效果。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗NPTII蛋白多克隆抗体的制备方法为； 选择6只体重约2kg的健康新西兰大耳白兔作为免疫动物，在动物房观察饲养一周；初次免疫采用2mL浓度为Img / mL的免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合并充分乳化，大腿肌肉注射；以后换用弗氏不完全佐剂，每隔2周加强免疫一次，颈背部皮下多点注射；从第3次免疫后开始，每次免疫后7天左右，用ImL无菌注射器从耳边缘静脉取血0.5mL左右，间接ELISA法测定血清效价；当抗血清达到所需的效价时，最后一次加强免疫后7 —10天，在无菌状态下颈动脉采全血；于室温下静置2h，再置4°C冰箱中过夜使之充分收凝，300 X g离心取血清，经正辛酸-硫酸铵方法纯化后，SDS-PAGE检测纯化效果；
4.根据1 -3任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述转基因植物为转基因棉花或木瓜。
【文档编号】C07K16/40GK103454424SQ201310365343
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】柴同杰, 王新桐 申请人:山东农业大学