专利名称：包含磷酸酮醇酶的重组宿主细胞的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及エ业微生物领域。本发明涉及重组宿主细胞，其包含(i)编码多肽的内源性基因中的修饰，所述多肽将丙酮酸转化为こ酰_CoA、こ醛或こ酰-磷酸，和(ii)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明也涉及重组宿主细胞，其包含
(i)编码具有丙酮酸脱羧酶(PDC)·活性的多肽的内源性基因中的修饰或具有PDC活性的内源性多肽中的修饰，和(ii)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明也涉及重组宿主细胞，其还包含(iii)编码具有磷酸转こ酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。此外，本发明涉及制备和使用此类重组宿主细胞的方法，包括例如增加细胞生长的方法、降低或消除细胞生长对外源碳底物的需求的方法、増加葡萄糖消耗的方法、以及增加产生利用丙酮酸的途径的产物的方法。
背景技术：
全球对液态运输燃料的需求预计将对实现某些环境方面驱动的目标的能力造成压力，例如石油储量的保持和温室气体排放的限制。此类需求驱动了科技的发展，其允许利用可再生资源以減少石油储量的消耗和并尽量減少温室气体的排放。丁醇是ー种重要的エ业化学品，其可用作燃料添加剤、塑料エ业中的化学原料以及食品和香料エ业中的食品级提取剂。毎年，通过石油化学手段生产100至120亿磅的丁醇，并且对该日用化学品的需求将来很可能还会增加。化学合成的异丁醇方法是已知的，如羰基合成、一氧化碳的催化氢化(Ullmann’ sEncyclopedia of Industrial 01611118廿7,第6版，2003,￥;[167~\01 Verlag GmbH and C0.,ffeinheim, Germany,第5卷,第716-719页)和甲醇与正丙醇的格尔伯特缩合(Carlini等人，J.Molec.Catal.A:Chem.220:215-220，2004)。这些エ艺利用衍生自石油化学产品的起始材料并通常昂贵，并且对环境不友好。用衍生自植物的原材料生产异丁醇将会使温室气体排放达到最低程度并将代表本领域的进步。2- 丁酮，也被称为甲基こ基酮(MEK)，是被广泛使用的溶剤，并且是继丙酮之后最重要的商品化生产的酮。它被用作用于漆料、树脂和粘合剂的溶剤、以及选择性提取剂、氧化反应的活化剂，并且它可在催化剂的存在下通过与氢反应而化学地转化为2- 丁醇(Nystrom, R.F.和 Brown,ff.G.(J.Am.Chem.Soc.(1947)69:1198)。2, 3- 丁ニ醇可被用于丁烯和丁ニ烯(二者是重要的化工原料，目前由裂化石油获得)的化学合成中，并且2，3-丁ニ醇的酯可被用作增塑剂(Voloch等人,“Fermentation Derived2, 3-Butanediol, ”Comprehensive Biotechnology,Pergamon Press Ltd.,England,第 2 卷，第 3 节:933-947(1986))。微生物可被工程化以表达生物合成途径，其起始利用细胞的丙酮酸来产生，例如2，3- 丁二醇、2- 丁酮、2- 丁醇和异丁醇。美国专利公开7，851，188公开了用于生产异丁醇的工程化重组微生物。美国专利申请公布US200702594IOAl和US20070292927A1公开了用于产生2-丁酮或2-丁醇的重组微生物的工程化。公开了多个用于异丁醇和2-丁醇的生物合成的途径，它们全部从细胞的丙酮酸开始。丁二醇是美国专利申请公布US20070292927A1公开的2- 丁醇途径中的中间体。在工程化表达利用丙酮酸的生物合成途径的重组宿主细胞中，对丙酮酸脱羧酶(PDC)的破坏可用于提高丙酮酸的可用性，其用于经由生物合成途径的产物形成。例如，美国专利申请公布US20070031950A1公开了带有一种或多种丙酮酸脱羧酶基因的破坏(PDC敲出或HXH(O)并且表达D-乳酸脱氢酶基因的酵母菌株，其被用于生产D-乳酸。美国专利申请公布US20050059136A1公开了没有丙酮酸脱水酶活性的葡萄糖耐受的不依赖二碳源(GCSI)的酵母菌株，其可以具有外源乳酸脱氢酶基因。Nevoigt和Stahl(Yeastl2:1331-1337 (1996))描述了在啤酒糖酵母中降低的丙酮酸脱羧酶和提高的NAD-依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶对甘油产量的影响。美国专利申请20090305363A1公开了通过工程化酵母以表达定位于胞质的乙酰乳酸合酶和基本除去丙酮酸脱羧酶活性而提高的丙酮酸至乙酰乳酸的转化。尽管roc-KO重组宿主细胞可用于生产利用丙酮酸生物合成途径的产物，PDC-KO重组宿主细胞需要外源的碳底物补充(例如，乙醇或乙酸)用于它们的生长(Flikweert 等人，1999, FEMS Microbiol.Lett.174 (I):73-79 “Growth requirementsof pyruvate-decarboxylase-negative Saccharomyces cerevisiae，，)。在带有一个或多个编码丙酮酸脱氢酶基因突变的大肠杆菌菌株中观察到了类似的营养缺陷型(Langley和Guest, 1977, J.Gen.Microbiol.99:263-276)。 在商业应用中，在转化为所需产物的底物中额外加入外源碳底物可能会导致成本增加。本领域仍存在对于重组宿主细胞的需求，其降低了或消除了对外源碳底物补充的需求。
发明内容
本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含(i)编码多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，所述多肽将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA ;和编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明的另一方面涉及此类重组宿主细胞，其还包含(iii)编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。在多个实施方案中，所述将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的多肽是丙酮酸脱羧酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含(i )编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中或具有丙酮酸脱羧酶活性的内源性多肽中的修饰jP(ii)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明的另一方面涉及此类重组宿主细胞，其还包含(iii)编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含(i )编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换jP(ii)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明的另一方面涉及重组宿主细胞，其还包含:(iii)编码具有磷酸转こ酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明的另一方面涉及与包含(i)且不包含(ii)或(iii)的重组真核宿主细胞相比，所述宿主细胞在培养物中的生长对外源ニ碳底物具有降低或消除的需求。本发明的另一方面涉及在不补充外源ニ碳底物的培养基中此类宿主细胞的生长情况与在补充外源ニ碳底物的培养基中包含(i)且不包含(ii)或(iii)的宿主细胞的生长速率基本上相等的或更高。本发明的ー个方面，所述重组宿主细胞是下列属的成员:梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus )、假单胞菌属(Pseudomonas )、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产喊菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、紐杆菌属(Brevibacterium)、裂通酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤 酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)或糖酵母属(Saccharomyces)。在本发明的另一方面，所述重组宿主细胞是啤酒糖酵母(b.cerevisiaeノ。在本发明的另一方面中，所述重组宿主细胞表达利用丙酮酸的生物合成途径，其包括例如用于生成如2，3-丁ニ醇、异丁醇、2-丁醇、2-丁酮、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、乳酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸或异戊醇产物的生物合成途径。本发明的另一方面涉及在所述重组宿主细胞中表达异丁醇生物合成途径，所述重组宿主细胞包含编码多肽的至少ー种DNA分子，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化:(i )丙酮酸至こ酰乳酸的转化；(i i )こ酰乳酸至2，3- ニ羟基异戊酸的转化；(iii) 2，3- ニ羟基异戊酸至2-酮异戊酸的转化；(iv)2-酮异戊酸至异丁醛的转化；以及(V)异丁醛至异丁醇的转化。本发明的另一方面涉及在所述重组宿主细胞中表达2- 丁酮生物合成途径，所述重组宿主细胞包含编码多肽的至少ー种DNA分子，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化:(i)丙酮酸至こ酰乳酸的转化的转化；(ii)こ酰乳酸至こ偶姻的转化；(iii)こ偶姻至2，3-丁ニ醇的转化；以及(1パ2，3-丁ニ醇至2-丁酮的转化。本发明的另一方面涉及在所述重组宿主细胞中表达2-丁醇生物合成途径，所述重组宿主细胞包含编码多肽的至少ー种DNA分子，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化:(i)丙酮酸至こ酰乳酸的转化；(ii)こ酰乳酸至こ偶姻的转化；(iii)こ偶姻至2，3- 丁ニ醇的转化；(iv) 2，3- 丁ニ醇至2- 丁酮的转化；以及(V) 2- 丁酮至2- 丁醇的转化。本发明的ー个方面涉及生产产物的方法，所述产物选自2，3-丁ニ醇、异丁醇、2_ 丁醇、2-丁酮、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、乳酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸和异戊醇，所述方法包括使本文所述的重组宿主细胞在产生所述产物的条件下生长且任选地回收所述产物。本发明的另一方面涉及制备重组宿主细胞的方法，所述方法包括用(i )编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸；以及任选地(ii)编码具有磷酸转こ酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少ー个缺失、突变和/或替换。
本发明的另一方面涉及改善重组宿主细胞的生长的方法，所述重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，所述方法包括(i )用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞；以及任选地(ii)用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。在多个实施方案中，所述方法还包括使所述重组宿主细胞在包含限制的碳底物的培养基中生长。本发明的另一方面涉及降低重组宿主细胞的生长对外源二碳底物的需求的方法，所述重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，所述方法包括(i)用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞；以及任选地(ii)用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。 本发明的另一方面涉及消除重组宿主细胞的生长对外源二碳底物的需求的方法，所述重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，所述方法包括(i)用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞；以及任选地(ii)用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述宿主细胞。本发明的另一方面涉及增加所述重组宿主细胞中磷酸酮醇酶途径的活性的方法，所述方法包括(i )提供本发明的重组宿主细胞；以及(i i )使所述重组宿主细胞在增加所述重组宿主细胞中磷酸酮醇酶途径的活性的条件下生长。在另一方面，所述重组宿主细胞包含磷酸酮醇酶，所述磷酸酮醇酶以小于
7.5E-242的E值匹配表6中给出的序型HMM。在另一方面，所述磷酸酮醇酶与SEQ IDN0:355、379、381、388、481、486、468或504中的至少一个具有至少约40%的同一性。在另一方面，所述磷酸酮醇酶与SEQID N0:355、379、381、388、481、486、468或504中的至少一个具有至少约90%的同一性。在另一方面，所述磷酸酮醇酶以小于7.5E-242U.1E-124、
2.1E_49、7.8E-37的E值分别匹配表6、7、8和9中给出的序型HMM。在另一方面，所述重组宿主细胞还包含磷酸转乙酰酶，所述磷酸转乙酰酶以小于5E-34的E值匹配表14中给出的序型HMM。在另一方面，所述磷酸转乙酰酶与SEQ ID N0:1475、1472、1453、1422、1277、1275、1206、1200、1159或1129具有至少约40%的同一性。在另一方面，所述磷酸转乙酰酶与SEQID NO: 1475、1472、1453、1422、1277、1275、1206、1200、1159 或 1129 具有至少约 90% 的同一性。
以及提供的序列表和表格本发明的各种实施方案可通过详细的描述、附图和并入的序列描述更充分的理解，这也是本专利申请的一部分。图1描绘了磷酸酮醇酶途径的示意图，其包括磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶。图2描绘了没有外源碳底物补充的表达磷酸酮醇酶和磷酸转乙酰酶的I3DC-KO酵母菌株的生长情况。图3描绘了没有外源碳底物补充的表达磷酸酮醇酶和/或磷酸转乙酰酶的I3DC-KO酵母菌株的生长情况。图4描绘了磷酸乙酰转移酶(PTA)和磷酸丁酰转移酶(PTB)序列的系统发育树。采用默认參数用Clustal X进行多重序列比对。采用邻接法推导系统发育树并用Mega4软件绘制。标记的序列如下:(编号，菌种，GI号)1，肠道沙门氏菌(S.enterica)，56412650 ；2，大肠杆菌(E.coli)K12,88192043 ;3，小韦荣菌(V.parvula), 227371784 ;4，克鲁氏梭状芽抱杆菌(C.kluyveri), 153954015 ；5,丙丽丁醇梭菌(C.Acetobutylicum), 15895019 ;6，热纤梭菌(C.thermocellum), 196254011 ;7，甲烧八叠球菌(M.thermophila),88192043 ;8，化脓性链球菌(S.pyogenes), 48425286 ;9，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，58176784 ;10，发酵乳酸杆菌(L.fermentum), 227514417 ;11，植物乳杆菌(L.plantarum)，28377658 ;12，旧金山乳杆菌(L.sanfranciscensis), 11862872。图5是本文所述的pRS426::GPD_xpkl+ADH_eutD质粒图谱。图6描绘的是BP913整合了磷酸酮醇酶途径载体(本文所述)后的Apdcl::1lvD(Sm)基因座。图7A显示了在不存在こ醇和存在こ醇以及不存在和存在所述磷酸酮醇酶途径(xpk)条件下产异丁醇菌株的生长情況。IS01、IS02和IS03是指平行測定。图7B显示了来自图7A的菌株第二次传代培养的生长情況。表6、7、8、9和14为本文所述序型HMM的表格。表6、7、8、9和14为随同文件电子提交的，并以引用方式并入本文。根据下面的详细描述和附帯的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。随同文件提供的序列表以引用方式并入本文并符合37C.F.R.1.821-1.825 (“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则(Requirements forPatent Applications Containing Nucleotide bequencesand/or Amino Acia sequenceDisclosures-the Sequence Rules)”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)以及EPO和PCT的序列列表要求(规则5.2和49.5 (a-bis),以及行政指导的208节和附录C)相一致。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§ 1.822所示的规则。电子提交的序列表的内容名称:20110615_CL4871USNA_SeqList.txt ;大小:6.67MB ；和创建/修改日期:2011年6月9日/2011年6月15日全文以引用方式并入本文。SEQ ID NO: 1-20为PDC靶基因编码区和蛋白质的序列。SEQ ID N0:21_638为磷酸酮醇酶靶基因编码区和蛋白质的序列。SEQ ID N0:762_1885为磷酸转こ酰酶靶基因编码区和蛋白质的序列。SEQ ID NO: 1893-1897为杂合启动子序列。SEQ ID N0:639-642、644-654、656-660、662-701-714、725-726、729-740、742-748和750-761为引物。SEQ ID NO:643 为载体 pRS426::GPD-xpkl+ADHl_eutD。SEQ ID NO:655 为 TEFlp-kan-TEFlt 基因。SEQ ID N0:661 为载体 pLA54。SEQ ID N0:715 为载体 pRS423::pGALl-cre。SEQ ID NO = 7I6 为载体 pLH468_sadB。
SEQ ID NO:717 和 718 为来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)sadB的氨基酸和核酸序列。
SEQ ID N0:719为来自乳酸乳球菌(L.lactis)的kivD编码区。SEQ ID NO:720 为质粒 pRS425::GPM_sadB。SEQ ID NO: 721 为 GPM 启动子。SEQ ID NO:722 为 ADHl 终止子。SEQ ID NO:723 为 GPM-sadB-ADHt 片段。SEQ ID N0:724 为 pUC19-URA3 质粒。SEQ ID NO:741 为 iIvD-FBAIt 片段。SEQ ID NO: 749 为 URA:3r2 模板 DNA。SEQ ID NO: 1886为来自变异链球菌(S.mutans)的iIvD编码区。SEQ ID N0:1888 为载体 pLH468。SEQ ID NO:1898 为 pUC19_URA3::pdcl::GPD_xpkl+ADHl_eutD。SEQ ID NO: 1899-1906为经修饰的啤酒糖酵母(S.cerevisiae)基因座的序列。SEQ ID NO: 1907 是 pLH702 的序列。SEQ ID NO: 1908 是 pYZ067DkivDDhADH 的序列。SEQ ID NO: 1909 是 ALD6 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 1910 是 K9D3 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 1911 是 K9G9 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 1912 是 YMR226c 的氨基酸序列。SEQ ID NO: 1913和1914是AFTl的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO: 1915和1916是AFT2的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO: 1917和1918是FRA2的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO: 1919和1920是GRX3的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO: 1921和1922是CCCl的核酸和氨基酸序列。SEQ ID NO: 1923是来自Bei jerinkia indica的乙醇脱氢酶的氨基酸序列。
具体实施方式
申请人已通过降低或消除对于提供两种底物的需求解决了所述问题，两种底物中的一种底物被转化为所需的产物，另一种底物被重组宿主细胞全部或部分地转化为乙酰-CoA，所述重组宿主细胞需要此类用于生长的补充，在此类细胞中包含所述磷酸酮醇酶途径多个酶的表达。一种此类酶，磷酸酮醇酶(酶学委员会编号EC4.1.2.9)，催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰-磷酸(Heath等人，J.Biol.Chem.231:1009-29 ；1958)。另一种此类酶为磷酸转乙酰酶(酶学委员会编号EC2.3.1.8)，其将乙酰-磷酸转化为乙酸-CoA。申请人:已提供了 PDC-KO重组宿主细胞，其包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸和任选地编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。与PDC-KO细胞相比，对用于其生长的外源二碳底物此类细胞表现出降低的或消除了的需求。申请人还提供了制备和使用此类重组宿主细胞的方法，其包括例如增加细胞生长的方法、降低或消除细胞生长对外源碳底物的需求的方法、增加葡萄糖消耗的方法、以及增加产生利用丙酮酸的途径的产物的方法。
除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一祥。如发生矛盾，以本专利申请(包括其定义)为准。除非上下文另有要求，単数术语应包括复数，并且复数术语应包括単数。本文提及的所有公布、专利和其它參考文献出于各种目的全文以引用方式并入本文，如同每ー单独的公布或专利申请均特定且个别地以引用方式并入一祥，除非仅专利或专利申请的特定部分被提及以引用方式并入本文。下文描述了合适的方法和材料，虽然在本发明的实施或试验过程中也可以使用与本文所述的那些类似或等同的方法和材料。材料、方法和实施例仅是例示性的并且不旨在进行限制。根据具体实施方式
和权利要求，本发明的其它特点和优点将显而易见。为了进一歩明确本发明，提供下列术语、縮写和定义。如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或其任何其它变型g在是非排它的或可广泛解释的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、エ艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、エ艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，以下任何ー个均表示满足条件A或B:A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“ー个”或“ー种” g在是非限制性的。因此，应将“ー个”或“ー种”理解为包括一个或至少ー个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示単数。如本文所用，术语“发明 ”或“本发明”为非限制性术语，并且不g在意指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施方案。如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化:在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异等等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语“约”指在报告数值10%范围内，优选地在报告数值5%范围内。本文所用术语“丁醇”是指2- 丁醇、1- 丁醇、异丁醇或它们的混合物。术语“利用丙酮酸的生物合成途径”是指从丙酮酸产生生物合成产物的酶途径。术语“异丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。术语“2- 丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生2- 丁醇的酶途径。术语“2- 丁酮生物合成途径”是指从丙酮酸产生2- 丁酮的酶途径。如本文所用，术语“pdc_”、“PDC敲除”或“PDC-K0”是指具有灭活或降低编码丙酮酸脱羧酶(PDC)的基因的表达的基因修饰，从而使该细胞基本上没有或完全没有丙酮酸脱羧酶酶活性。如果所述细胞具有多于ー种的表达的(活性的)PDC基因，则每个活性PDC基因可以被灭活或具有最小的表达从而产生Pdc-细胞。术语“碳底物”是指可被本文所公开的重组宿主细胞代谢的碳源。本文提供了非限制性的碳底物的实例，包括但不限于单糖、寡糖、多糖、こ醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、ニ氧化碳、甲醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖或它们的混合物。术语“外源二碳底物”是指提供的由缺乏将丙酮酸转化为乙酰-CoA的能力的宿主细胞代谢为乙酰-CoA的碳源。这个术语用于区分碳底物，其通过利用丙酮酸的生物合成途径转化为丙酮酸衍生的产物，本文也指“途径底物”，其包括例如葡萄糖。术语“多核苷酸”旨在包括单数的核酸以及复数的核酸，并且是指核酸分子或构建体例如信使RNA (mRNA)或质粒DNA (pDNA)。多核苷酸可包含全长cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译的5’和3’序列和编码序列。所述多核苷酸可由任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸组成，其可为非改性的RNA或DNA，或改性的RNA或DNA。例如，多核苷酸可由单链和双链DNA构成，其为单链和双链区域的混合物；单链和双链RNA，其为单链和双链区域的混合物；包含DNA和RNA的杂合分子，其可为单链或，更典型地双链或单链和双链区域的混合物。“多核苷酸”包含了化学地、酶学地或代谢地改性的形式。多核苷酸序列可意为“分离的”，其中它从天然的环境中移除出来。例如，包含在载体中的编码具有二羟酸脱水酶活性多肽或多肽片段的异源性多核苷酸，出于本发明的目的可被认为是分离的。分离的多核苷酸的另一个实例包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的 多核苷酸片段可由一个或多个cDNA、基因组DNA或合成DNA片段构成。术语“基因”指可被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“异源性基因”是指非天然存在于宿主生物中的但通过基因转移导入所述宿主生物中的基因。“异源性基因”也包括原生的编码区或它们的一部分，即以不同于对应的原生基因的形式重新导入源生物体。例如，异源性基因可包括是被再引入至天然宿主的嵌合基因的一个部分的天然编码区，其中所述嵌合基因包括非天然的调控区。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因或嵌合基因。如本文所用，术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、中间或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或其它任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语，都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于取代或与这些术语中任一项互换使用。多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成。以“分离的”多肽或片段形式的变体和其衍生物拟为不在其自然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽可从它原生的或天然的环境中去除。在宿主细胞中重组产生的多种多肽和蛋白质考虑以所述发明目的进行分离，即为原生的或重组的多肽，其已通过任何适宜的技术分离、分馏或部分或大幅纯化。如本文所用，术语“变体”是指利用例如重组DNA技术(例如诱变)产生的，通过氨基酸的插入、缺失、突变和取代而不同于特异性地列举的本发明的多肽的多肽。通过将特定多肽的序列与同源的多肽(例如酵母或细菌的)的序列进行比较，并使高度同源区域(保守区域)中进行的氨基酸序列改变的数量最小化，或通过用共有序列代替氨基酸，可发现用以确定哪些氨基酸残基可以被取代、添加或缺失而不会破坏所关注的活性的指导。作为另外一种选择，编码这些相同或相似多肽的重组多核苷酸变体可以合成或通过利用遗传密码子的冗余而选出。各种密码子取代，如产生各种限制性位点的沉默变化，可引入以优化克隆到质粒表达载体或病毒表达载体。多核苷酸序列的多种突变可体现在所述多肽或添加到所述多肽的其它肽的结构域中以改变多肽中任意部分的性质。氨基酸“取代”可以是用具有相似的结构和/或化学特性的另ー种氨基酸取代一种氨基酸的結果，即保守的氨基酸取代，或它们可以是用具有不同的结构和/或化学特性的另ー种氨基酸取代一种氨基酸的結果，即非保守的氨基酸取代。“保守的”氨基酸取代可在參与残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性或两亲性本质相似性的基础上进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；并且带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。作为另外ー种选择，“非保守”氨基酸取代可通过选择这些氨基酸中任一项在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性或两亲性本质的差异而进行。“插入”或“缺失”可在重组蛋白质结构上或功能上耐受的变型范围之内。通过系统地利用重组DNA技术产生多肽分子中的氨基酸的插入、缺失或取代，并检测所得重组变体的活性，可以以实验方法确定所允许的变型。
术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3’端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应不同的环境条件或生理条件而指导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。还应认识到因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，不同长度的DNA片段可可具有相同的启动子活性。例如，应当理解，“ FBAl启动子”可用于指来源于FBAl基因启动子区的片段。如本文所用的术语“終止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3’端。3'区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。应认识到，因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，因此不同长度的DNA片段可可具有相同的終止子活性。例如，应当理解，“CYCl終止子”可用于指来源于CYCl基因終止子区的片段。术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中ー种核酸序列的功能受到另ー种核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即该编码序列受到该启动子的转录控制)吋，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。如本文所用，术语“表达”指源于本发明核酸片段的有义RNA (mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。如本文所用，术语“过表达”是指比相同的或相关的基因的内源性表达更高的表达。如果异源性基因的表达比可比较的内源性基因的表达更高，则所述异源性基因是过表达的。如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3’端非翻译序列一起引入细胞中。如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时
，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。如它是指用于转化各种宿主的基因或编码区的核酸分子，术语“密码子优化的”是指在基因或编码区的核酸分子中的密码子改变，反映了在没有改变DNA编码的多肽情况下宿主生物典型的密码子使用情况。此类优化包括将至少一个或多于一个或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个密码子。包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差，允许编码该基因的序列中的变型。由于每一密码子由三个核苷酸组成，而组成DNA的核苷酸限于四种特异性碱基，存在64种可能的核苷酸组合，其中的61种编码氨基酸(其余三种密码子编码结束翻译的信号)。本文将显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”重制为表I。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽范围内变化而不会改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。表1:标准遗传密码
权利要求
1.重组宿主细胞，包含: (i)编码多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变或替换或它们的组合，所述多肽将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-Cok ;和 (ii)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA的多肽是丙酮酸脱羧酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶。
3.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含: (iii)编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
4.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中与包含(i)且不包含(ii)或(iii)的重组真核宿主细胞相比，所述宿主细胞在培养物中的生长对外源二碳底物具有降低的需求。
5.重组宿主细胞，包含: (i)编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换；和 (ii)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含: (iii)编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
7.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中与包含(i)且不包含(ii)或(iii)的重组真核宿主细胞相比，所述宿主细胞在培养物中的生长对外源二碳底物具有降低的需求。
8.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中与包含(i)且不包含(ii)或(iii)的宿主细胞相比时，所述宿主细胞在不补充外源碳底物的培养基中具有改善的生长。
9.根据权利要求8所述的重组宿主细胞，其中所述外源二碳底物是乙醇或乙酸。
10.根据权利要求3所述的重组宿主细胞，包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换，其中所述至少一个缺失、突变和/或替换引起丙酮酸脱羧酶活性的降低或消除。
11.根据权利要求10中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因是roc1、PDC5、PDC6或它们的组合；并且所述宿主细胞是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)。
12.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸是来自植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的xpkl、来自戍糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus) MD363 的 xpkA 或来自乳酸双歧杆菌(B.1actis)的 6_ 憐酸磷酸酮醇酶。
13.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述具有磷酸酮醇酶活性的多肽与SEQID N0:481或其活性片段包含至少85%的同一性。
14.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其中所述编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸是来自植物乳杆菌的EutD或来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的磷酸转乙酰酶。
15.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其中所述多肽与SEQID NO: 1472或其活性片段包含至少85%的同一性。
16.根据权利要求5中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是下列属的成员:梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serrat ia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus )、假单胞菌属(Pseudomonas )、芽抱杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产喊菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽抱杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter )、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂通酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)或糖酵母属(Saccharomyces)。
17.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是啤酒糖酵母。
18.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，还包含利用丙酮酸的生物合成途径，其中所述利用丙酮酸的生物合成途径形成选自下列的产物:2，3- 丁ニ醇、2- 丁醇、2- 丁酮、缬氨酸、亮氨酸、乳酸、苹果酸和异戊醇。
19.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，还包含利用丙酮酸的生物合成途径，其中所述利用丙酮酸的生物合成途径是异丁醇生物合成途径，所述异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化: (i)丙酮酸至こ酰乳酸的转化； (ii)こ酰乳酸至2，3-ニ羟基异戊酸的转化； (iii)2，3- ニ羟基异戊酸至2-酮异戊酸的转化； (iv)2-酮异戊酸至异丁醛的转化；以及 (v)异丁醛至异丁醇的转化；并且 其中所述重组宿主细胞产生异丁醇。
20.根据权利要求18所述的重组宿主细胞，其中所述利用丙酮酸的生物合成途径是2- 丁酮生物合成途径，所述2- 丁酮生物合成途径包括下列底物至产物的转化: (i)丙酮酸至こ酰乳酸的转化； (ii)こ酰乳酸至こ偶姻的转化； (iii)こ偶姻至2，3-丁ニ醇的转化；以及 (iv)2，3- 丁ニ醇至2- 丁酮的转化；并且 其中所述重组宿主细胞产生2- 丁酮。
21.根据权利要求18所述的重组宿主细胞，其中所述利用丙酮酸的生物合成途径是2- 丁醇生物合成途径，所述2- 丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化: (i)丙酮酸至こ酰乳酸的转化； (ii)こ酰乳酸至こ偶姻的转化； (iii)こ偶姻至2，3-丁ニ醇的转化； (iv)2，3- 丁ニ醇至2- 丁酮的转化；以及 (v)2- 丁酮至2- 丁醇的转化；并且 其中所述重组宿主细胞产生2- 丁醇。
22.生产2，3-丁ニ醇、2-丁醇、2-丁酮、缬氨酸、亮氨酸、乳酸、苹果酸、丙氨酸、富马酸、琥珀酸或异戊醇的方法，包括使权利要求18的重组宿主细胞在产生所述产物的条件下生长且任选地回收所述产物。
23.生产异丁醇的方法，包括使权利要求19的重组宿主细胞在产生所述产物的条件下生长且任选地回收所述产物。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述重组宿主细胞包含2-丁酮生物合成途径，所述2- 丁酮生物合成途径包含编码多肽的至少一种DNA分子，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化: (i)丙酮酸至乙酰乳酸的转化； (ii)乙酰乳酸至乙偶姻的转化； (iii)乙偶姻至2，3-丁二醇的转化；以及 (iv)2，3- 丁二醇至2- 丁酮的转化； 并且其中所述产物是2-丁酮。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述重组宿主细胞包含2-丁醇生物合成途径，所述2- 丁醇生物合成途径包含编码多肽的至少一种DNA分子，所述多肽催化选自下列的底物至产物的转化: (i)丙酮酸至乙酰乳酸的转化； (ii)乙酰乳酸至乙偶姻的转化； (iii)乙偶姻至2，3-丁二醇的转化；(iv)2，3- 丁二醇至2- 丁酮的转化；以及 (v)2-丁酮至2-丁醇的转化； 并且其中所述产物是2- 丁醇。
26.制备重组宿主细胞的方法，包括: 用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化宿主细胞，所述宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述方法还包括: 用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
28.改善重组宿主细胞的生长的方法，所述重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变或替换，所述方法包括: 用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述方法还包括: 用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
30.根据权利要求28所述的方法，还包括使所述重组宿主细胞在包含限制的碳底物的培养基中生长。
31.降低重组宿主细胞的生长对外源二碳底物的需求的方法，所述重组宿主细胞包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变或替换，所述方法包括: 用编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法还包括: 用编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸转化所述重组宿主细胞。
33.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述磷酸酮醇酶以小于7.5E-242的E值匹配表6中给出的序型HMM。
34.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述磷酸酮醇酶以小于7.5E-242、 1.1E-124、2.1E_49、7.8E-37的E值分别匹配表6、7、8和9中给出的序型HMM。
35.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，还包含磷酸转こ酰酶，所述磷酸转こ酰酶以小于5E-34的E值匹配表14中给出的序型HMM。
全文摘要
本发明涉及重组宿主细胞，其包含(i)编码多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变或替换，所述多肽将丙酮酸转化为乙醛、乙酰-磷酸或乙酰-CoA；和(ii)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸。本发明也涉及重组宿主细胞，其还包含(iii)编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
文档编号C12P13/08GK103140584SQ201180039718
公开日2013年6月5日 申请日期2011年6月16日 优先权日2010年6月18日
发明者M.道纳, L.A.马吉奥-霍尔, J-F.汤布 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司