专利名称：二羟基丙酮合成酶和二羟基丙酮激酶基因表达盒串联的植物表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种提高植物同化和吸收甲醛能力 的植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS及其构建方法和在提高植物 吸收和耐受外源甲醛能力中的应用。
背景技术：
甲醛是一种无色，有强烈刺激气味的气体，易溶于水、醇和醚，被广泛用于工业生 产中，是胶粘剂工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高， 各种原料制成的建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染 公认最具代表性的化学物质。室内空气中游离甲醛浓度在中国规定的允许值是0.08(mg/ 立方米)，对新装修住宅的调查结果表明室内空气中甲醛浓度是室外空气的6. 65倍，为 0. 492mg/m3，在门窗关闭时甲醛浓度超标100倍。甲醛为较高毒性物质，它反应能力极强，能 与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应，是一种非常活泼的化合物，因此对所有的生物 来说都有很高的毒性长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻烟癌、结肠癌、脑 瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连及抑制DNA损伤的修 复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异常、白血病，这就是所谓的装修综合病(sick-house)。相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游离甲苯二异氰酸酯(TDI)、挥发性有机化合物 (V0C)等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、 危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三种一是使用环保材料；二是开窗 通风；三是用植物或除污剂清除污染，使用除污剂有二次污染的可能。用室内栽培植物清除 甲醛污染，是最自然、最环保的方式，科学研究证明确实有些植物能够吸收分解甲醛，但吸 收能力和速度非常有限(Giese 等，1994，Plant Physiol. 104 1301-1309)。甲醛是一种非常活泼的化合物，因为能与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反 应(Feldman 等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，1973，13 :1_49)，因此对所有的生物 包括植物来说都有很高的毒性。但在生物体内通过各种脱甲基化反应，也会产生低浓度的 甲醛，所以几乎所有的生物对甲醛都有各自的解毒机制。自然界中的大多数植物属光能自 养型生物，主要以0)2为碳源，大部分植物通过光合作用的开尔文循环途径固定C02。甲醛 也是植物一碳(C1)化合物代谢的一种中间产物，但是大部分甲醛在植物体内并不以游离 状态存在，而是结合到内源的亲核化合物如谷胱甘肽或四氢叶酸上(Chen等，1997，Plant Physiol 115:299-309)。生物化学和遗传学的研究证明依赖-谷胱苷肽的甲醛脱氢酶(FALDH)在真核生 物中是负责甲醛代谢的主要酶，这种酶普遍存在于动物和植物组织中。ADH2基因编码拟南 芥中FALDH，在植物中只有少量的表达。最近西班牙的一个研究小组获得FALDH过量表达 的转基因拟南芥，他们的研究结果表明提高FALDH在转基因植物中的酶活性可使它们吸收 外源甲醛的效力提高25%，而通过共抑制或反义表达降低FALDH在转基因植物中的活性，
3可使它们吸收甲醛的速度显著下降，与野生型相比，对甲醛的脱毒能力也大大降低，这是 用转基因方法增强植物对甲醛脱毒作用的首例研究(Achkor等，Plant physiology. 132 2248-2255)。在生命诞生以前，甲醛是地球上原始汤的成分之一，甲醛与生物的关系从它的诞 生开始持续至今已有好几十亿年了。在这期间，为防止甲醛浓度在体内上升，生物体建立了 巧妙的机制，使之能在含有甲醛的环境中更好地生存，这一机制的高度发展出现在能同化 一碳化合物的微生物中。不管是原核生物还是真核生物，凡是能利用C1化合物(甲烷，甲 醇，甲酸，甲酰胺等)的微生物，在它们代谢作用的初期阶段，都产生甲醛，它们的细胞中都 有能把从各种C1化合物产生的甲醛变成为细胞的组成成分的同化途径以及从甲醛获得细 胞所需能量的氧化途径。在甲基营养型微生物中，甲醛在好几种C1化合物的代谢过程中是 个关键的中间产物，它参与异化作用和同化作用过程(0皿716等，1978，42 :251-273)。核酮 糖单磷酸途径(RuMP)是细菌甲醛同化途径之一，RuMP中固定甲醛的关键酶是6-磷酸己酮 糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖异构酶(PHI)。因为5-磷酸核酮糖和6-磷酸果糖都是开尔 文循环的中间产物，在植物的叶绿体中如能成功地表达细菌的HPS和PHI，那末甲醛就能通 过光合作用进行同化。我们最近的研究结果表明在拟南芥和烟草的叶绿体中过量表达来自 甲基营养菌Mycobacterium gastri MB19的HPS和PHI，能增强转基因植物对甲醛的抗性和 吸收并同化气体和液体甲醛的能力(Chen et al. ,Plant cell and Physilo，2005)。这就 证明可以利用植物基因工程技术把微生物的甲醛同化途径整合到植物的二氧化碳固定途 径中。甲基营养酵母具有利用一碳化合物甲醇的高效代谢机制，在甲醇的代谢途径中， 甲醇首先被乙醇氧化酶氧化为甲醛，甲醛是甲醇代谢过程中的一个关键性的中间产物，它 处于甲醇同化和异化途径的分支点上。二羟基丙酮合成酶(DAS)催化甲醛同化途径中的 第一个反应，DAS催化酵母菌中的甲醛和木酮糖5-P形成二羟基丙酮和甘油醛3-磷酸。甲 醇被酒精氧化酶氧化成甲醛后，由它把甲醛固定到D-木酮糖5-磷酸分子上(Yurimoto等， 2005，The Chemical Record. 5 :367_375)。通过突变体和酶学特性分析证实了 DAS的生理 作用是甲醇同化作用的关键酶，被定位在过氧化物酶体中。目前已从甲基营养型酵母菌假 丝酵母(Candida boidinii)中克隆到编码DAS的基因(DHAS1)，进一步的调查结果证实DAS 主要参与这种酵母菌细胞中甲醛的同化作用而非异化作用或脱毒作用(Sakai等，1998， American Society forMicrobiology. 180 5885-5890)。二羟基丙酮对酵母细胞来说是有 毒的化合物，在酵母菌中二羟基丙酮激酶(DAK)参与二羟基丙酮的脱毒作用，它催化的反 应使二羟基丙酮磷酸化，形成无毒性的磷酸二羟丙酮，可为酵母细胞所利用。该酶普遍存在 于大多数的生物体中，结合遗传学和生物化学方法，已从酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中克隆到两个编码DAK的基因(YML070W/DAK1和YML053W/DAK2)，它们所编 码的蛋白质是同型二聚体(Molin 等，2003，The journalof biological chemistry. 278 1415-1423)。从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中克隆到的DAK基因编码的蛋白质定 位于细胞质中(Liiers 等，Yeast. 1998，Jun 15，14(8) :759_71)。5-磷酸木酮糖和磷酸二羟丙酮及甘油醛3-磷酸都是开尔文循环的中间产物，本 申请人:的研究结果证明(见本申请人的另一申请专利提高植物吸收和耐受甲醛的方法及 其植物载体与应用，申请号在200810058341. 9)在植物的叶绿体中过量表达来自酵母菌的DAS和DAK，把酵母菌的甲醛同化途径整合到植物的二氧化碳固定途径(开尔文循环途径) 中，在转基因植物中利用DAS和DAK可以构建一条甲醛同化途径。但是利用DAS和DAK构 建甲醛同化途径时涉及到两个基因的转化操作，如果把这两个基因亚克隆于两种含有不同 筛选标记基因的植物表达载体上，做转基因植物时就要在获得单个基因的转基因植物时再 做一次转化试验才能获得两个基因的双转基因植物，或得到单个基因的转基因植物后进行 杂交才能获得双转基因植物，这两种方法都需要耗费很长的时间，增加一倍的工作量。另 外，也可以通过两种载体的共转化获得双转基因植物，不过这种方法成功率很低，对难转化 的植物更难以实现两个基因的转化操作。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种植物表达载体(pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS)，该载体含有 1，5 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小 亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体基质定位序列(T*)及DAS和DAK基因，从而 可以通过一次转化事件完成DAS和DAK 二个目的基因的转化操作，利用该载体中的PrbcS 启动子控制DAS和DAK基因在植物叶片中的表达，并通过叶绿体基质定位序列(T*)把表达 的DAS和DAK蛋白定位到叶绿体基质中，利用DAS和DAK蛋白在转基因植物中构建一条甲 醛的光合作用同化途径，从而提高植物同化和吸收甲醛能力。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案植物表达载体 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS，为含有番茄 1，5 二磷 酸核酮糖羧化酶Rubisco 3C小亚基基因的光诱导型启动子PrbcS及其转移肽序列*T、甲基 营养酵母菌假丝酵母的二羟基丙酮合成酶DAS基因和巴斯德毕赤酵母的二羟基丙酮激酶 DAK基因的植物表达载体。所述的植物表达载体，其中的DAS基因的GenBank登录号为AF086822，DAK基因的 GenBank 登录号为 AF019198。所述的植物表达载体，其起始载体为pK7m34GW2-8m21GW3。所述的植物表达载体，其中光诱导型启动子PrbcS和叶绿体定位序列是从番茄的 基因组中分离出来的rbcS-3C的启动子及其叶绿体基质定位序列，是一个由Hindlll切割 产生的1.7kb的DNA片断。植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS，由下述方法构建而 成(1)入门载体 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的构建用SphI 和Xhol 切开 pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 禾口 pENTR*-PrbcS-*T_DAK， 回收 pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 被切割后产生的载体 pEN-L4*-PrbcS-*T_L3* 片断及 pENTR*-PrbcS-*T-DAK被切割产生的DAK基因的DNA片段，用连接酶把载体片段和DAK基因 的DNA片段连接起来获得入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* ；(2)植物表达载体 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的构建通过Gateway 的 LR 反应，把入门载体 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 中的 PrbcS-*T-DAK片段和pENTR*-PrbcS-*T_DAS中的PrbcS_*T_DAS片段同时亚克隆到植物表 达载体 pK7m34GW2-8m21GW3 中，获得植物表达载体 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS。植物表达载体pK2-35S-PrbCS-*T-hps/phi的构建方法，包括下述步骤(1)入门载体 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的构建用SphI 和 Xhol 切开 pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3* 和 pENTR*-PrbcS-*T_DAK， 回收 pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 被切割后产生的载体 pEN-L4*-PrbcS-*T_L3* 片断及 pENTR*-PrbcS-*T-DAK被切割产生的DAK基因的DNA片段，用连接酶把载体片段和DAK基因 的DNA片段连接起来获得入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* ；(2)植物表达载体 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的构建通过Gateway 的 LR 反应，把入门载体 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 中的 PrbcS-*T-DAK片段和pENTR*-PrbcS-*T_DAS中的PrbcS_*T_DAS片段同时亚克隆到植物表 达载体 pK7m34GW2-8m21GW3 中，获得植物表达载体 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T -DAS。植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS在提高转基因植物吸 收和耐受外源甲醛能力的遗传工程中的应用。本发明用通路克隆技术构建的植物表达载体，其含有1，5 二磷酸核酮糖羧化酶 (Rubisco)小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体基质定位序列(T*)。所述植物 表达载体为 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS,还含有 DAS 和 DAK 基因。利用该植 物表达载体可以通过一次转化事件完成DAS和DAK两个目的基因的转化操作，所述DAS和 DAK基因上游都有番茄Rubisco 3C小亚基的启动子PrbcS和叶绿体定位序列(*T)，DAS和 DAK基因的表达受PrbcS启动子控制，叶绿体基质定位序列(T*)可以把表达的DAS和DAK 蛋白定位到叶绿体基质中，因此可利用DAS和DAK蛋白在转基因植物中构建一条甲醛的光 合作用同化途径，从而提高植物同化和吸收甲醛能力。因为DAS和DAK催化反应的底物和产物都是植物开尔文循环的中间产物，本发明 技术方案的提出是基于甲基营养型酵母菌的甲醛同化途径可以安装成高等植物开尔文循 环的一个支路，因此在植物的叶绿体中过量表达来自酵母菌的DAS和DAK可以增强转基因 植物对甲醛的抗性，并提高植物吸收和同化外源甲醛的能力。本发明载体中，DAS和DAK基因的上游添加有光诱导型启动子PrbcS和叶绿体基 质定位序列(T*)。本发明使用的光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体定位序列是从番茄的基 因组中分离出来的rbcS-3C的启动子及其叶绿体基质定位序列，是一个由Hindlll切割产 生的 1. 7kb 的 DNA 片断(Sugita et al.，1987，MGG, 209 :247_256)。本发明利用光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体基质定位序列(*T)构建DAS和DAK 基因的植物表达载体，以便在转基因植物的叶绿体基质中过量表达DAS和DAK，通过DAS和 DAK在转基因植物的叶绿体中构建甲醛的光合作用同化途径，增强植物同化甲醛的效率，进 而提高了植物吸收和耐受外源甲醛的能力。
图 1、重组质粒 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的构建策略；
图 2、重组质粒 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的检测。 A :pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的电泳检测。1，负对照(5. 8kb 的质粒)；2，正对照
6质粒(6. lkb 的质粒)；3-6，pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 质粒 DNA。B 用 Hindlll 酶切检测 重组质粒pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*。l，DNA Marker III ；2,入 DNA/HindIII DNA Marker ； 3-5，pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*。C :PCR 检测重组质粒 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3*。1， DNA Maker III ;2和4，用DAK基因上游引物DAK5和下游引DAK3做PCR的扩增产物，3和5 是用PrbcS启动子区的引物和DAK基因下游引物DAK3做PCR的扩增产物；图 3、植物表达载体 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-DAS 的构建策略；图 4、重组质粒 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的检测。A :pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的电泳检测。1，负对照(14. 2kb 的 质粒)；3-5，pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 质粒 DNA。B 用 EcoRV 酶切检测 重组质粒 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS。1，入 DNA/HindIII DNA Marker ；2, DNA Marker DL2000 ；3，pENTR*-PrbcS-*T_DAS ；4，pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3*，5-8，pK_35S -PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DASo C :PCR检测重组质粒pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS。1，DNA MarkerDL2000 ；2，正对照(以 pEN-LA*-PrbcS-*T-DAK_L3* 为模板用 DAK5 和 DAK3 弓 | 物做 PCR 的扩增产物)；3，以 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 为 模板用DAK5和DAK3引物做PCR的扩增产物；5，正对照(以pENTR*-PrbcS-*T_DAS为模板 用 DAS5 和 DAS3 引物做 PCR 的的扩增产物)；6，以 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD_PrbcS-*T-DAS为模板用DAS5和DAS3引物做PCR的扩增产物；4和7，负对照(以pK7m34GW2_8m21GW3 为模板的扩增产物)；图 5、PCR 检测含有植物表达载体 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-DAS 的农 杆菌菌落中的DAK(A)和DAS(B)基因片段。A 用DAK5和DAK3引物做PCR检测。1，DNA Marker ；2，负对照(以 pK7m34GW2_8m21GW3 为模板的扩增产物)；3-6，以 pK-35S_PrbcS-*T -DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS转化子菌落为模板的扩增产物。B 用DAS5和DAS3引物做PCR 检测。1，DNA Marker ；2，负对照(以pK7m34GW2-8m21GW3为模板的扩增产物)；3-6,以pK_ 35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS转化子菌落为模板的扩增产物；图6、拟南芥的遗传转化程序；图7、PCR检测转基因拟南芥基因组中DAK和DAS插入情况。A 拟南芥的基因组DNA 的电泳检测。1-4，拟南芥的基因组DNA ;5，DNA Marker III。B 转基因植株中DAK基因的 PCR检测。1，DNA Marker III ；2-3，WT(野生型植物，负对照)；4-6，转化pK-35S_PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS F1 代的 3 个植株系。7，正对照(以 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 为模板的扩增产物)。C 转基因植株中DAS基因的PCR检测。1，DNA Marker III ；2-3, WT (野生型植物，负对照)；4-6，转化 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS F1 代的 3个植株系。7，正对照(以pEN-L4*-PrbcS-*T-DAS-L3*为模板的扩增产物)；图8、RT-PCR检测转基因拟南芥中DAK和DAS的转录水平。A 转基因植株中DAS 基因的RT-PCR检测。1，正对照(以pENTR*-PrbcS-*T-DAS为模板的扩增产物)；2，DNA Marker ；3-4, WT(野生型植物，负对照)；5_10，转基因拟南芥F2代的6个植株。B 转基因 植株中DAK基因的RT-PCR检测。1，正对照(以pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*为模板的扩增 产物)；2，DNA Marker III ；3-4, WT(野生型植物，负对照)；5_10，转基因拟南芥F2代的6 个植株；图9、转基因拟南芥吸收甲醛能力的检测。WT(野生型植物，负对照)；KSG6和
7KSG7，转基因拟南芥F2代的2个株系；图10、转基因拟南芥同化甲醛能力的检测。WT(野生型植物，负对照)；KSG6和 KSG7，转基因拟南芥F2代的2个株系；图11、转基因拟南芥对甲醛抗性的检测。WT(野生型植物，负对照)；KSG6和KSG7， 转基因拟南芥F2代的2个株系。
具体实施例方式下面结合附图用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此 限定本发明。本发明下述实施例中所用到的试剂与仪器为试剂主要为分子生物学实验试剂，其余试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1 入门载体 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 的构建(1)入门载体 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 的构建用SphI 和 Xhol 切开 pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*(pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的构建方法见本申请人的另一项专利申请，专利申请号为201010110946. 5，发明 名称通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*及其构建方法和应用和pENTR* -PrbcS-*T-DAK (pENTR*-PrbcS-*T_DAK的构建方法见本申请人的另一项专利申请，专 利申请号200810058341. 9)，回收pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP_L3*被切割后产生的载体 pEN-L4*-PrbcS-*T-L3* 片断(4. 3kb)及 pENTR*-PrbcS-*T_DAK 被切割产生的 DAK 基 因的DNA片段(1.8kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒把载体片段和DAK基 因的DNA片段连接起来获得入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* (图1)。用连接反 应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5ci，天根生化科技)，把转化好 的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(KmJOiig/ml)的平板上，于37°C过夜培养，筛选Km抗 性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒(图2A)，用Hindlll做酶切检测，连 接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生三条带，分子量最大的一条为3. lkb的载体 条带，第二条为2.2kb的启动子片段，第二条为0.8kb的DAK基因片段(图2B)。选出 连接成功的质粒载体pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*，用DAK基因的上下游特异性引物 DAK5 (atgtctagtaaacattgggattac)禾口 DAK3 (ctacaacttggtttcagatttg)进行 PCR 扩增检测 DAK基因片段，结果都能扩增出一条1.8kb的DAK条带(图2C)。再用PrbcS启动子区的引 物和DAK基因下游引物DAK3做PCR检测，PCR扩增产物约为2. Okb (图2C)，与预期结果一 致。选出连接成功的质粒载体pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*，重新转化大肠杆菌DH5 a，挑单 个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。实施例2 :DAK和DAS基因表达盒串联植物表达载体的构建通过Gateway 的 LR 反应，把入门载体 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 中的 PrbcS-*T-DAK 片段和 pENTR*-PrbcS-*T_DAS(pENTR*-PrbcS-*T_DAK 的构建方法见本申请 人的另一项专利申请，申请号200810058341. 9)中的PrbcS_*T_DAS片段同时亚克隆到植 物表达载体pK7m34GW2-8m21GW3 (Gateway的目的载体，购自比利时VIB/Gent公司)中，获得植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS(图3)。具体的做法是用 质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pK7m34GW2-8m21GW3，在Gateway的LR反应体 系中加 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 和 pENTR*-PrbcS-*T_DAS 及 pK7m34GW2-8m21GW3 各 150ng，lul LR Clonase plusEnzyme Mix (Invitrogen)，混均于 25°C反应过夜，通过整合酶 的作用把 PrbcS-*T-DAK 和 PrbcS_*T_DAS 整合到 pK7m34GW2_8m21GW3 中获得串联 DAK 和 DAS 表达盒的植物表达载体质粒 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS(图 3)。用 反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5ci，天根生化科技)，把转化好 的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(SpeJOyg/ml)的平板上，于37°C过夜培养，筛选Spe抗 性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提取质粒(图4A)，用EcoRVCTaKaRa)做酶切检 测，同时以 pENTR*-PrbcS-*T-DAS 和 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 为正对照，整合成功的 质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生五条带(图4B)，第一条为10. 7kb的载体带，第二条为 3. lkb，第三条为DAS基因被切割后产生的片段2. lkb，与pENTR*-PrbcS-*T-DAS中的DAS 被EcoRV切割后产生的DAS片段分子量一致(图4B)，第四条为1. 3kb，第五条为DAK基 因被切割后产生的片段0. 8kb，与pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*中的DAK被EcoRV切割后 产生的DAK片段分子量一致(图4B)。选出整合成功的质粒载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS，用 DAS 基因的上下游特异性引物 DAS5 (ATGGCTCTCGCAAAAGCTGCTTC) 和 DAS3 (TTATTGATCATGTTTTGGTTTTTC)进行 PCR 扩增检测 DAS 基因片段，以 pK_35S_ PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS 为模板都能扩增出一条 2. lkb 的 DAS 条带，与 pENTR*-PrbcS-*T-DAS用为模板扩增到的条带分子量一致(图4C)。同时也用DAK基 因的上下游特异性引物DAK5和DAK3进行PCR扩增检测DAK基因片段，以pK_35S_P rbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS为模板都能扩增出一条1. 8kb的DAK条带，与用 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3*中为模板扩增到的条带分子量一致(图4C)。确认是整合成功 的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 a，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。PK-35S -PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS携带的植物筛选标记基因为卡那霉素(Km)抗性基因 (NPTII)，这样可用加有Km的平板筛选转基因植物。实施例3 用DAK和DAS基因表达盒串联的植物表达载体转化农杆菌制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK-35S_Prb cS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS转入农杆菌(C58C1 (pPMP90))中，在加有壮观霉素的平板 上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混勻；将混合物加入到预冷的 电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BI0-RAD)滑槽 中，用1mm的电击杯和200欧姆，2. 5kV/0. 2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯， 迅速加入0. 5mlS0C培养基，混勻，转移到1. 5ml的离心管中；28°C，200rpm摇床培养3_5h ； 室温下，7500rpm离心lmin，弃大部分上清，保留100 yl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮 观霉素(SpejOyg/ml)的LB固体培养基上，28°C培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取 农杆菌菌落放入20 u 1 ddH20中，98°C处理15分钟后取出10 u 1农杆菌裂解液作为PCR反 应的模板。用DAK和DAS基因上下游特异性引物作PCR检测，转化成功的菌落均能扩增出 1. 8kb (图5A)的DAK基因条带和2. lkb的DAS基因条带(图5B)，经菌落PCR确认的转化 子菌落用于转化植物。实施例4 用含有DAK和DAS基因表达载体的农杆菌转化拟南芥
挑取携带有质粒pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS的农杆菌单菌落接 种于 50ml 的 LB 培养基中(含 Spe，100 u g/ml)，180rpm, 28°C培养 24h，待菌液 OD600 至 1. 0 左右，离心lOmin (3000rpm)，沉淀菌体。用5%的蔗糖溶液悬浮菌体使菌体的0D6(1(1值为0. 5。 选取容易转化的模式植物拟南芥(生态型Columbia)作转化试验，首先将拟南芥栽培于小 杯的土壤中，用抽蕾期的拟南芥植株做转化试验(图6)，转化试验开始时在农杆菌悬浮液 中加入表面活性剂Silwet L-77(0. 005% )，把有拟南芥花蕾的枝条置于农杆菌悬浮液中， 通过抽真空使农杆菌进入拟南芥花蕾的子房中。转化结束后用吸水纸吸干植物表面的蔗糖 溶液，于黑暗中培养一天，然后置于温室中继续培养，收集种子。用次氯酸钠对种子进行表 面消毒，播于含有卡那霉素(50 y g/ml)的MS培养基上，筛选具有卡那霉素抗性的转基因植 株(F1代)，移栽到混有腐殖土的土壤上，待植物长大后取其叶片进行PCR检测。实施例5 :DAK和DAS基因在转基因拟南芥中的插入情况的检测为了确认具有卡那霉素抗性的F1代植株确实含有DAK和DAS基因，用PCR方法 对筛选到的转基因植株作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组称取植物叶 片lOOmg左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900 yl预热 到 65°C 的 2XCTAB 缓冲液(Tris-HCl pH 7. 5100mM, EDTA 20mM, NaCll. 4M, CTAB 2% ), 65°C度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500 yl氯仿-异戊醇混合液(24 1)摇勻， 4°C离心10min(7500rpm)后转移上清至1. 5ml EP管；再次加入500 yl氯仿-异戊醇混 合液(24 1)摇勻，4°C离心10min(7500rpm)；取出上清置于新的EP管中，加入1/10体 积3M pH5. 2醋酸钠和等体积异丙醇，摇勻后4°C离心20min(12000rpm)；弃上清，用75% 乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液溶解并降解RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测 基因组的质量(图7A)。以基因组DNA为模板，用DAK基因的上下游特异性引物(DAK5和 DAK3)和DAS基因上下游特异性引物(DAS5和DAS3)作PCR检测。在PCR反应混合液中 加入50ng的基因组DNA作为模板，同时加入50ng的DAS基因上下游特异性引物(DAS5和 DAS3)、1. 8 ii ldNTP (2. 5mM)，10 ii 1 的 5 X 反应 Buffer 禾口 0. 5 ii 1 的 Taq (2. 5U/ u 1) DNA 聚合 酶(天根生化科技)，加双蒸水使反应终体积为20 yl。在PCR仪上于94oC加热3分钟，然 后按照94oC、45秒，50oC、45秒，72oC、2分钟的程序进行30个循环的反应，最后在72oC延 长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增DAS基因的DNA片段。在另一个PCR反应混合液 中加入50ng的基因组DNA作为模板，同时加入50ngDAK基因的特异性引物DAK5和DAK3、
1.8u ldNTP (2. 5mM)，10 ii 1 的 5 X 反应 Buffer 禾口 0. 5 ii 1 的 Tag (2. 5U/ u 1) DNA 聚合酶(天 根生化科技)，加双蒸水使反应终体积为20 yl。在PCR仪上于94oC加热3分钟，然后按照 94oC、45秒，50oC、45秒，72oC、1分钟45秒的程序进行30个循环的反应，最后在72oC延长 反应10分钟的程序进行PCR反应扩增DAK基因DNA片段。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电 泳分离PCR扩增产物。转化成功的转基因植株均能扩增出1. 8kb的DAK条带(图7B)和
2.lkb的DAS条带(图7C)，经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。实施例6 :DAK和DAS基因在转基因拟南芥中转录水平的检测为了考察在含有DAK和DAS基因的转基因植株中DAK和DAS基因的转录情况， 从F2代转基因植株叶片中抽取总RNA，反转绿成cDNA后用于RT-PCR分析，检测DAK和 DAS基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取RNA， 取植物嫩叶约0. lg，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离
10心管，再加入0. 2ml氯仿，振荡混勻，离心15min (12000rpm)，转移上清液至新管，加入 0. 5ml异丙醇，混勻室温放置10min，4°C离心lOmin(12000rpm)，弃上清，沉淀用75 %乙 醇1ml清洗，4°C离心5min(7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20iU焦碳酸 二 乙酉旨(DEPC)处理水溶解 RNA。使用 Reverse Transcriptase (Promega)进行 cDNA 的 合成，取植物总 RNA 约 3 ii g-5 ii g，oligo(dT)2iil(5iiM)，用 DEPC 处理水补足至 12 yl， 混勻后，短暂离心将之收集于管底，置于70°C加热5min，冰浴lOmin，加入反应混合物 9u 1 (5 X reaction buffer5 ii 1 (含 MgCl2)，10mM dNTP mix 1. 5 ii 1，RNA 酶抑制剂 1 ii 1， 1 u 1 ReverseTranscriptase，将上述混合物混勻，短暂离心将之收集于管底，然后37°C保 温60min，合成cDNA，72°C加热lOmin灭活酶。以cDNA为模板，用DAS基因上下游特异性引 物(DAS5和DAS3)和DAK基因上下游特异性引物(DAK5和DAK3)作PCR，转化成功的转基因 植株均都能扩增出2. lkb的DAS条带(图8A)和1. 8kb的DAK条带(图8B)，证明DAS和 DAK基因可以在转基因拟南芥中成功地转录。经RT-PCR确认的转基因植株用于甲醛吸收、 同化和抗性能力分析。实施例7 转基因拟南芥对液体甲醛吸收速率的检测甲醛可与Nash试剂(醋酸氨15 %，冰醋酸0. 3 %，乙酰丙酮0. 2 % )发生化学 反应产生有颜色的物质，该物质的最大吸收波长为410nm，因此可以制备甲醛的标准曲线， 根据HCH0的标准曲线即可计算出反应液中甲醛的含量，利用该方法可以测定植物对甲醛 的吸收速率。取2. Og左右无菌培养的拟南芥幼苗放入培养瓶中，加入150ml甲醛(4mM)溶 液处理4、30、56、72、80小时后，取出500 u 1处理液，加水至1ml，再加入lml Nash试剂在 30°C保温30分钟后，测定0D41Q，根据标准曲线计算出处理液残存甲醛浓度。结果如图10所 示，在处理刚开始时的4-56小时内，野生型植物(WT)处理液中剩余甲醛的浓度与转基因植 物(KSG6和KSG7)与差别不明显。但是到72小时，转基因植物处理液中剩余甲醛浓度大 大低于野生型植株(图10)，与野生型植物相比，转DAS和DAK的植物吸收甲醛的速度提高 20% 30%，证明DAS和DAK同时导入转基因植物能提高植物吸收甲醛的能力。实施例8 转基因拟南芥植株代谢和同化甲醛能力的检测为了证明甲醛被植物吸收后能被代谢和同化成为植物细胞的组成成分，因此用放 射性甲醛(H14CHO)进行示踪试验。有放射活性的H14CHO被植物吸收后如果被转化为各种 代谢途径的中间产物将出现在植物叶片的可溶性成分中，使这部分的14c活性增强。通过各 种代谢途径的中间产物最后还会有一部分H14CHO最终被同化为植物细胞结构成分，如多糖 (淀粉，纤维素等)及蛋白质即植物的不溶性成分，使这部分的14C活性增强。通过测定植 物经H14CH0处理后可溶性和不溶性部分的14c活性即可获得植物代谢和同化甲醛的能力。 选无菌栽培的拟南芥小苗，用无菌水洗去根部的琼脂，称取o. 5g用pH值为6. 0的H14CH0 溶液(H14CH0 2u Ci, HCH0 2mM/L, KHC03 5mM/L, MES 0. 1% ) 30ml 浸泡，25°C持续光照振 荡培养50h。处理结束后用冷却蒸馏水洗去植物表面游离甲醛后在液氮中磨碎，再用10% Trichloricacid(TCA)抽提。抽提完毕离心得到可溶性部分(上清液)和不溶性部分(残 渣)，不溶性部分连续使用5% TCA洗1次，50%乙醇洗2次，100%乙醇洗1次。最后用液 闪仪(Hidex 0y, Finland)测定甲醛处理液、上清液和残渣的14C同位素活性(图11)。由 图11的数据可知经H14CH0处理50小时后，转基因植物用TCA抽提到的可溶性部分和不溶 性成份的14C放射活性明显大于野生型植物，而其处理液中14C同位素活性则明显低于野生
11型植物，这说明转基因植物代谢和同化甲醛的能力明显强于野生型植物。实施例9 转DAS和DAK基因拟南芥对甲醛的抗性检测为了验证转基因植物对气体甲醛的抗性，将转基因植物幼苗移入有MS培养基的 培养瓶中培养，约2个月后在培养瓶中放置一个开口 500 yl的离心管，并在离心管中加入 一定量(13iU)37%的甲醛溶液。25°C持续光照培养48天后，观察转基因植物的生长状况 (图12)。结果说明同时转入DAS和DAK的植物比野生型植物的长势好，叶片白化现象较轻， 证明转DAS和DAK基因的植物对气体甲醛抗性增强。实验结果表明转基因植物吸收甲醛的速度提高20% 30%，在用14C标记的甲 醛做示踪试验时转基因植物也显示出较野生型强的甲醛代谢能力。在含有外源高浓度的气 体甲醛环境中生长时，转基因植物的生长状态好于野生型，叶片白化现象较轻，说明转基因 植物对甲醛的抗性强于野生型植物。
权利要求
植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS，为含有番茄1，5二磷酸核酮糖羧化酶Rubisco 3C小亚基基因的光诱导型启动子PrbcS及其转移肽序列*T、甲基营养酵母菌假丝酵母的二羟基丙酮合成酶DAS基因和巴斯德毕赤酵母的二羟基丙酮激酶DAK基因的植物表达载体。
2.如权利要求1所述的植物表达载体，其中的DAS基因的GenBank登录号为AF086822， DAK基因的GenBank登录号为AF019198。
3.如权利要求1所述的植物表达载体，其起始载体为pK7m34GW2-8m21GW3。
4.如权利要求1所述的植物表达载体，其中光诱导型启动子PrbcS和叶绿体定位序 列是从番茄的基因组中分离出来的rbcS-3C的启动子及其叶绿体基质定位序列，是一个由 HindHI切割产生的1. 7kb的DNA片断。
5.植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS，由下述方法构建而成(1)入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的构建用 SphI 和 Xhol 切开 pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 和 pENTR*-PrbcS-*T_DAK，回 收 pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 被切割后产生的载体 pEN-L4*-PrbcS-*T_L3* 片断及 pENTR*-PrbcS-*T-DAK被切割产生的DAK基因的DNA片段，用连接酶把载体片段和DAK基因 的DNA片段连接起来获得入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* ；(2)植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的构建通过 Gateway 的 LR 反应，把入门载体 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 中的 PrbcS_*T_DAK 片段和pENTR*-PrbcS-*T-DAS中的PrbcS_*T_DAS片段同时亚克隆到Gateway的目的载体 pK7m34GW2-8m21GW3 中，获得植物表达载体 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DASo
6.植物表达载体pK2-35S-PrbCS-*T-hps/phi的构建方法，包括下述步骤(1)入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* 的构建用 SphI 和 Xhol 切开 pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3* 和 pENTR*-PrbcS-*T_DAK，回 收 pEN-L4*-PrbcS-*T—GFP-L3* 被切割后产生的载体 pEN-L4*-PrbcS-*T_L3* 片断及 pENTR*-PrbcS-*T-DAK被切割产生的DA基因的DNA片段，用连接酶把载体片段和DAK基因 的DNA片段连接起来获得入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK-L3* ；(2)植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS 的构建通过 Gateway 的 LR 反应，把入门载体 pEN-L4*-PrbcS-*T-DAK_L3* 中的 PrbcS_*T_DAK 片段和pENTR*-PrbcS-*T-DAS中的PrbcS_*T_DAS片段同时亚克隆到Gateway的目的载体 pK7m34GW2-8m21GW3 中，获得植物表达载体 pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DASo
7.植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PR0LD-PrbcS-*T-DAS在提高转基因植物吸收 和耐受外源甲醛能力的遗传工程中的应用。
全文摘要
本发明具体涉及一种提高植物同化和吸收甲醛能力的植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS及其构建方法和在提高植物吸收和耐受外源甲醛能力中的应用。提高植物同化和吸收甲醛代谢能力的植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS，为含有番茄1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)3C小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)及其转移肽序列(*T)、甲基营养酵母菌假丝酵母(Candida boidinii)的二羟基丙酮合成酶(DAS)基因和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的二羟基丙酮激酶(DAK)基因(双基因)的植物表达载体，用该载体做一次转化试验可以完成DAS和DAK两个基因的转化操作。
文档编号C12N15/82GK101838666SQ20101011131
公开日2010年9月22日 申请日期2010年2月22日 优先权日2010年2月22日
发明者孙振, 宋中邦, 李昆志, 李莉, 梁峰, 潘正波, 肖素勤, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学