过量共表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶提高钝齿棒杆菌精氨酸产量的制作方法
【专利摘要】钝齿棒杆菌(Corynebacterium?crenatum)SYPA5-5是通过传统诱变育种手段获得的高产精氨酸菌株，该菌株具有独立知识产权。本专利以SYPA5-5基因组DNA为模板，扩增得到编码磷酸果糖激酶的基因pfk和丙酮酸激酶的基因pyk，将两者串联到表达载体pDXW-10上，电击转化到C.crenatum?SYPA5-5中，构建得到基因工程菌SYPA5-5/pDXW-10-pfk-pyk。该工程菌中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶同时得到加强表达，提高了EMP途径代谢强度，增加了葡萄糖消耗，工程菌在5L发酵罐发酵96h精氨酸产量为48.7g·L-1，比原始菌提高了27.5％。这是首次在钝齿棒杆菌中通过串联加强表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶提高精氨酸的发酵产量。
【专利说明】过量共表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶提高钝齿棒杆菌精氨酸产量
【技术领域】
[0001]过量共表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶提高钝齿棒杆菌精氨酸产量的方法属于基因工程和代谢工程领域。
【背景技术】
[0002]L-精氨酸(L-arginine)作为人和动物体内的半必需氨基酸，维持机体氮元素平衡，是尿素循环的中间代谢物，同时具有独特的生理和药理功能，在医药、食品、畜牧业等领域具有广泛的应用。微生物发酵法生产L-精氨酸对环境污染小，是比较经济和有效的方法。
[0003]L-精氨酸在微生物体内的合成途径是葡萄糖经EMP途径分解的丙酮酸以乙酰-CoA的形式进入TCA循环，TCA循环的中间代谢物α -酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化生成谷氨酸，谷氨酸经过多个酶的作用下生成L-精氨酸。
[0004]前期对精氨酸生产菌株的改造多集中在谷氨酸到精氨酸合成途径，分析研究该途径中相关酶的性质，发现乙酰谷氨酸激酶为关键酶，对其定点改造提高了精氨酸产量，并将精氨酸合成基因簇加强表达，提高了精氨酸产量。微生物体内L-精氨酸的合成涉及多个途径，因此考虑通过加强EMP途径提高精氨酸产量。
[0005]磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, EC2.7.1.11)又叫6_磷酸果糖激酶,催化果糖-6-磷酸进一步磷 酸化生成果糖-1，6- 二磷酸，其催化效率很低，EMP途径的速率严格地依赖该酶的活力水平。丙酮酸激酶(pyruvate kinase, EC2.7.1.40)催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸和ATP，丙酮酸作为共同代谢中间物可以进一步被氧化，或用作结构原件，可以说丙酮酸激酶控制着丙酮酸的外流量，进而调节EMP途径。
[0006]Andersen研究发现将Lactococcus Iactis中磷酸果糖激酶突变失活后，突变株的磷酸果糖激酶活性降低2倍，生长速率降低57-70%，EMP途径代谢流则降低62-76%。Papagianni在L.1actis中克隆表达来自黑曲霉中磷酸果糖激酶的基因，发现重组乳酸菌糖酵解能力增强，葡萄糖消耗速率提高，且能耐受更高浓度的葡萄糖。Emmerling在大肠杆菌中克隆表达来自嗜热芽孢杆菌的丙酮酸激酶基因，发现重组菌的葡萄糖消耗速率增加10 %，在此基础将重组大肠杆菌中的磷酸果糖激酶进行加强表达，发现葡糖糖消耗速率提高25%，推测大肠杆菌中EMP途径代谢流的增强可以通过加强表达丙酮酸激酶或者共同加强表达丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶来实现。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一株钝齿棒杆菌EMP途径关键酶基因表达的重组钝齿棒杆菌，该重组菌中的磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶串联加强表达，因而提高了重组钝齿棒杆菌中EMP途径代谢强度，来提高发酵法生产L-精氨酸的产量。
[0008]本发明所述的重组菌是在研究室保藏的高产精氨酸的钝齿棒杆菌中共同加强表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶得到的，该高产精氨酸钝齿棒杆菌是采用传统诱变育种手段获得的一株钝齿棒杆菌，该菌株已经于2011年07月第27卷第七期的《生物工程学报》杂志中公开。
[0009]本发明的技术方案:
[0010]1.获得重组质粒 pDXW-10-pfk 和 pDXW-10-pyk
[0011]根据NCBI 中 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 的全基因组序列，设计憐酸果糖激酶基因Pfk的PCR引物Pl和P2，丙酮酸激酶基因pyk的PCR引物P3和P4:
[0012]Pl:5，-ACCGGAATTCGAAAGGACATGGAAGACA TGCGAATTG-3，EcoR I
[0013]P2:5’ -ACCGCTCGAGCTATCCAAAC ATTGCCTGG-3’ Xho I
[0014]P3:5， -GGAAGATCTGAAAGGACATGAACGATGGGCGTGGATAGACGAAC-3， Bgl II
[0015]P4:5’ -CGCCTGCAGTTAGAGCTTTGCAATCCTTG-3’ Pst I
[0016]以钝齿棒杆菌染色体为模板，P1、P2为引物进行PCR扩增，得到pfk基因片段(如SEQ ID NO:1所示序列),P3、P4为引物进行PCR扩增，得到pyk基因片段(如SEQ ID NO:2所示序列)，与克隆载体PMD18-T连接构建克隆载体pMD18-T-pfk和pMD18_T-pyk，转化E.coli JM109感受 态细胞涂布含氨苄青霉素的固体LB平板，挑取转化子提取质粒进行酶切验证后测序。用EcoR I和Xho I双切pMD18-T-pfk和pDXW_10，胶回收pfk基因片段和线性化pDXW-ΙΟ载体，连接后转化E.coli JM109感受态细胞，涂布含卡那霉素的固体LB平板筛选转化子，获得重组质粒pDXW-10-pfk。用Bgl II和Pst I双切pMD18_T-pyk和pDXW_10，胶回收pyk基因片段和线性化pDXW-ΙΟ载体，连接后转化E.coli JM109感受态细胞，涂布含卡那霉素的固体LB平板筛选转化子，获得重组质粒pDXW-10-pyk。
[0017]2.获得重组质粒 pDXW-10-pfk-pyk
[0018]根据pDXW-10-pfk和pDXW-10-pyk的序列设计串联表达引物P5和P6:
[0019]P5:5， -TCCCCGCGGTCCGGAGCTTATCGACT-3， Sac II
[0020]P6:5， -CGCCTGCAGTTAGAGCTTTGCAATCCTTG-3> Pst I
[0021]以重组质粒pDXW-10-pyk为模板，P5和P6引物进行PCR扩增，得到含tacM启动子的pyk基因片段，用Sac II和Pst I双酶切pyk基因片段和重组质粒pDXW-10-pfk，胶回收pyk基因片段和线性化的pDXW-10-pfk，连接后转化E.coli JM109感受态细胞，涂布含卡那霉素的固体LB平板，挑取转化子提取质粒进行酶切验证，将重组质粒命名为pDXff-10-pfk-pyko
[0022]3.重组钝齿棒杆菌 SYPA5-5/pDXW-10-pfk_pyk 的获得
[0023]提取重组质粒pDXW-10-pfk-pyk，用电击转化法转化钝齿棒杆菌SYPA5-5，涂布含有30μ g.mL—1卡那霉素的固体LBG平板筛选，获得重组钝齿棒杆菌SYPA5-5/pDXff-10-pfk-pyko
[0024]用所述重组钝齿棒杆菌发酵生产L-精氨酸的方法:
[0025]培养基组成:摇瓶种子培养基以g. 1计:葡萄糖30，玉米浆20，(NH4)2S0420，尿素 1.5，KH2PO4I, MgSO4.7Η200.5 ；ρΗ7.0 ~7.2，121°C灭菌 20min，装液量 25mL/250mL ；
[0026]摇瓶发酵培养基以g.L—1计:葡萄糖150，CaC0330, (NH4) 2S0420,酵母粉8，KH2PO4L 5，MgSO4.7Η200.5，FeSO4.7Η200.02，MnSO4.H2O0.02，组氨酸 5Χ 1θΛ 生物素8Χ 10-5 ；ρΗ7.0 ~7.2，121°C灭菌 20min，装液量 25mL/250mL ；[0027]5L发酵罐发酵培养基以g.l-1计:葡萄糖150，(NH4)2S0420，酵母粉8，KH2PO4L 5，MgSO4.7Η200.5，FeSO4.7Η200.02，MnSO4.H2O0.02，组氨酸 5 X 10_4，生物素 8 X 10_5，氨水控制 ρΗ7.0 ~7.2，121°C灭菌 lOmin，装液量 3L/5L ；
[0028]培养条件:种子培养:固体LBG平板中挑取钝齿棒杆菌单菌落接种种子培养基中，往复式摇床220r.π?η'βΟ?培养14h ；
[0029]摇瓶发酵培养:以8%接种量转接到发酵培养基中，往复式摇床220r.min^,30°C发酵96h ；
[0030]5L发酵罐培养:以8%接种量，通气量3L.mirT1，转速600r.mirT1，30°C发酵96h ；
[0031]本发明的有益效果:本发明以pDXW-ΙΟ为表达载体，成功构建了串联共表达载体pDXW-10-pfk-pyk，并电转到钝齿棒杆菌SYPA5-5中，对重组菌中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的酶活性进行测定，并对重组菌的发酵特性进行初步分析，结果显示重组菌5L发酵罐发酵96h精氨酸产量为48.7g.L_\比原始菌提高了 27.5%。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1 质粒pDXW-10-pfk 的酶切验证。I:pDXff-10-pfk/EcoR I ；2:pDXff-10-pfk/EcoRI+Xho I ；M1:DNA Marker: λ -Hind III ；M2:DNA Marker:DL2000
[0033]图2 质粒 pDXff-10-pyk 的酶切验证。I:pDXff-10-pyk/Bgl II ；2:pDXff-10-pyk/Bglll+Pst I ；M1:DNA Marker: λ -Hind III ；M2:DNA Marker:DL2000
[0034]图3重组质粒pDXW-10-pfk-pyk的构建。
[0035]图4 质粒 pDXff-10-pfk-pyk 的酶切验证。I:pDXff-10-pfk-pyk/Pst I ；2:pDXff-10-pfk-pyk/Pst I+Sac II ；M1:DNA Marker: λ -Hind III ；M2:DNA Marker:DL2000
[0036]图5重组菌5L发酵发酵产精氨酸。▲ /_:出发菌； /_:重组菌
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例，对本发明进一步说明。
[0038]实施例1:重组质粒pDXW-10-pfk和pDXW_10-pyk的构建
[0039][I]以钝齿棒杆菌染色体为模板，利用实施例1提供的引物做PCR扩增，扩增条件为:94°C 预变性，5min，一个循环;94°C变性，lmin，56 °C 退火，lmin，72 °C 延伸，lmin30s，30个循环；72°C，10min，一个循环；15°C，lOmin，一个循环。PCR扩增体系:模板(钝齿棒杆菌染色体 DNA) 2 μ L，上下游引物各 0.5 μ L，dNTP Mix4 μ L, 1XEx Taq Buffer5 μ L,灭菌的双蒸水37 μ L，Ex Taq DNA聚合酶I μ L。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，_20°C冰箱保存备用。
[0040][2]构建重组质粒 pMD18-T_pfk 和 pMD18_T-pyk 导入感受态 E.coli JM109。连接体系:PCR胶回收产物4.8 μ L，solut1n 15 μ L，pMD18_T质粒0.5 μ L，16°C过夜连接。转化方法:将连接好的 10 μ L pMD18-T-pfk 和 pMD18_T-pyk 加入到 120 μ L 感受态 E.coil JM109中，于冰上放置45min，42°C热击90s，放置冰上2min，加入800 μ L LB液体培养基，37°C摇床培养lh，离心，倒掉大部分上清液，留150 μ L与沉淀混匀，涂布到氨苄青霉素平板(Amp+LB)上，于37 °C培养箱培养9h左右，挑去平板上的阳性菌落到1ml液体LB培养基中，37 °C摇床过夜培养。提取质粒，经酶切验证连接成功后，将菌液加入终浓度17% (w/v)的甘油，-40°C冰箱保藏。
[0041][3]将重组质粒pMD18-T_pfk和质粒pDXW-ΙΟ分别用EcoR I和Xho I进行双酶切，将重组质粒pMD18-T-pyk和质粒pDXW_10分别用BglII和Pst I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系:目的基因酶切产物7.0y L，pDXW-ΙΟ酶切产物
1.0 μ L，T4DNA连接酶bufferl μ L，T4DNA连接酶I μ L，16°C过夜连接。将连接好的重组质粒pDXW-10-pfk和pDXW-10-pyk转化到感受态E.coli JM109，用卡那霉素平板(Kana+LB)挑取阳性菌落。37°C摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，-20°C冰箱保藏备用。
[0042]实施例2:重组质粒pDXW-10-pfk-pyk的构建
[0043][I]以重组质粒pDXW-10-pyk为模板，利用实施例2提供的引物做PCR扩增，扩增条件为:94 V预变性，5min，一个循环；94 °C变性，Imin，56 °C退火，Imin，72 °C延伸，lmin30s，30个循环；72°C，10min，一个循环；15°C，10min，一个循环。PCR扩增体系:模板(钝齿棒杆菌染色体DNA) 2 μ L，上下游引物各0.5 μ L，dNTP Mix4 μ L，1XEx TaqBuffer5 μ L，灭菌的双蒸水37 μ L,Ex Taq DNA聚合酶I μ L。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20°C冰箱保存备用。
[0044][2]将上述PCR产物(含tacM的pyk基因片段)和重组质粒pDXW-10-pfk分别用Sac II和Pst I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系:目的基因酶切产物 7.0 μ L，pDXff-10-pfk 酶切产物 1.0 μ L，T4DNA 连接酶 bufferl μ L, T4DNA 连接酶I μ L，16°C过夜连接。将连接好的重组质粒pDXW-10-pfk-pyk转化到感受态E.coli JM109，用卡那霉素平板(Kana+LB)挑取阳性菌落。37°C摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，_20°C冰箱保藏备用。
[0045]实施例3:重组钝齿棒杆菌SYPA5-5/pDXW-10_pfk-pyk的获得
[0046]提取重组质粒pDXW-10-pfk-pyk，用电击转化法转化钝齿棒杆菌SYPA5-5，涂布含有30 μ g -mL-1卡那霉素的固体LBG平板，约36h长出转化子。随机筛选转化子接种液体LB培养基，提取质粒验证正确后，获得重组钝齿棒杆菌SYPA5-5/pDXW-10-pfk-pyk。
[0047]为确定磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶在重组菌中的表达情况，进一步测定重组菌中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性，结果如表1所示。
[0048]表1重组菌SYPA5-5/pDXW-10-pfk-pyk中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶比活力
[0049]
【权利要求】
1.一种重组质粒 pDXW-10-pfk-pyk,其特征是以 Corynebacterium crenatum SYPA5-5基因组DNA为模板，扩增得到编码磷酸果糖激酶的基因(SEQ ID NO:1所示序列)和丙酮酸激酶的基因(SEQ ID勵:2所示序列)，将其串联到表达载体？0乂1-10上，获得重组质粒pDXff-10-pfk-pyko
2.权利要求1所述重组质粒的构建方法，其特征是串联表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，构建方法为根据C.crenatum SYPA5-5的全基因组序列，设计磷酸果糖激酶基因pfk的PCR 上游引物 5’ -ACCGGAATTCGAAAGGACATGGAAGACATGCGAATTG-3> (EcoRI)和下游引物 5’ -ACCGCTCGAGCTATCCAAACATTGCCTGG-3，(XhoI)，丙酮酸激酶基因 pyk 的 PCR 上游引物 5’-GGAAGATCTGAAAGGACATGAACGATGGGCGTGGATAGACGAAC-3，(BglII)和下游引物 5’ -CGCCTGCAGTTAGAGCTTTGCAATCCTTG-3’ (PstI)，扩增得到pfk基因和pyk基因，与克隆载体pMD18_T连接构建克隆载体 pMD18-T-pfk 和 pMD18-T-pyk，用 EcoRI 和 XhoI 双切 pMD18_T_pfk 和 pDXW-10，胶回收Pfk基因片段和线性化pDXW-ΙΟ载体，连接后转化E.coli JM109,获得重组质粒pDXW-10-pfk，用BglII和PstI双切pMD18_T_pyk和pDXW_10，胶回收pyk基因片段和线性化pDXW-ΙΟ载体，连接后转化E.coli JM109,获得重组质粒pDXW-10-pyk，再以pDXW-10-pyk为模板，5’ -TCCCCGCGGTCCGGAGCTTATCGACT-3，(SacII)和 5’-CGCCTGCAGTTAGAGCTTTGCAATCCTTG-3’ (PstI)为引物进行PCR扩增，得到含tacM启动子的pyk基因片段，用SacII和PstI双酶切pyk基因片段和重组质粒pDXW-10-pfk，胶回收pyk基因片段和线性化的pDXW-10-pfk，连接后转化E.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒pDXW-10-pfk-pyk。
3.一株串联加强表达磷酸果糖激酶和丙酮激酶的重组钝齿棒杆菌C.crenatumSYPA5-5/pDXff-10-pfk-pyk,其特征是将权利要求2中构建的重组质粒pDXW-10-pfk-pyk电击转化到C.crenatum SYPA5-5中，测定磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的酶活,重组菌中磷酸果糖激酶的比酶活为0.51U.mg—1和丙酮酸激酶的比酶活为2.85U.mg—1，分别比原始菌提高了 3.2倍和4.0倍。
4.利用权利要求3所述的重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pDXff-10-pfk-pyk进行发酵培养合成精氨酸，其特征是经种子活化后。种子液以8% (v/v)接种量转接5L发酵罐发酵培养基(g.L1:葡萄糖 150，(NH4) 2S0420，酵母粉 10，KH2PO4L 5，MgSO4.7Η200.5，FeSO4.7Η200.02，MnSO4.H2O0.02，组氨酸 5 X 10_4，生物素 8 X 10_5，氨水控制 ρΗ7.0 ~7.2，装液量3L/5L ;通气量3L 转速600r.min—1，30°C发酵96h，重组菌L-精氨酸产量为.48.7g.L-1，比出发菌株提高27.5%。
【文档编号】C12R1/15GK104031934SQ201410249910
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】饶志明, 徐美娟, 许正宏, 张显, 杨套伟, 耿燕, 卢妍 申请人:江南大学