专利名称：一种磷酸果糖激酶及其编码基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种橡胶树磷酸果糖激酶及其编码基因与应用。
背景技术：
糖酵解是存在一切生物体内糖分解的普遍途径，该途径在细胞质中分解葡萄糖生成丙酮酸，此过程中有少量ATP和NADH生成，同时还会产生一些重要的前体代谢物，为生物体提供必须的碳源和能源，是处于中枢位置的代谢途径(Plaxton，WC.The organization and regulation of plant glycolysis.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol..1996;48:185 - 214.)D因此，糖酵解过程的精确调节，在生物体的生长发育及生物与非·生物胁迫中起着重要作用，以满足机体的需要并保持内环境的稳定，而此过程中的调控及调节主要是通过调节酶的活性来实现的(Danson J, WasanoK，Nose A.1nfection of rice plants with the sheath blight fungus causesan activation of pentose phosphate and glycolytic pathways.Eur.J.Plant.Pathol..2000;106:555-61.Mutuku M，Nose A.Changes in the contents of metabolitesand enzyme activities in rice plants responding to Rhizoctonia soIani (Kuhn)infection:activation of glycolysis and connection to phenylpropanoidpathway.Plant Cell Physiol..2012; 53 (6): 1017-32.)。很多研究认为憐酸果糖激酶是糖酵解途中的一个限速酶，糖酵解的速度取决于此酶的活性，并且它的存在可以作为糖酵解途径存在的标志(Racker E.The rate-limiting steps in glycolysis.Trends Biochem Sc1..1984; 9:516.)。磷酸果糖激酶(PFK-1 )，在 ATP 和 Mg2+参与下，催化果糖-6-磷酸生成果糖-1，6-双磷酸，此催化反应为不可逆反应，是糖酵解途径的一个速率控制位点。PFK-1广泛的存在于植物中，该酶由四个同源或异源亚基组成，每一个亚基都与其他两个亚基紧密接触，每两个亚基形成一个超结构，因此该酶在行使其催化功能过程中保持了较为稳定的空间构象(宋惠萍.磷酸果糖激酶的进化.国外医学分子生物学分册.1985:7(5):229-232.)。2007年，在拟南芥中分离得到7个依赖于ATP的磷酸果糖激酶基因，且7个PFK-1基因具有组织特异性表达，并对其进行了亚细胞定位(Mustroph A, Sonnewald U，Biemelt S.Characterisation of theATP—dependent phosphofructokinase gene family from Arabidopsis thaliana.FEBS.LETT..2007;581 (13):2401-10.)。糖酵解途径也被认为是水稻爆发纹枯病的一个重要代谢变化过程，关键酶磷酸果糖激酶(PFK-1)在此过程中诱导上调表达(Mutuku JMj NoseA..High activities and mRNA expression of pyrophosphate-fructose-6-phosphate-phosphotransferase and6-phosphofructokinase are induced as a response toRhizoctonia solani infection in rice leaf sheaths.Physiological and MolecularPlant Pathology.2007;77(I):41-51.)。巴西橡胶树是四大工业原料之一天然橡胶的主要来源，天然橡胶具有合成橡胶所不可比拟的综合优良特性，具有极高的经济价值及应用前景。糖酵解为橡胶树的生命活动提供了部分能量，为其他代谢途径提供中间产物(提供碳骨架)，同时又是有氧代谢的准备阶段(d’Auzac Jj Jacob JL.Regulation of glycolysis in the latex of Heveabrasiliensis.J.Rubber Res.1nst.Malaya.1969; 21:417.)。因此，糖酵解在橡胶树生长发育及抵御生物与非生物胁迫中具有重要的作用，分析糖酵解的关键酶一磷酸果糖激酶(PFK-1)将有助于进一步了解橡胶树糖酵解的调控机制及其在橡胶树代谢活动中的作用。目前，橡胶树糖酵解关键酶一磷酸果糖激酶(PFK-1)的基因及其酶活特性未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种磷酸果糖激酶及其编码基因与应用。本发明所提供的磷酸果糖激酶，来源于大戟科橡胶树属的巴西橡胶树(Heveabrasiliensis),名称为HbPFK-1-2,是如下I)或2)的蛋白质:I)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列I的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列I所示蛋白具有相同活性的由I)衍生的蛋白质。序列表中的序列I由475个氨基酸残基组成。为了便于序列I编码的HbPFK-1-2纯化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列
权利要求
1.一种蛋白质，是如下I)或2)所示的蛋白质: 1)由序列表中的SEQID N0.1的氣基酸残基序列组成的蛋白质； 2)将序列表中的SEQID N0.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸果糖激酶功能的由SEQ ID Na:1衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于:所述蛋白质为具有磷酸果糖激酶功能的蛋白质。
3.权利要求1或2所述的蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因的cDNA核苷酸序列如下1)、2)、3)或4)所示: 1)序列表中SEQID Na:2的核苷酸序列； 2)序列表中SEQIDNa:2自5'末端第127-1554位核苷酸所示的核苷酸序列； 3)在严格条件下可与I)或2)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列； 4)与序列表中SEQID Na:2的核苷酸序列具有90%以上的同源性的且编码蛋白具有磷酸果糖激酶功能的核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因的基因组基因的核苷酸序列如下1)、2)、或3)所示: 1)序列表中SEQID Na:3的核苷酸序列； 2)在严格条件下可与I)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列； 4)与序列表中SEQ ID Na:3的核苷酸序列具有90%以上的同源性的且编码蛋白具有磷酸果糖激酶功能的核苷酸序列。
6.含有权利要求3或4或5所述的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
7.权利要求1所述的蛋白及其编码基因在培育能以甘露醇为唯一碳源培养的转基因工程菌中的应用。
8.权利要求1所述的蛋白及其编码基因在培育能以甘露醇为碳源培养的转基因工程菌中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于:所述培育能以甘露醇为唯一碳源培养的转基因菌株的方法或者培育能以甘露醇为碳源培养的转基因工程菌的方法是将权利要求3、4或5所述的基因转入出发菌株中，筛选得到转基因工程菌；所述出发菌株为大肠杆菌，优选为大肠杆菌磷酸果糖激酶缺陷株RL257 ;所述权利要求3、4或5所述的基因通过重组表达载体转入出发菌株中；所述重组表达载体为将权利要求3、4或5所述的基因与PEASY-El连接获得的重组表达载体。
10.权利要求1所述的蛋白及其编码基因在制备磷酸果糖激酶中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种磷酸果糖激酶及其编码基因与应用。该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID№.1的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID№.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸果糖激酶的由SEQ ID№1衍生的蛋白质。该蛋白经转基因实验表明，该基因具有磷酸果糖激酶功能，该基因的cDNA转入磷酸果糖激酶缺陷株RL257后获得的转基因菌株可以在以甘露醇为唯一碳源的M63基本培养基上正常生长。
文档编号C12R1/19GK103146662SQ20131009594
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月25日 优先权日2013年3月25日
发明者龙翔宇, 唐朝荣, 方永军, 阳江华, 戚继艳, 秦云霞 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所