磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药技术领域，具体涉及一种磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液 相色谱检测方法。
【背景技术】
[0002] 磷酸肌酸是一种含有高能磷酸键化合物，在肌肉收缩的能量代谢中发挥重要作 用。它是心肌和骨骼肌的化学能量储备，并用于ATP的再合成。临床上采用肌肉注射或静 脉注射外源性磷酸肌酸二钠盐来治疗缺血状态下的心肌代谢异常，以及在心脏手术时将磷 酸肌酸二钠盐加入心脏停搏液中保护心肌。磷酸肌酸二钠盐作为心肌保护剂药品已经在国 内外已上市应用多年。
[0003] 目前外源性磷酸肌酸的制备方法有化学合成法、生物提取法和酶法。生物提取法 和酶法由于成本高、相对效率较低等原因，一定程度上限制了其应用。用化学合成法制备 磷酸肌酸是目前获得外源性磷酸肌酸的一个主要途径，其中以肌酐为原料合成磷酸肌酸的 方法（专利200710038838. X)是目前应用最广的方法之一。在以肌酐为原料生产磷酸肌酸 时，肌酐与三氯氧磷缩合反应过程中会有副反应，该副反应产物随后续工艺过程，最终形成 与磷酸肌酸钠极性近似的水溶性副产物，易于混到产品中影响终产品质量，目前对副反应 产物的检测未见有文献报道。
[0004] 磷酸肌酸目前在临床上最主要的用途，是制成注射用磷酸肌酸钠。注射剂相比其 它剂型，对产品的品质和安全性有更高的要求。对磷酸肌酸钠粗品及成品中因副反应产生 的杂质化合物进彳丁检测，并对之在终广品中实现有效控制，有助于提尚药品质量稳定性和 临床用药安全性。
【发明内容】
[0005] 本发明主要提供了 一种磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法， 来控制磷酸肌酸钠粗品及终产品中化合物Ia的含量，能加强对磷酸肌酸钠质量的有效控 制。其技术方案如下：
[0006] -种磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，所述杂质化合物具 有如下式（Ia)所示的结构：
[0008] 以肌酐为原料生产磷酸肌酸钠，是当前主流的生产工艺之一。我们在质量提升研 究过程中，发现了化合物Ia，它是工艺过程中一个主要的副产物。该化合物的结构，从未见 过文献报道，推断经由以下的途径生成：
[0010] 该化合物的理化性质和磷酸肌酸钠接近，易于混在终产品中影响产品质量，因此 有必要对粗品及终产品中的化合物Ia进行含量检测，控制该成分的含量以保证产品质量。
[0011] 具体检测条件及检测方法为：
[0012] 检测条件如下
[0013] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相中以乙腈或甲醇为有机相、以缓冲盐 及离子对试剂的水溶液为水相，检测器为紫外检测器。
[0014] 其中，有机相与水相的体积比为0-40:60-100,优选的，为20:80。
[0015] 优选的，有机相为乙腈。
[0016] 优选的，水相中缓冲盐为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾，离子对试剂为四丁基氢氧化 铵或四丁基溴化铵或十二烷基三甲基氯化铵，PH为4-8 ;更优选的，水相中缓冲盐含量为 0· 2wt %，离子对试剂含量为0· Iwt %，pH为6. 3-6. 8。
[0017] 紫外检测波长为210nm。
[0018] 检测方法如下：
[0019] 对照品：以Ia、Ib、Ic或Id为对照品，Ib、Ic、Id具有式（I )所示的结构通式：
[0021] 其中，对于Ib，Ml为Na，M2为H ;对于Ic，Ml为K，M2为K ;对于Id，Ml为K，M2为 H；
[0022] la、lb、Ic和Id的制备方法如下：
[0023] (I)Ia 的制备
[0024] 富集副产物的磷酸肌酸二钠盐粗品，加甲醇超声处理两次，倾去上层，沉淀加水 使溶解，再加入甲醇或乙醇，搅拌均匀，过滤，滤液于〇~10°c放置结晶，再用水-甲醇或 水-乙醇重结晶一次，滤出，干燥，即可得化合物Ia纯品，纯度大于98% ;
[0025] (2) Ib 的制备
[0026] 取化合物Ia加水溶解，用IM HCl调PH至3~4,加入乙醇搅，抽滤，即得化合物 Ib ;
[0027] (3) Ic 的制备
[0028] 将由肌酐和三氯氧磷缩合反应得到的肌酐磷酰氯，边搅拌边缓慢加入到质量浓度 为20 %的KOH溶液中，搅拌过夜，用盐酸调PH至7~8,搅拌下加入溶液体积4倍量的乙 醇，静置数小时后，抽滤，得到磷酸肌酸钾粗品，富集副产物后，加甲醇超声处理两次，倾去 上层，沉淀加水使溶解，再加入甲醇或乙醇，搅拌均匀，过滤，滤液于〇~l〇°C放置结晶，再 用水-甲醇或水-乙醇重结晶一次，滤出，干燥，即得到化合物Ic纯品；
[0029] (4) Id 的制备
[0030] 取化合物Ic加水溶解，用IM HCl调PH至3~4,加入乙醇搅拌，抽滤，即得化合物 Id〇
[0031] 具体检测步骤为：
[0032] 取Ia、Ib、Ic或Id纯品，溶解于流动相中，分别制成50 μ g/ml的对照液1和5 μ g/ ml的对照液2 ;取待测样品溶解于流动相中，配制成5mg/ml的待测液；待测液为磷酸肌酸 钠粗品时使用对照液1，分别吸取20 μ 1的对照液1和待测液注入液相色谱仪，测定磷酸肌 酸钠粗品中Ia的含量；待测液为磷酸肌酸钠精制品时使用对照液2,分别吸取20 μ 1的对 照液2和待测液注入液相色谱仪，测定磷酸肌酸钠精制品中Ia的含量。
[0033] 采用上述磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，本发明具有以 下优点：
[0034] 本发明提供了一种检测磷酸肌酸钠副产物杂质Ia的高效液相检测方法，来控制 粗品及终广品中化合物Ia的含量，能加强对憐酸肌酸纳质量的有效控制，有助于提尚临床 用药的安全性和有效性。
【附图说明】
[0035] 图1和图2为化合物Ia的结构图；
[0036] 图3为测定磷酸肌酸钠粗品中杂质Ia的HPLC色谱图；
[0037] 图4为测定磷酸肌酸钠精制品中杂质Ia的HPLC色谱图。
【具体实施方式】
[0038] 具体实施例
[0039] 实施例1
[0040] 化合物Ia的制备
[0041] 取经富集副产物的磷酸肌酸钠粗品60g，加入200ml甲醇超声约5min，放置，倾去 上层液体，沉淀再同样处理一次，倾去上层液体，沉淀加入140ml水使溶解，再加入420ml甲 醇，搅拌均匀，过滤，滤液于l〇°C放置结晶，次日过滤，得晶体11. 0g，加30ml水和100mL甲 醇重结晶一次，滤出晶体，室温鼓风干燥2小时，得到7.6克，用实施例8中的HPLC方法检 测纯度，纯度为98. 6% (面积归一法）。
[0042] 实施例2
[0043] 化合物Ia的结构确证
[0044] 样品来源：
[0045] 实施例1得到的化合物Ia纯品。X衍射测试所用的单晶来自实施例1重结晶过程 中挑选出的单晶。
[0046] 测试内容：
[0047] 1H NMR ;31P NMR ;ESI质谱；ESI高分辨质谱；X单晶衍射；卡尔一费休氏法测定水 分。
[0048] 测试结果：
[0049] A :? NMR(D20, 400M)，δ 3. 82 (2H，s，CH2)，2. 82 (3H，s，CH3)。
[0050] B :31P NMR(D20, 400Μ)，δ -〇. 15, δ -9. 69,（未用磷酸做参比），两单峰积分比例为 1 :1〇
[0051] C :ESI质谱（正离子），出现361. 8[M+Na]+离子峰和700. 8[2M+Na] +离子峰。
[0052] D :ESI (正离子）高分辨质谱
[0053] 表1结果
[0055] E :X单晶衍射结果显示的结构，见图1和图2，单晶晶体数据见表2所示：
[0056] 表2化合物Ia的8水合物单晶的晶体数据
[0057]
[0059] F :卡尔-费休氏法测定水分结果：30. 06%。
[0060] 解析：? NMR谱中显示CH2 [ δ 3. 82, 2个H，单峰]和CH3 [ δ 2. 82, 3个H，单峰]的 信号，其化学位移值与磷酸肌酸中相应的化学位移值接近，表明含有肌酸或肌酐结构片段。 磷谱中，显示两个1 :1的单峰，表明含有两个化学环境不同的磷酸根基团。ESI质谱显示了 分子加钠离子峰及相应2倍离子峰，ESI高分辨质谱显示的分子式与X单晶衍射得到的结 果完全相符。X单晶衍射显示含8个结晶水，含8个结晶水时，水分含量理论值为29. 81 %， 这与卡尔-费休氏法测定水分的结果非常接近，两者结果能相互印证。因此化合物Ia的8 水合物的立体结构为如附图1、图2所示。
[0061] 实施例3
[0062] 化合物Ia的不同干燥条件与结晶水含量
[0063] 取实施例1中得到的晶体2份，每份0.5克，精密称定后，按照下面的方法进行干 燥：1、40°C鼓风干燥3小时；2、60°C鼓风干燥2小时。于干燥器中冷却至室温后，精密称定 重量，按照实施例8中的HPLC条件测定纯度，计算失重及干燥后结晶水含量η。结果如下 表：
[0064] 表3化合物I a的结晶水含量
[0065]
[0066] 买施例4
[0067] 化合物Ib的制备
[0068] 取化合物Ia 0. 5克，加入2ml水溶解，用IM HCl调PH至3~4,加入IOml乙醇， 搅拌1小时，抽滤，得化合物Ib，40°C鼓风干燥3小时，得0. 45克。
[0069] 用实施例8中的HPLC方法检测纯度，98. 7 % (面积归一法）。ESI质谱（正离 子）：340. 3[M+Na] +。卡尔-费休氏法测定水分：10. 94%。
[0070] 实施例5
[0071] 化合物Ic的制备
[0072] 将由肌酐和三氯氧磷缩合反应得到的肌酐磷酰氯，在搅拌下缓慢加入到体积浓度 20 % KOH溶液中，搅拌过夜，用盐酸调PH7~8，搅拌下加入溶液体积4倍量的乙醇，静置数 小时后，抽滤，得到磷酸肌酸钾粗品，富集副产物后，再用与实施例1中相似的方法处理，得 到化合物Ic纯品。
[0073] 用实施例8中的HPLC方法检测纯度，99. 1 % (面积归一法）。ESI质谱（正离 子）：410. 5[M+Na] +。卡尔-费休氏法测定水分：16. 21%。
[0074] 实施例6
[0075] 化合物Id的制备
[0076] 取化