检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术实现CK-MB高灵敏定量检测的方法，特别公开了一种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片，可实现全血样本中CK-MB的准确、高灵敏定量检测，属于微流控芯片化学发光免疫检测技术领域。
【背景技术】
[0002]当前我国心血管疾病的防控形势依然严峻，心血管疾病发病率呈不断上升态势。据统计，心血管病死亡率占人口死亡的40%，因此做好早发现、早预防、早救治，提高心血管病防治水平是关键。心血管疾病常用检测指标为心肌酶谱系列。心肌酶是指心肌细胞内的酶类物质，具有催化心肌细胞代谢和调节心肌细胞电活动的作用。心肌酶谱包括乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)等。如心肌细胞受损，这些酶会释放到血液。因此心肌酶谱升高程度可间接衡量心肌细胞的损害程度。其中CK和CK-MB是灵敏度较高的指标，能在发病早期心肌尚未大面积坏死时，在患者血液中检测出来，第一时间为临床提供可靠资料。
[0003]CK是由两种不同亚基(M和B)组成的二聚体，正常人体组织主要含3种同工酶，SPCK-MM、CK-BB、CK-MB<XK-MM主要存在于肌肉细胞中，CK-BB主要存在于脑细胞中，CK_MB主要存在于心肌细胞中。
[0004]CK-MB是目前常用的心肌损伤标志物，曾一度被视为诊断心肌梗死的“金标准”。CK-MB在急性心肌梗死发病后4?8小时内增高，24小时达峰值，两三天恢复正常。CK-MB因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。
[0005]传统上多用酶联免疫吸附法、化学发光法及胶体金免疫层析法等测定血清中的CK-MB。但酶联免疫吸附法操作复杂，检测耗时长;化学发光法对技术要求高，不易在临床实验室中进行常规开展。胶体金免疫层析法虽然具有标本用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到某些样本中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低。
[0006]中国专利200610114997.9公布了一种血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法，其主要利用肌酸激酶催化磷酸肌酸与二磷酸腺苷反应生成三磷酸腺苷和肌酸，再用甘油激酶催化三磷酸腺苷和甘油生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油被磷酸甘油氧化酶氧化并产生过氧化氢，再经过氧化物酶作用，过氧化氢使鲁米诺氧化而发光。中国专利200520041211.6披露了一种心血管疾病诊断和预测多指标蛋白芯片检测试剂盒，该试剂盒采用化学发光法(如辣根过氧化氢酶和鲁米诺)检测，并能同时检测C反应蛋白、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白1、肌酸激酶同工酶等八种抗体。虽然化学发光法灵敏度较高，但重复性和稳定性均较差，且配套仪器昂贵，不能单人份快速即时检测，限制了他们的广泛应用。
[0007]因此开发快速、准确、灵敏度高的检测方法，具有巨大发展潜力和应用前景。与荧光和吸收光相比，化学发光没有外来激发光源背景信号干扰，交叉干扰小，灵敏度高、线性范围宽。微流控芯片技术把样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，可完成全过程分析。
[0008]针对现有CK-MB检测方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化学发光方法利用磁微粒化学发光和微流控技术，可实现对CK-MB准确、高灵敏定量检测。
【发明内容】
[0009]本发明要解决的技术问题为针对现有快速诊断方法灵敏度低、重复性差、受干扰明显，以及现有化学发光配套仪器昂贵、检测时间长的问题，提供一种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片，通过集成化芯片(把除测试样本外所有组分均集成到芯片内)并配套小型便携设备，从而实现现场样本中CK-MB的快速、准确、高灵敏定量检测。
[0010]为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为:
[0011]—种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片，所述微流控芯片包括顶板(I)结构和底板(2)结构，其中顶板(I)上的气栗(3)、加样口(4)、样本填充区(12)、标记抗体存储池(5)和样本混合区(13)依次连接;底板上的过滤区(6)、磁颗粒包被区(7)、清洗区(14)、检测区(8)、液体释放通道(16)依次连接;底板的检测区(8)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(16)连接；
[0012]所述标记抗体存储池(5)存储预封装酶或发光剂标记抗CK-MB抗体，磁颗粒包被区
(7)包被预封装磁颗粒标记抗CK-MB抗体，清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(I O)存储预封装清洗液和发光基底液;所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集；所述标记抗体存储池、清洗液存储池和发光基底液存储池为液体密封池，可通过外力挤压而局部破裂，释放液体;所述过滤区包含滤血膜，所述顶板(I)与底板(2)用胶带(19和20)密封。
[0013]具体地，本发明所述的微流控芯片，其发光基底液保质期少于I年时应分开，用发光基底液存储池A(23)和发光基底液存储池B(24)替代发光基底液存储池(10)，所述发光基底液存储池A( 23)和发光基底液存储池B (24)通过预混合通道(25)连接。
[0014]具体地，所述磁颗粒标记抗CK-MB抗体使用的磁颗粒为包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物的超顺磁性颗粒，磁颗粒尺寸为0.1??ομπι，与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为500?30000高斯。
[0015]优选地，所述磁颗粒标记抗CK-MB抗体使用的磁颗粒包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，磁颗粒尺寸为I?3μπι，与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为1000?8000高斯。
[0016]具体地，所述酶或发光剂标记抗体溶液、磁颗粒标记抗体溶液和清洗液均包含缓冲液、蛋白质、表面活性剂和防腐剂，且磁颗粒标记抗体溶液还包含糖类。
[0017]具体地，所述酶或发光剂标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl缓冲液;所述磁颗粒标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐温_20和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl缓冲液;所述清洗液包含牛血清白蛋白、曲拉通X-100和Proclin300 的 pH7.4Tris_HCl 缓冲液。
[0018]具体地，所述酶或发光剂标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的pH7.4磷酸盐缓冲液;所述磁颗粒标记抗体溶液包含牛血清白蛋白、酪蛋白、蔗糖、吐温-20、曲拉通X-100和Proc I in300的pH7.4磷酸盐缓冲液;所述清洗液包含牛血清白蛋白、吐温20、曲拉通乂-100和?抓(:1111300的?!17.4磷酸盐缓冲液。
[0019]具体地，本发明所述微流控芯片的配套仪器为小型便携设备，包含挤压气栗和存储池，磁铁移动，发光检测系统等功能。
[0020]本发明所述微流控芯片制备方法如下:
[0021 ]步骤I)酶或发光剂标记抗CK-MB抗体，磁颗粒标记抗CK-MB抗体，这两种抗体可相同或不同；
[0022]步骤2)将酶或发光剂标抗体溶液放入顶板的标记抗体存储池中，密封，将磁颗粒标记抗体溶液放入底板的磁颗粒包被区中，干燥，将清洗液和发光基底液分别注入清洗液存储池和发光基底液存储池中，密封，用胶带(19和20)密封顶板和底板，并组装成微流控芯片。
[0023]本发明提供的一种检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片是一种以化学发光为基础、在微流控芯片上实现CK-MB快速、准确、高灵敏检测的微流控芯片。
[0024]这种芯片是将抗CK-MB抗体修饰酶，抗CK-MB抗体修饰在磁颗粒上，利用抗原抗体作用，如双抗体夹心法原理结合磁颗粒富集、化学发光检测全血样本中是否含有CK-MB，并准确分析其含量。
[0025]本发明中所述酶，包含但不限于过氧化氢酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。发光基底液为酶对应的发光底物(如鲁米诺或金刚烷)和发光增强液(如苯衍生物等增强剂)，其中发光底物和发光增强液可合并，如图1所示混合均匀后注入一个发光基底液存储池(10);但当混合液保质期少于I年时应分开，如图3所示分别注入发光基底