专利名称：具有单读出的通用激酶/磷酸酶测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测激酶或磷酸酶活性的通用测定法及其在生命科学和药物发 现中的用途。
背景技术：
在最近数年中，已经开发出用于体外药理学和高通量筛选(HTS)的检测肽或蛋白 的磷酸化(激酶活性)或去磷酸化(磷酸酶活性)的数种方法。对于这些应用而言，最吸 引人的是具有荧光读出(readout)的检测方法，它们为勻相的、混合并度量的测定法，因此 适用于微型化。常用测定法基于特异性抗体与磷酸基团的结合，但是由于针对磷酸丝氨酸 或磷酸苏氨酸的抗体是序列特异性的，所以基于抗体的测定法不是通用性的。基于固定化 金属离子亲和力的测定法(IMAP)是无需抗体的，因此是通用性的。另一种用于检测激酶活 性的通用测定法是测量ADP产量的Transcreener测定法。在所有这些测定法中，激酶/磷 酸酶活性的检测是基于荧光偏振(FP)或荧光能量共振转移技术(FRET、TR-FRET、HTRF)。但是，这些荧光测量法需要有关不同光参数的多个读出，所述光参数例如偏振、波 长、延时型检测(需要更复杂的仪器操作而不是简单的荧光强度测量)。ADP测定法仅适用 于高ATP/ADP浓度和高转换的酶，并且可能很容易跑出线性的反应范围。而且，这种检测仅 仅是间接的，因为监控的是ATP/ADP消耗，而这种消耗可能不是特异性的，不是特定磷酸酶 或激酶底物的(去_)磷酸化。因此，需要改良的通用激酶和磷酸酶测定法，其允许激酶或磷酸酶活性的有效检 测。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于检测激酶活性或磷酸酶活性的方法，其通过稳健且 可靠的荧光读出实现这种需要。该方法包括以下步骤a)孵育激酶或磷酸酶活性样品与包含具有可检测读出的荧光团的激酶或磷酸酶 底物分子，b)孵育步骤a)的混合物与包含芳族基的检测实体和结合配偶体(binding partner)，其中磷酸化底物分子和检测实体能与结合配偶体结合，并且底物分子和检测实 体与结合配偶体的结合产生改变的荧光团读出，和c)测量步骤b)的混合物中的荧光团读出，其中与空白相比改变的荧光团读出指 示样品中激酶或磷酸酶活性的存在。第二目的，本发明涉及用于检测激酶活性或磷酸酶活性的方法。所述方法包括以 下步骤a)孵育激酶或磷酸酶活性样品与包含芳族基的底物分子，b)孵育步骤a)的混合物与包含具有可检测读出的荧光团的检测实体和结合配偶
4体，其中磷酸化底物分子和检测实体可与结合配偶体结合，并且底物分子和检测实体与结 合配偶体的结合产生改变的荧光团读出，和c)测量步骤b)的混合物中的荧光团读出，其中与空白相比改变的荧光团读出指 示样品中激酶或磷酸酶活性的存在。在本发明的一个实施方案中，荧光团选自由荧光素(Fluorescein)、罗丹明 B (Rhodamine B)、四甲基罗丹明(Tetramethylrodamine)、ATTO 590、ATT0 655, ATTO 680、 Atto 700,MR 121、Bodipy 630/650和Bodipy FL组成的组。优选的荧光团选自由MR 121、 ATTO 590、ATT0 655、Atto 680和ATTO 700组成的组。用于本发明方法的特别优选的荧光 团是MR 121和Atto 700。这些荧光团中的一些的分子结构可在Bioconjugate Chem. 2003, 14，1133-1139 中发现。ATT0 分子可商业得自 Atto-Tec GmbH, Siegen, Germany 在本发明的一个实施方案中，芳族基选自由具有芳族系统的氨基酸组成的组，优 选色氨酸。用于本发明方法的其他适合的芳族基选自如cGMP或cAMP衍生物的分子。底物分子优选为包含至少一个酪氨酸和/或丝氨酸和/或苏氨酸的肽。在另一个实施方案中，该方法用于检测酪氨酸激酶活性且底物肽包含至少一个酪 氨酸。在又一个实施方案中，该方法用于检测丝氨酸激酶活性且底物肽包含至少一个丝氨酸。在又一个实施方案中，该方法用于检测苏氨酸激酶活性且底物肽包含至少一个苏氨酸。在进一步的实施方案中，该方法用于检测磷酸酶活性且底物分子为包含磷酸基、 优选磷酸酪氨酸或磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的肽。在进一步的实施方案中，该检测实体为包含磷酸酪氨酸和/或磷酸丝氨酸和/或 磷酸苏氨酸的肽。在另一个实施方案中，底物分子和检测实体与结合配偶体的结合牵涉离子相互作 用。优选地，结合配偶体选自硬路易斯酸金属离子(例如In3+)或固体如在其表面具有离 子的珠子，例如IMAP珠子。第三目的，本发明涉及用于检测激酶或磷酸酶活性的试剂盒，其包括包含具有可 检测读出的标记的激酶和/或磷酸酶活性底物、检测实体和结合配偶体。第四目的，本发明涉及用于检测激酶或磷酸酶活性的试剂盒，其包括包含芳族基 的激酶和/或磷酸酶活性底物、包含具有可检测读出的标记的检测实体和结合配偶体。发明详述如本文所用的术语“激酶活性”是指激酶对底物的磷酸化。如本文所用的术语“磷酸酶活性”是指磷酸酶对底物的去磷酸化。如本文所用的“荧光团”是指使分子具有荧光的分子的组分。它是分子中的官能 团，可吸收特定波长的能量并以不同(但同样地为特定的)波长再发射。如本文所用的术语“底物分子”是指由激酶或磷酸酶修饰的分子。如本文所用的“检测实体”是指携带具有可检测读出的标记(例如荧光团)的分 子或包含芳族基、例如酪氨酸、色氨酸、cGMP、cAMP衍生物的分子。如本文所用的“结合配偶体”是指能结合磷酸化底物分子和检测实体两者的实体，例如分子。本发明描述了通用的激酶/磷酸酶测定法，其基于以下事实荧光团如噁嗪染料MR121或Atto 700可以被含有芳族基如色氨酸的分子有效地淬灭，形成非荧光基态复合 物。观点就是通过包含芳族基的实体和荧光团实体与结合配偶体的结合，使含有芳族基的 实体和荧光团紧靠，以致于可以通过分子轨道的直接相互作用一或者通过非荧光基态复 合物的形成(“静态淬灭”)或通过碰撞淬灭(“动态淬灭”)一而发生淬灭。与现有淬灭测定法比较，这种淬灭机制比偶极_偶极相互作用如荧光共振能量转 移技术(FRET)的优势在于相互作用长度短得多，淬灭仅在非常高的局部浓度(通常为 mM)发生。对于能量转移，需要供体与受体之间的光谱重叠。当受体游离于溶液中时，这意 味着具有两个适宜分子的双重标记和对供体发射的剩余光吸收。总体上说，由此描述的更 有利的淬灭系统导致更少的非_特异性信号和更高的灵敏度。芳族基和荧光团中的一个是所研究的激酶或磷酸酶活性的底物肽的一部分，而另 一个是检测实体的一部分。结合配偶体结合磷酸化的底物肽和检测实体但不结合未磷酸化 的底物肽，由此可以通过荧光团读出(荧光强度)的减少测量激酶活性，而磷酸酶活性导致 荧光团读出(荧光强度)的增加。荧光团读出可以是例如荧光强度、荧光偏振、发射波长分 布或荧光寿命。结合配偶体是能够结合磷酸基团的实体，优选硬路易斯酸金属离子(例如In3+) 或在表面上具有离子的固体如珠子(例如IMAP珠子)，或类似物。
图1针对用适宜的荧光团(例如MR121或Atto 700)标记的示例性激酶底物和包 含磷酸基和色氨酸的检测实体，显示了测定法原理。底物被激酶磷酸化。当生物化学反应 完成时，加入结合配偶体和检测实体，然后测量荧光。被磷酸化的底物越多，检测到的荧光 越少。稳健且灵敏的荧光读出和简单易行的操作方案使本发明的测定法也适于进行测 定法的微型化(例如在高密度微量滴定板中)或适于在微流体系统中进行处理和读出。附图简述图1显示了通用测定法的原理。荧光标记的底物(用例如MR121或Atto 700标记) 被激酶磷酸化。为了检测磷酸化的底物，将结合配偶体和含有磷酸基和色氨酸的检测实体 加入至底物。磷酸化底物和检测实体都与结合配偶体结合，导致色氨酸对荧光的淬灭；图2显示了在InCl3的存在下MR121( □)和Atto 700(口)荧光的减少。将 20nM MR121-CGpY 或 Atto 700-CGpY 与 1 μ M WGpY 和不同浓度的 InCl3 混合，测量MR121 和 Atto 700荧光。对于MR121实体在40 μ Μ-60 μ MInCl3时达到最高淬灭(初始MR121荧光 的20%)，对于Atto 700实体则在10 μ Μ-100 μ M时达到最高淬灭(初始Atto 700荧光的 15% ) (b)；图 3 显示了在恒定的 MR121-CGpY 和 InCl3 浓度(20nMMR121_CGpY，50 μ M InCl3) 时WGpY的滴定。在700nM WGpY时达到最高淬灭；图 4 显示了在恒定的 WGpY 和 InCl3 浓度(800nM WGpY, 50 μ MInCl3)时 MR121_CGpY 的滴定；图5显示了通过相应地混合MR121-CGpY和MR121-CGY，MR121-CGY肽的O %至 100%磷酸化。800nM WGpY和50 μ M InCl3用作检测实体和结合配偶体。荧光强度随着磷酸化的增加而减至初始荧光的20%。对于>20%的磷酸化，z'因子(十字形)高于0.5， 对于> 40%的磷酸化，高于0. 7 ；和图6显示了在恒定的MR121_CGpY浓度(20nM终浓度)时WGpY(a)和IMAP珠子(b) 的滴定。对于(a)，IMAP珠子的稀释度为1 1000，对于(b)，WGpY的终浓度为80 y M。荧 光强度随着WGpY浓度的增加而减至初始强度的20% (在80 y M WGpY时)。珠子稀释度为 1 500或1 1000时，荧光强度同等地被淬灭至初始强度的20%，珠子稀释度更高，淬灭 效率越低。
实施例材料与方法所有肽底物由Biosyntan GmbH，Berlin合成，纯度为95 %。荧光团MR121的活 性形式由 Roche Diagnostics，Penzberg 提供，Atto 700 的活性形式由 Atto-Tec GmbH, Sieger^Germany提供。按照用马来酰亚胺标记底物的标准操作方案，内部完成MR121-马来 酰亚胺和Atto 700-马来酰亚胺与底物肽的半胱氨酸残基的巯基的共价偶合，然后经使用 C18 柱(Marchery-Nagel，ccl25/4，Nucleosil 100-5，保护 1)的分析型 HPLC (MerckHitachi D-6000)纯化。当InCl3(Sigma-AldriCh Co.，目录号303440)用作结合配偶体时，反应缓冲液为 pH 5. 2 的 lOOmM NaAc/HAc (无水 NaAc，> 99%，S8750，Sigma-Aldrich Co.)。当 IMAP 珠子 作为结合配偶体时，缓冲液为随着IMAP试剂盒(Molecular Devices, 13110rleans Drive, Sunnyvale, CA 94089)提供的80% lx IMAP结合缓冲液A和20% lx IMAP结合缓冲液B。 对于所有实验而言，将10 Pi色氨酸实体、10 yl荧光团实体和20 yl结合配偶体混合，得到 40 u 1的总测定体积。在读荧光强度之前，在RT将板于暗处孵育60分钟。所有测量在384 孔微量滴定板(Cornig B. V.，Koolhovenlaan 12， 1119Schiphol-Rijk, Netherlands，编号3723，通用光学板，透明，非结合表面)中进行。 借助于装备有高压Xe弧光灯的板视觉多功能读出器(EvotecTechnologies GmbH, Schnackenburgallee 114，22525Hamburg，Germany)，对于 MR121 使用 630nm (带宽 50nm)的 激发滤光片和695nm(带宽55歷)的发射滤光片、对于Atto 700使用655nm(带宽50歷)的 激发滤光片和710nm(带宽40nm)的发射滤光片，进行所有荧光强度测量。通过使用衰减滤 光片以及改变暴露时间，将荧光强度调至所用CCD照相机的最大信号的约60%。结果A. InCl3作为结合配偶体P032_是硬路易斯碱，并与硬路易斯酸金属离子形成复合物。磷酸基的氧可与单个 金属离子配位或与一些金属离子交联以形成聚合物型复合物。因此，硬路易斯酸金属离子 可用作结合配偶体，使荧光团实体和色氨酸实体密切靠近以形成非荧光基态复合物。对于 原理的验证，使用分别含有磷酸酪氨酸、酪氨酸和/或色氨酸的短肽作为荧光团_和色氨酸 实体。使用在Cys残基用MR121和Atto 700标记的序列Cys-Gly-Tyr的磷酸化和未磷酸化 肽作为荧光团实体(此后称为 MR121-CGY，MR121-CGpY, Atto700_CGY 和 Atto 700-CGpY)， 检测实体为序列Trp-Gly-pTyr的肽(此后称为WGpY)，其中pTyr为磷酸化酪氨酸。图2 显示了在固定的 MR121-CGpY 或 Atto 700-CGpY 和 WGpY 浓度(终浓度MR121_CGpY 20nM,
7Atto700-CGpY 20nM, WGpY 1 u M)时对 InCl3 作为结合配偶体的滴定。在 50 ii M-100ii M InC13的存在下MR121的荧光发射被淬灭至初始MR121荧光(在缺少InC13时的荧光)的 20%。随着更高的InCl3浓度，MR121荧光增至初始MR121荧光的70% (图2a)，表明MR121 实体和色氨酸实体不再与相同的In-复合物结合。图2b显示了对10 ii M至140 ii M InCl3 的放大，以寻找最佳InCl3浓度。在10iiM 11^13时々《0 700荧光已经被淬灭至其初始荧光 的15%。与MR121实体相同，Atto 700荧光随着更高的InCl3浓度而再次增加。用50 y M InCljnMR121实体进行所有随后的试验。在下一步骤，对WGpY浓度进行优化。图3显示了 在 20nM MR121-CGpY (终浓度)禾口 50 ii M InCl3 (终浓度)时 WGpY 的滴定。在 700nM WGpY 时 荧光强度达到其最小值(图3b)。随着MR121-CGpY浓度升高，荧光强度略微增加(从20nM 时的30%初始强度至lOOnm时的45% )(图4)。在终实验中，测量0% -100%底物磷酸化 的荧光强度(图5)。将MR121-CGpY和MR121-CGY相应地混合，以随着磷酸化肽的增加，得 到20nMMR121-CG(p)Y终浓度。800nM WGpY用作检测实体，50 ii M InC13用作结合配偶体。 荧光强度随着磷酸化增加而线性减少，从初始强度的100%至20%。作为该测定法的质量 的量度，计算了 z'因子。自20%磷酸化起z'因子高于0.5 (理论最大值1)，自40%起高 于 0. 7。B. IMAP珠子作为结合配偶体对于IMAP珠子作为结合配偶体的实验而言，与InCl3作为结合配偶体时相同的短 模型肽用作MR121和色氨酸实体。IMAP珠子具有 lOOnM的直径，显著大于In3+离子，因 此必需高4倍的WGpY浓度以实现MR121实体的良好淬灭。尽管在需要更高试剂浓度这一 意义上IMAP珠子不如InCl3，但是此新的灵敏测定法允许该系统用作结合配偶体。图6a显 示了在IMAP珠子稀释成1 1000时20nM MR121_CGpY的强度随着WGpY浓度升高而减少。 在80iiM WGpY时，MR121荧光淬灭至初始强度的20%。在80 y M WGpY的恒定浓度时，稀释 度更高的IMAP珠子不导致更好的淬灭(图6b)，最佳稀释度在1 500与1 1000之间。结论用本文所述的实施例，我们论述了激酶或磷酸酶活性可通过测量适宜荧光团(例 如MR121，Atto 700)的荧光强度的减少(激酶)或增加(磷酸酶)而进行检测。色氨酸对 荧光团的淬灭是通过非荧光基态复合物的形成而发生的静态淬灭或碰撞淬灭，该淬灭是一 个短程相互作用，其确保只有在荧光团实体和色氨酸实体与结合配偶体结合时才发生。这 与常规FRET测量相反，FRET测量中在高浓度的荧光团时未与结合配偶体结合也可发生受 体对供体发射的吸收。类似于FP测量，此处描述的淬灭测定法需要仅一个标记，但是在FP 中需要两个读出，而该荧光淬灭测量仅需要单读出。稳健且灵敏的荧光读出和操作方案的 简单易行使本测定法还适用于例如在高密度微量滴定板中进行或在微流体系统中的处理 和读出。因为所用的荧光团例如MR121和Atto 700在红光中激发，而在近红外中荧光发 射，所以它已被证明非常灵敏并显示受到例如化合物、生物材料和塑料的自身荧光的干扰 最低。三种组分_荧光团实体、色氨酸实体和结合配偶体_可彼此滴定以找到每一测定试 验的最佳条件，从而提供独特的灵活性。尽管已经列出并描述了本发明的优选实施方案，但是应清楚地理解，本发明并不 限于此，而是可在下述权利要求的范围内另外进行各种变更和实践。
权利要求
检测激酶活性或磷酸酶活性的方法，其包括以下步骤a)孵育激酶或磷酸酶活性样品与包含具有可检测读出的荧光团的激酶或磷酸酶底物分子，b)孵育步骤a)的混合物与包含芳族基的检测实体和结合配偶体，其中磷酸化底物分子和检测实体能与结合配偶体结合，并且底物分子和检测实体与结合配偶体的结合导致改变的荧光团读出，和c)测量步骤b)的混合物中的荧光团读出，其中与空白相比改变的荧光团读出指示样品中激酶或磷酸酶活性的存在。
2.检测激酶活性或磷酸酶活性的方法，其包括以下步骤a)孵育激酶或磷酸酶活性样品与包含芳族基的底物分子，b)孵育步骤a)的混合物与包含具有可检测读出的荧光团的检测实体和结合配偶体， 其中磷酸化底物分子和检测实体能与结合配偶体结合，并且底物分子和检测实体与结合配 偶体的结合导致改变的荧光团读出，和c)测量步骤b)的混合物中的荧光团读出，其中与空白相比改变的荧光团读出指示样 品中激酶或磷酸酶活性的存在。
3.权利要求1或2的方法，其中荧光团选自由荧光素、罗丹明B、TMR、ATT0590、ATT0 655、ATT0 680、Atto 700、MR 121、Bodipy 630/650 和 Bodipy FL 组成的组，更优选选自由 ATTO 590、ATT0 655、ATT0 680、Atto 700 和 MR 121 组成的组。
4.权利要求3的方法，其中荧光团为MR121或Atto 700。
5.权利要求1-4的方法，其中芳族基选自由氨基酸——色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸组 成的组，优选色氨酸。
6.权利要求1-5的方法，其中底物分子和检测实体与结合配偶体的结合涉及离子相互 作用。
7.权利要求1-6的方法，其中结合配偶体选自硬路易斯酸金属离子或在其表面具有离 子的固体如珠子。
8.权利要求1-7的方法，其中检测实体为包含磷酸酪氨酸和/或磷酸丝氨酸和/或磷 酸苏氨酸的肽。
9.权利要求1-8的方法，其中底物分子为包含至少一个酪氨酸和/或色氨酸和/或苏 氨酸的肽。
10.权利要求9的方法，其中所述方法用于检测酪氨酸激酶活性且所述底物肽包含至 少一个酪氨酸。
11.权利要求9的方法，其中所述方法用于检测色氨酸激酶活性且所述底物肽包含至 少一个色氨酸。
12.权利要求9的方法，其中所述方法用于检测苏氨酸激酶活性且所述底物肽包含至 少一个苏氨酸。
13.权利要求1-9的方法，其中所述方法用于检测磷酸酶活性且所述底物分子为包含 磷酸基、优选磷酸酪氨酸或磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的肽。
14.权利要求1-13的方法，其中所述荧光团读出为荧光强度。
15.用于检测激酶或磷酸酶活性的试剂盒，其包括包含具有可检测读出的荧光团的激酶和/或磷酸酶活性底物、检测实体和结合配偶体。
16.用于检测激酶或磷酸酶活性的试剂盒，其包括包含芳族基的激酶和/或磷酸酶活 性底物、包含具有可检测读出的荧光团的检测实体和结合配偶体。
17.基本上如前文所述、尤其参考前面的实施例描述的方法和试剂盒。
全文摘要
本发明涉及用于检测激酶或磷酸酶活性的通用方法。该方法包括以下步骤孵育激酶或磷酸酶活性样品与包含具有可检测读出的荧光团或具有充当荧光团淬灭剂的芳族基的分子的激酶或磷酸酶底物分子，孵育步骤a)的混合物与包含荧光团或具有芳族基的分子的检测实体和结合配偶体，其中底物分子和检测实体能与结合配偶体结合，并且底物分子和检测实体与结合配偶体的结合导致改变的荧光团读出，以及测量步骤b)的混合物中的荧光团读出，其中与空白相比改变的荧光团读出指示样品中激酶或磷酸酶活性的存在。
文档编号G01N33/542GK101802214SQ200880106373
公开日2010年8月11日 申请日期2008年9月1日 优先权日2007年9月10日
发明者D·罗特, T·恩德勒 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司