专利名称：人乳清酸磷酸核糖基转移酶蛋白质的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种针对人乳清酸磷酸核糖基转移酶的新的抗体以及 使用该抗体测定人乳清酸磷酸核糖基转移酶蛋白质的方法。
背景技术：
乳清酸磷酸核糖基转移酶(orotate phosphoribosyl transferase; EC2. 4.2. 10，以下简称为"OPRT")是催化由乳清酸生成尿苷一磷酸(UMP) 的反应的酶，具有供给核酸合成中必需的嘧啶核苷酸的作用，是一种 核酸前体供给途径的主要限速酶之一。因此，已知其在细胞增殖旺盛 的肿瘤组织或消化道上皮中活性很高。
另外，已知5-氟尿嘧啶类的抗癌剂由于发挥出将OPRT作为限速 酶活化的抗肿瘤效果，对于在肿瘤细胞中OPRT量多的患者其效果是 比较大的，被认为具有显著的延长生命的效果，但对于OPRT量少的 患者则效果很小(参照非专利文献l)。因此，在例如对肿瘤患者进行 治疗时，预先测定摘除肿瘤中的OPRT量就成为确定治疗方法、选择 给药的抗癌剂的指标，其重要性是非常高的。
目前，组织中的人OPRT的定量是通过测定mRNA的量或酶活性 来进行的。可是，由于转录后的调节机制等原因，有可能mRNA量的 测定并不能充分反映蛋白质的量和酶活性。另外，通过测定酶活性进 行的定量由于主要采用放射性标记的底物，其操作非常繁杂。将人 OPRT的定量法应用于临床诊断或治疗时，简便而且正确是非常重要 的，因此，迫切希望开发出这样的定量方法。
非专利文献1: Br. J. Cancer.， 2003， Oct, 20; 89(8): 1486-92.
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便并且正确地测定人OPRT的方法。
本发明人制备了针对人OPRT整体的多克隆抗体和针对人OPRT 氨基酸序列中的各种寡肽的抗体，设计将这些抗体进行组合的测定系 统，研究发现，将识别人OPRT从N末端开始的第86位 第108位的 氨基酸区域存在的表位的抗体与识别人OPRT从N末端开始的第454 位 第474位的氮基酸区域存在的表位的抗体进行组合的人OPRT免 疫测定系统，相比于使用其它抗体的测定系统，其灵敏度显著升高， 可以简便且正确地测定人OPRT蛋白质。从而完成了本发明。艮口，本发明提供一种识别人OPRT从N末端开始的第86位 第 108位的氨基酸区域存在的表位的抗人OPRT抗体。另外，本发明还提供一种识别人OPRT从N末端开始的第454位 第474位的氨基酸区域存在的表位的抗人OPRT抗体。另外，本发明还提供一种含有识别人OPRT从N末端开始的第86 位 第108位的氨基酸区域存在的表位的抗人OPRT抗体和识别人 OPRT从N末端开始的第454位 第474位的氨基酸区域存在的表位 的抗人OPRT抗体的人OPRT蛋白质测定用试剂盒。进一步，本发明还提供一种将识别人OPRT从N末端开始的第86 位 第108位的氨基酸区域存在的表位的抗人OPRT抗体和识别人 OPRT从N末端开始的第454位 第474位的氨基酸区域存在的表位 的抗人OPRT抗体进行组合使用的人OPRT蛋白质的测定方法。另外，人OPRT蛋白质的氨基酸序列为按照文献Proceeding of the6， 1988, 1754-1758上记载的序列。 发明效果根据本发明的方法，相比于使用将人OPRT整体作为抗原的抗体 的情况，和使用识别人OPRT从N末端第428位 第446位的氨基酸 区域存在的表位的抗人OPRT抗体的情况，可以简便且正确地定量人 OPRT蛋白质。进一步，通过利用本发明的测定方法对检体的人OPRT 蛋白质进行定量，不但可以进行癌症的诊断、治疗效果预测，而且还
图1为表示抗OPRT抗体的Western blotting的结果的图。 图2为表示将抗OPRT-A抗体、抗OPRT-B抗体和抗OPRT-C抗体 中的2种进行组合使用的夹心ELISA系统的结果。图中A—B:抗 OPRT-A抗体固定化一抗OPRT-B抗体检测。图中B_A:抗OPRT-B 抗体固定化一抗OPRT-A抗体检测。图中B—C:抗OPRT-B抗体固定 化一抗OPRT-C抗体检测。图中C一A:抗OPRT-C抗体固定化一抗 OPRT-A抗体检测。图中C一B:抗OPRT-C抗体固定化一抗OPRT-B 抗体检测。图3为表示使用抗OPRT-C抗体作为固定化抗体、使用抗OPRT-A 抗体作为检测抗体的ELISA系统的标准曲线的图。
具体实施方式
作为本发明中的识别人OPRT蛋白质从N末端开始的第86位 第 108位的氨基酸区域存在的表位的抗人OPRT抗体的抗原，可以使用具 有人OPRT蛋白质从N末端开始的第86位 第108位的氨基酸序列 或者含有该氨基酸序列的连续80%以上的氨基酸序列的合成肽。在后 述中，将使用该抗原得到的抗体称为抗OPRT-A抗体。作为本发明中的识别人OPRT蛋白质从N末端开始的第454位 第474位的氨基酸区域存在的表位的抗人OPRT抗体的抗原，可以使 用具有人OPRT蛋白质从N末端开始的第454位 第474位的氨基酸 序列或者含有该氨基酸序列的连续80%以上的氨基酸序列的合成肽。 在后述中，将使用该抗原得到的抗体称为抗OPRT-C抗体。当使用上述合成肽作为抗原时，为了促进免疫应答，可以将Freimd 佐剂等佐剂与抗原混合使用，也可以使牛甲状腺球蛋白、BSA (Bovine Serum Albumin: 牛血清白蛋白)、KLH (Keyhole limpet hemocyanine: 匙孔血蓝蛋白)等载体与抗原结合使用。本发明中的抗人OPRT抗体只要能够识别所述氨基酸序列的区域 存在的所述表位就可以，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。当采用上述抗原制备抗人OPRT多克隆抗体时，可以按以下制备。 按照常规方法，将所述抗原以必要的次数免疫给兔、大鼠、小鼠、山
羊等各种动物，通过采血获得含有抗人OPRT多克隆抗体的抗血清。 优选将上述合成肽与KLH结合的结合物作为抗原按3周以2次的比例 免疫给兔子，为了从抗血清中纯化抗OPRT抗体，可以按照抗体纯化 的常规方法，通过亲和层析、硫酸铵盐析、离子交换柱层析、分子筛 柱层析(凝胶过滤)、蛋白质A柱层析等进行。而且，出于提高抗体纯 度的目的，既可以组合这些纯化方法，也可以重复进行。进行亲和层析(抗原固定化柱)时，将上述合成肽固定于柱子中， 填充抗血清，在抗OPRT抗体吸附于柱子上以后，使用洗脱液洗脱掉 抗OPRT抗体，通过回收，可以获得高纯度的抗OPRT抗体。采用上述抗原制备抗人OPRT单克隆抗体时，可以按以下方式， 通过制备生产抗人OPRT单克隆抗体的杂交瘤而得到。例如将上述抗 原免疫给小鼠、大鼠等哺乳动物或鸟类后，将其脾脏细胞与小鼠、大 鼠等哺乳动物的骨髓瘤细胞按照Koler和Milstein的基本方法(参照 Nature、第256巻、495页(1975))进行细胞融合，通过在选择性培 养基中培养，可以获得上述杂交瘤。此时的免疫方法可以通过例如将 制备好的抗原溶解于磷酸缓冲液、生理食盐水等中，必要时混合佐剂， 对动物的皮下、脾脏内、腹腔、静脉等处每1 3周进行数次接种，直 到抗体效价(antibodytiter)充分升高。细胞融合中所使用的骨髓瘤细 胞可以列举小鼠P3-NS-l/lAg4.1、 P3-X63-Ag8.653、 Sp2/0Ag14、大鼠 YB2/0等。细胞融合时的融合促进剂可以使用聚乙二醇、仙台病毒等。 也可以使用电脉冲。细胞融合中使用的骨髓细胞为8-氮杂鸟嘌呤耐性 株，由于在核苷酸(nucleotide)生物合成的回收合成(salvage)途径 中缺乏必要的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶，在HAT培养基(含 有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)的培养基) 中不能合成核苷酸，无法生存。因此，细胞融合以后，通过在HAT培 养基培养1周 2周，能够只选择脾细胞与骨髓瘤融合的杂交瘤细胞。这样得到的本发明的抗人OPRT抗体可以用于人OPRT蛋白质的 免疫学测定。例如，用于夹心ELISA法、由竞争法进行的放射性免疫 分析 (competitive radioimmunoassay )、 酶免疫观lj定 (enzyme immunoassay)、 免疫层析法(immunochromatography)等。其中，夹 心ELISA法是特别优选的。
本发明的人OPRT蛋白质测定用试剂盒含有抗OPRT-A抗体和抗 OPRT-C抗体。使用这两种抗体进行夹心ELISA法时，将一个抗OPRT 抗体固定在支撑体(固定化抗体)，将另一个抗OPRT抗体作为标记抗 体(检测抗体)。优选的组合是将抗OPRT-C抗体作为固定化抗体，将 抗OPRT-A抗体作为检测抗体。进行免疫测定例如进行夹心ELISA法时，将一个抗OPRT抗体固 定在ELISA用平板等支撑体上，接着，使被检体反应，进一步再使标 记抗OPRT抗体反应，然后进行清洗，测定夹心免疫反应产生的标记本发明所采用的被检体只要是OPRT能够存在的人组织、体液即 可，例如肿瘤组织、消化道组织、血液、淋巴液等。特别优选肿瘤组 织。本发明中所采用的支撑体例如可以列举琼脂糖、纤维素等不溶性 多糖类、硅树脂、聚苯乙烯树脂、聚丙烯酰胺树脂、尼龙树脂、聚碳 酸酯树脂等合成树脂、玻璃等不溶性支撑体等。这些支撑体可以采用 球珠或平板等形状，当为球珠时，可以采用填充这些球珠的柱子等。 当为平板时，可以使用多孔板(96孔的多孔板等)、生物传感芯片等。 抗OPRT抗体和支撑体的结合可以通过化学结合或物理吸附等通常采 用的方法进行结合。这些支撑体可以使用市售品。抗OPRT抗体与被检体的反应通常在缓冲液中进行。缓冲液可以 使用磷酸缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐 缓冲液等。而且，孵育(incubation)条件例如可以在4。C 室温孵育1 小时 24小时。孵育后的清洗可以是任何清洗方法，只要不影响被检 体中的人OPRT蛋白质与抗OPRT抗体的结合即可。例如，可以使用 含有Tween20等表面活性剂的缓冲液等。在本发明的人OPRT蛋白质测定方法中，除欲检测出人OPRT蛋 白质的被检体以外，还可以设置对照试样。对照试样有不含有人OPRT 蛋白质的阴性对照试样和含有人OPRT蛋白质的阳性对照试样等。通 过比较使用不含有人OPRT蛋白质的阴性对照试样得到的结果和使用 含有人OPRT蛋白质的阳性对照试样得到的结果，可以检测出被检体 中的人OPRT蛋白质。而且，还可以制备浓度呈阶梯变化的一系列对 照试样，将对各对照试样的检测结果作为数值，制成标准曲线，由被 检体的数值，基于标准曲线，可以定量检测出被检体中含有的人OPRT蛋白质。抗OPRT抗体的标记可以采用通常的方法进行。标记物质可以使 用荧光色素、酶、辅酶、化学发光物质、放射性物质等本领域技术人 员公知的标记物质。具体可以列举放射性同位素(32P、 14C、 1251、 3H、 1311等)、荧光素、罗丹明(rhodamine)、丹磺酰氯(dansyl chloride)、 伞形酮(umbdliferone)、荧光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、|3-半 乳糖苷酶、卩-葡糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类 氧化酶(saccharide oxidase)、微过氧化物酶(microperoxidase)、生物 素等。使用生物素作为标记物质时，在添加生物素标记抗体后，优选 再添加结合碱性磷酸酶等酶的抗生物素蛋白(avidin)。标记物质与抗 OPRT抗体的结合可以使用戊二醛法、顺丁烯二酰亚胺法、二硫代吡啶 法(pyridyl disulfide method)、过碘酸法等公知的方法进行。具体地讲，将含有一种抗OPRT抗体的溶液加于平板等支撑体上， 将该抗OPRT抗体固定于支撑体上。清洗平板以后，为了防止蛋白质 的非特异性结合，例如可以用BSA、明胶、白蛋白等进行封闭。再次 清洗，将被检体加到平板上。孵育后，进行清洗，加入另外一种标记 抗OPRT抗体。适度孵育以后，清洗平板，检测残留在平板上的标记 抗OPRT抗体。检测可以根据本领域技术人员公知的方法进行，例如， 当用放射性物质进行标记时，可以用液体闪烁计数法或RIA法检测。 当用酶进行标记时，加入底物，酶引起的底物的变化例如用光度计检 测显色。底物的具体例子可以列举2，2-连氮二 (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、邻苯二胺、3，3',5',5'-四甲基联苯胺(TME) 等。为荧光物质时，则用荧光光度计进行检测。实施例下面，举出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限 于这些实施例。比较例(由使用抗rhOPRT抗体的ELISA法进行的OPRT定量) (1)制备抗原使用培养大肠杆菌而得到的重组人OPRT (rhOPRT)作为抗原。
其制备方法如下用PCR克隆人OPRT的全长cDNA，为了表达谷胱 甘肽-S-转移酶(GST)和rhOPRT的融合蛋白质制作质粒(plasmid)， 将该质粒导入大肠杆菌BL21，在100pg/ml氨苄青霉素(ampicillin) 存在下，在100mL的LB培养基(和光纯药工业公司制造)中37。C振 荡培养一晚。将该培养液10mL移入装有1L的LB培养基的三角烧瓶 中，37。C下进一步培养4小时。离心而集菌后，在100mL的集菌缓冲 液(50mMTris、 8MUrea、 lmMPMSF、 5mMEDTA、 5mM DTT、 pH 7.4)中悬浮菌体，在4'C缓慢搅拌30分钟。将悬浮液在4t:超声破碎 后，在15000Xg、 4"C进行30分钟的离心处理。然后，通过透析处理 将上清中的尿素的浓度慢慢降至1M，进行重折叠(refolding)处理， 通过装有2mL谷胱甘肽(GSH) -Sepharose (Sigma公司制造)的柱子， 用lOmL清洗液(20mMTris、 lMUrea、 5mMEDTA、 pH7.4)进行清 洗，利用洗脱用缓冲液(50mM GSH、 50mM Tris、 pH 9.6)洗脱 GST-rhOPRT，得到rhOPRT溶液。(2) 免疫以GST-rhOPRT作为免疫原，另外使用Freund的完全佐剂(FCA) 或者Freund的不完全佐剂(FIA)，按以下对兔子(white日本白色种) 进行免疫。第1次GST-rhOPRT 0.2mg + FCA S, C.第2次 第8次GST-rhOPRT 0.5mg + FIA S. C.(3) 抗血清的纯化回收免疫的兔子的全血，在1500Xg、 4。C离心5分钟，分离血清。 将得到的抗血清20mL用PBS (-)稀释2倍成为40mL，将该抗血清 稀释液添加到GST蛋白的固定化柱子中，在吸附GST反应性的抗体后， 将流通(flow-through)溶液通过蛋白A固定化柱子，使其结合抗体 (IgG)，使用PBS (-)， 一直清洗到280nm的吸光度消失为止。然后， 将0.2M的Glycine-HCl pH2.5通过柱子，使吸附于抗原上的抗体被洗 脱。另外，此时为了中和pH，在接收洗脱的抗体的试管中预先添加1M Tris，以防止回收的抗体变质。将得到的抗体组分用PBS (-)在4'C透 析一晚，得到纯化抗体。(4) 通过夹心ELISA法进行人肿瘤细胞中的OPRT定量 将抗rhOPRT抗体用0.1mM碳酸缓冲液pH9.6调制成5.0pg/mL， 按O.lmL分注于96孔的ELISA用板上，密封以后在4°C的孵化器内包 覆一晚，得到抗体固定化载体。将96孔板用含有0.05% Tween 20的 PBS (-)清洗2次，加入含有0.1。/。BSA的PBS (-) O.lmL，以封闭非 特异性吸附。用清洗液清洗2次后，添加0.1mL的3、 9、 27倍稀释的 来源于人胃癌的细胞TMK1细胞的组织匀浆(homogenate)(由5X 106 个细胞制备0.2mL的蛋白提取液)，室温下反应1小时。用清洗液清洗 5次后，分注O.lmL用稀释液稀释成0.5pg/mL的过氧化物酶标记抗 rhOPRT抗体，室温下反应30分钟。用清洗液清洗7次后，力Q入0.1mL 的含有1.3mg/mL的邻苯二胺、0.01%的过氧化氢水和lmM EDTA的 0.1M的磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.1 (显色液)，在室温暗处进行30分钟 的酶反应。最后，加入0.1M硫酸0.1mL，停止反应，测定492nm的吸 光度。结果如表l所示。因为吸光度(492nm)很低，并不能完全认为其与稀释倍率的相关 性，因此证明了采用OPRT全长cDNA制备的抗rhOPRT抗体并不适 合于夹心ELISA法。实施例1 (抗体的制备)按以下操作，得到抗OPRT多克隆抗体。 (1)肽合成合成具有人OPRT从N末端开始的第86位 第108位氨基酸序列 的肽、具有人OPRT从N末端开始的第428位 第446位氨基酸序列 的肽、以及具有人OPRT从N末端开始的第454位 第474位氨基酸 序列的肽，得到由以下氨基酸序列组成的人工肽。具有人OPRT从N末端开始的第86位 第108位氨基酸序列的
肽(抗原名OPRT-A)
Cys-Ser-Thr-Asn-Gln-Ile-Pro-Met-Leu-Ile-Arg-Arg-Lys-Glu-Thr-Lys-Asp-Tyr-Gly-Thr-Lys-Arg-Leu (序列号1)具有人OPRT从N末端开始的第428位 第446位氨基酸序列的 肽(抗原名OPRT-B)Cys-Leu-Gly陽Gln-Gln陽Tyr画Asn陽Ser-Pro-Gln-Glu画Val-Ile-Gly陽Lys-Arg -Gly-Ser-Asp-Ile (序列号2)具有人OPRT从N末端开始的第454位 第474位氨基酸序列的 肽(抗原名OPRT-C)Cys-Ile-Ser-Ala-Ala-Asp-Arg-Leu-Glu隱Ala-Ala-Glu-Met-Tyr-Arg-Lys -Ala-Ala-Trp隱Glu-Ala-Tyr (序歹ij号3 )(2) 抗原结合物的制备使用4mg由上述得到的人工肽和2mg顺丁烯二酰亚胺活化KLH (Pierce)分别针对各肽制成肽-KLH (conjugate)结合物。(3) 免疫将人工肽-KLH作为免疫原，还使用Freund的完全佐剂(FCA) 或者Freund的不完全佐剂(FIA)，按以下对兔子(white日本白色种) 进行免疫。第1次Peptide-KLH 0.5mg+FCA S. C.第2次 第8次Peptide -KLH 0.5mg+ FIA S. C.(4) 抗血清的纯化回收免疫的兔子的全血，在1600Xg、 4。C下离心5分钟，分离血 清。将得到的抗血清20mL用PBS (-)稀释2倍成为40mL，将该抗 血清稀释液添加到抗原肽柱子中，使其结合抗体(IgG)，使用PBS (-)， 一直清洗到280nm的吸光度消失为止。然后，将0.2M的Glycine-HCl pH2.5通过柱子，使吸附于抗原上的抗体被洗脱。另外，此时为了中和 pH，在接收洗脱的抗体的试管中预先添加lMTris，以防止回收的抗体 变质。将得到的抗体组分用PBS (-)在4"C透析一晚，得到纯化抗体。 (5 )通过Western blotting法确认抗OPRT抗体的特异性将来源于人肺癌的细胞LC-ll细胞的组织匀浆(蛋白质浓度为 20mg/mL)与电泳用试样调制液(4%的SDS、 10%的P-巯基乙醇、20% 的甘油、125mMTris、 pH6.8)等量混合，进行2分钟的煮沸处理，取 l(VL用于电泳。试样经10%聚丙烯酰胺电泳以后，在PVDF膜上进行 电转移，浸于Blockace (封闭齐l」，大日本制药公司制造)中进行封闭。 将用20mMPBS (-)调制成1.2pg/mL的各多克隆抗体作为一次抗体， 反应1小时，用含有500mM氯化钠和0.5%Tween20的20mM Tris pH 7.0 (清洗液)清洗膜后，将碱性磷酸酶标记的葡聚糖聚合物结合抗兔多 克隆抗体(Dako Cytomation)作为二次抗体，反应1小时，接着，用 清洗液清洗膜，使用化学发光试剂(CDP-star、 Tropix)进行酶反应， 从而检测出OPRT。其结果如图1所示，可以确认本发明的抗人OPRT 抗体都仅特异性识别OPRT。实施例2 (通过夹心ELISA法对人OPRT进行定量)(1) 使用培养大肠杆菌获得的rhOPRT作为标准。其制法如下 用PCR克隆人OPRT的全长cDNA，制备表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST) 和rhOPRT的融合蛋白的质粒，将该质粒导入大肠杆菌BL21，在 100(ig/mL氨苄青霉素存在下，在100mL的LB培养基(和光纯药工业 公司制造)中37°〇振荡培养一晚。将该培养液10mL移入加有1L的 LB培养基的三角烧瓶中，37。C再培养4小时。离心集菌后，在100mL 的集菌缓冲液(50mMTris、 8M Urea、 lmMPMSF、 5mMEDTA、 5mM DTT、 pH 7.4)中悬浮菌体，在4。C缓慢搅拌30分钟。将悬浊液在4 。C超声破碎后，在15000Xg、 4。C离心30分钟。然后，通过透析处理 将上清中的尿素的浓度慢慢降至1M，进行重折叠(refolding)处理， 通过填充2mL谷胱甘肽(GSH) -Sepharose (Sigma公司制造)的柱子， 用10mL清洗液(20mMTris、 lMUrea， 5mMEDTA、 pH7.4)进行清 洗。在结合有该融合蛋白的谷胱甘肽(GSH) -Sepharose中加入600U 的thrombin,在2.5mM氯化钾存在下在4°C反应一晚，切断GST-OPRT 融合蛋白的结合部位。将thrombin与rhOPRT的混合物通过 Benzamidine-Sepharose柱子，得到目的rhOPRT溶液。按照Bradford 法进行的蛋白质定量的结果为，得到20|ag/mL浓度的rhOPRT 14mL。(2) 抗OPRT抗体组合的比较将抗OPRT-A抗体、抗OPRT-B抗体、抗OPRT-C抗体用0.1 mM 碳酸缓冲液pH 9.6调制成5.0)ig/mL，按O.lmL分注于96孔的ELISA
用板上，密封以后在4'C的孵化器内包覆一晚，得到抗体固定化载体。将96孔板用含有0.05% Tween20的PBS (-)清洗2次，加入O.lmL 含有0.1%BSA的PBS (-)以封闭非特异性吸附。用清洗液清洗2次 以后，添加O.lmL浓度为1.88ng/mL的rhOPRT溶液，室温下反应1 小时。用清洗液清洗5次后，分别加入0.1mL的用稀释液(含有0.1% BSA、 0.05% Tween 20的PBS (-))稀释成0.5昭/mL的抗OPRT-A抗 体、抗OPRT-B抗体、抗OPRT-C抗体的过氧化物酶标记抗体，室温下 反应30分钟。用清洗液清洗7次后，加入O.lmL含有1.3mg/mL的邻 苯二胺、0.01%的过氧化氢水和lmM EDTA的0.1M的磷酸-柠檬酸缓 冲液pH 5.1 (显色液)，在室温暗处进行30分钟的酶反应。最后，加 入0.1M硫酸O.lmL，终止反应，测定492nm的吸光度。结果如图2 所示。使用抗OPRT-B抗体，任意组合均得不到充分的吸光度。而组合 抗OPRT-A抗体和抗OPRT-C抗体时，可以最高灵敏度地测得rhOPRT 的浓度。(3)夹心ELISA法对人OPRT量的定量性用O.lmM碳酸缓冲液pH 9.6将抗OPRT-C抗体调制成5.0昭/mL， 按O.lmL分注于96孔的ELISA用板上，密封后在4。C的孵化器内包覆 一晚，得到抗体固定化载体。将96孔板用含有0.05% Tween20的PBS (-)清洗2次，加入0.1mL含有0.1。/。BSA的PBS (-)，封闭非特异性 吸附。用清洗液清洗2次后，添加O.lmL浓度为0.47、 0.94、 1.88、 3.75、 7.5ng/mL的rhOPRT溶液，室温下反应1小时。用清洗液清洗5次后， 分别加入O.lmL用稀释液稀释成0.5]ig/mL的过氧化物酶标记的抗 OPRT-A抗体，室温下反应30分钟。用清洗液清洗7次后，加入O.lmL 的含有1.3mg/mL的邻苯二胺、0.01%的过氧化氢水和lmM EDTA的 0.1M的磷酸-柠檬酸缓冲液pH 5.1 (显色液)，在室温暗处进行5分钟 的酶反应。最后，加入0.1M硫酸0.1mL，终止反应，测定492nm的吸 光度。结果如图3所示。
使用抗OPRT-C抗体作为固定化抗体，使用抗OPRT-A抗体作为检 测抗体时，可以定量地测定rhOPRT的浓度，由此建立了夹心ELISA 系统。
权利要求
1.一种识别人乳清酸磷酸核糖基转移酶从N末端开始的第86位～第108位的氨基酸区域存在的表位的抗人乳清酸磷酸核糖基转移酶抗体。
2. —种识别人乳清酸磷酸核糖基转移酶从N末端开始的第454 位 第474位的氨基酸区域存在的表位的抗人乳清酸磷酸核糖基转移酶抗体。
3. —种人乳清酸磷酸核糖基转移酶蛋白质测定用试剂盒，其特征在于，含有识别人乳清酸磷酸核糖基转移酶从N末端开始的第86位 第108 位的氨基酸区域存在的表位的抗人乳清酸磷酸核糖基转移酶抗体；和识别人乳清酸磷酸核糖基转移酶从N末端开始的第454位 第474 位的氨基酸区域存在的表位的抗人乳清酸磷酸核糖基转移酶抗体。
4. 如权利要求3所述的测定用试剂盒，其特征在于 测定方法为夹心ELISA法。
5. —种人乳清酸磷酸核糖基转移酶蛋白质的测定方法，其特征在 于将识别人乳清酸磷酸核糖基转移酶从N末端开始的第86位 第 108位的氨基酸区域存在的表位的抗人乳清酸磷酸核糖基转移酶抗体 和识别人乳清酸磷酸核糖基转移酶从N末端开始的第454位 第474 位的氨基酸区域存在的表位的抗人乳清酸磷酸核糖基转移酶抗体进行 组合使用。
6. 如权利要求5所述的测定方法，其特征在于 测定方法为夹心ELISA法。
全文摘要
本发明建立一种人OPRT免疫测定测定方法。本发明提供一种人乳清酸磷酸核糖基转移酶蛋白质的测定方法，将识别人乳清酸磷酸核糖基转移酶从N末端开始的第86位～第108位的氨基酸区域存在的表位的抗人乳清酸磷酸核糖基转移酶抗体和识别人乳清酸磷酸核糖基转移酶从N末端开始的第454位～第474位的氨基酸区域存在的表位的抗人乳清酸磷酸核糖基转移酶抗体进行组合使用。
文档编号G01N33/537GK101133085SQ200680006980
公开日2008年2月27日 申请日期2006年2月28日 优先权日2005年3月3日
发明者坂本一树, 杉本芳一 申请人:大鹏药品工业株式会社