磷酸核糖焦磷酸合成酶1作为除草剂的靶标的制作方法

专利名称：磷酸核糖焦磷酸合成酶1作为除草剂的靶标的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1(E.C.2.7.6.1)作为新的除草活性成分作用靶标的鉴定。本发明也涉及编码具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的多肽的DNA序列SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3或者SEQ-IDNo.5或者其衍生物的一部分在建立鉴定具有除草作用活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂的检测系统中的用途。本发明也涉及鉴定可抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的物质的方法或者检测系统，以及使用此类方法或者这一检测系统鉴定出的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的抑制剂。
植物能够利用二氧化碳、水和无机盐合成它们的细胞成分。
此过程只有通过利用合成有机物质的生物化学反应才可能进行。植物体内核苷酸是从头合成的。作为核酸的成分，它们具有特别的重要性。通过与之共价结合，核苷酸活化碳水化合物进行多糖的生物合成。它们还活化用于脂类生物合成的头部基团。核苷酸实际上参与了所有的代谢过程。三磷酸核苷，特别是ATP，驱动细胞中大部分能量依赖的反应。还发现腺嘌呤核苷是一些基本因子，如参与了大量细胞内反应的辅酶A、烟酰胺和黄素辅酶的一种组成成分。5’-三磷酸鸟苷(GTP)的偶联水解决定了多种细胞内过程，如蛋白质翻译、微管组装、小泡转运、信号转导和细胞分裂所需反应的方向。而且，核苷酸也构成了甲基黄嘌呤类，如茜草科(Rubiaceae)和山茶科(Theaceae)植物中咖啡因和可可碱生物合成的起始代谢物。
由于植物依赖于有效的核苷酸代谢，可以设想参与核苷酸生物合成的酶可作为除草剂的合适靶标蛋白质。因此，现已有关于抑制植物从头嘌呤生物合成的活性成分的描述。可以提到的一个例子是天然物质hydanthocidin，其在植物体内磷酸化后可抑制腺苷酸琥珀酸合成酶(ASS)。(Siehl等人，植物生理学(Plant Physiol.)110(1996)，753-758)。
磷酸核糖焦磷酸(PRPP)是植物新陈代谢中一个必需成分。其为嘌呤和嘧啶核苷酸，吡啶核苷酸辅酶NAD的从头合成，以及已经合成的嘌呤、嘧啶和吡啶的再利用所必需。此外，PRPP也为组氨酸和色氨酸的合成所必需(参见Krath和Hove-Jensen，植物生理学119(1999)，497-505)。负责PRPP合成的酶是PRPP合成酶，其使核糖-5-磷酸和MgATP转换成AMP和PRPP。一些生物体的磷酸核糖焦磷酸合成酶还需要Mg2+。真核生物经常具有超过一种的磷酸核糖焦磷酸合成酶。因而，例如，人类就具有功能冗余的三种形式同工酶。植物磷酸核糖焦磷酸合成酶，例如，在菠菜中就存在四种同工型，可被分为两类，它们在位置和功能上是不同的，或者受植物细胞不同发育依赖调节机制的支配。例如，磷酸核糖焦磷酸合成酶2被运送至叶绿体中(Krath和Hove-Jensen，植物生理学119(1999)，497-505)。这也同在鼠耳芥属(Arabidopsis)叶绿体中检测到与嘌呤从头生物合成有关的几种酶的结果相吻合(Senecoff和Meager，植物生理学102(1993)，387-399；Ito等人，植物分子生物学(Plant Mol Biol.)26(1994)，529-533；Schnorr等人，植物杂志(Plant Journal)6(1994)，113-121)。在酵母中，已经证明4种磷酸核糖焦磷酸合成酶同工型具有不同的功能(Cater等人，酵母(Yeast)10(1994)，1031-1044)。与人、其它高等真核生物和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的磷酸核糖焦磷酸合成酶相反，对植物磷酸核糖焦磷酸合成酶仅有极少数的研究。在美国专利(US Patents)5,780,253和5,780,254中已经描述了鉴定植物嘌呤代谢抑制剂的一般方法。
从多种生物体中都已经分离出了编码磷酸核糖焦磷酸合成酶1的基因。至于植物，已经从拟南芥(Arabidopsis thaliana)(登录号X83764)和烟草中(Badur博士，Gttingen大学，1998)分离到了其全长DNA序列。
一种酶作为除草剂的靶标是否合适可以通过降低酶活性，例如在转基因植物中利用反义技术降低酶活性来确定。如果将某种基因的反义DNA导入植物中导致植物生长减慢，就提示活性降低的酶是适合作为除草剂活性成分作用位点的。例如，在转基因马铃薯中反义抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)，如同使用ALS抑制性除草剂处理对照植物一样，导致了类似的表现型(Hfgen等人，植物生理学107(1995)，469-477)。
本发明的一个目的是提供在植物中磷酸核糖焦磷酸合成酶1是合适的除草剂作用靶标的证据，以及产生一种有效、简便的磷酸核糖焦磷酸合成酶1检测系统以进行抑制剂-酶结合研究。
我们发现，通过分离编码植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的基因，构建植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的反义构建体和使其在植物中表达，以及在细菌或真核细胞中功能性表达植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1，可以达到此目的。
为达到此目的，烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥编码植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的cDNA以及展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)的部分cDNA得到分离和测序，参见实施例1和实施例6，序列表SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5。
携带有义和反义磷酸核糖焦磷酸合成酶1构建体的拟南芥和枯斑三生烟(Nicotiana tabacum cv.Samsun NN)烟草植株的性质得到非常仔细的分析。这些反义植物显示了不同程度的生长延迟。转基因植株以及第一、第二代后代植株在土壤中生长减慢。Northern杂交显示，生长减慢的植株与野生型植株相比磷酸核糖焦磷酸合成酶1的RNA数量降低了，参见实施例5和图3。此外，通过酶活性测定发现转基因反义株系与野生型植株相比磷酸核糖焦磷酸合成酶1的活性值也降低了。磷酸核糖焦磷酸合成酶1表达水平和活性的降低与生长延迟相关。尽管在植物中极可能存在数种磷酸核糖焦磷酸合成酶的同工型，但是令人吃惊的是，发现导入一种磷酸核糖焦磷酸合成酶反义构建体就可观察到生长减慢。这种清楚的关系第一次明确地证明磷酸核糖焦磷酸合成酶1可以作为除草剂活性成分的合适靶标蛋白质。
本发明的另一主题涉及通过高通量筛选来鉴定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂的方法。因此，本发明涉及植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1，特别是烟草和拟南芥磷酸核糖焦磷酸合成酶1在适当的表达系统中的功能性表达，以及由此制备的酶在测定磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的体外检测系统中的用途。
为了能够发现有效的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂，必须提供可以研究抑制剂-酶结合的合适检测系统。例如，为此将磷酸核糖焦磷酸合成酶1 cDNA序列或者烟草或拟南芥磷酸核糖焦磷酸合成酶1 cDNA序列的合适片段克隆入表达载体(pQE，Qiagen)并在大肠杆菌(E.coli.)中超量表达。
但是，作为选择，也可以在其它种类的细菌中、在酵母、真菌、藻类、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达含有SEQ-ID No.1或者SEQ-ID No.3的DNA序列或者DNA亚序列，或者这些序列的衍生序列的表达盒。
本发明的另一主题涉及源自SEQ-ID No.1或SEQ-ID No.3、或者与这些序列之一杂交并编码具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1生物活性的蛋白质的DNA序列的用途。
在表达盒的帮助下表达的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1蛋白特别适合用于鉴定磷酸核糖焦磷酸合成酶1的特异性抑制剂。
至此，例如，将可以在待测活性成分存在或不存在的情况下测定磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的酶分析方法中利用植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1。通过比较两种情况下的活性测定结果，可对待测活性成分的抑制性作用进行定性和定量的评价，参见实施例7。
根据本发明的检测系统允许对大量的化合物进行快速、简便的检测以确定其除草特性。使用此方法，具有有效作用的物质可被特异性地和可重复地从大量的物质中筛选出来，以利于接下来对这些物质进行研究人员所熟悉的深入检测。
本发明的另一个主题涉及通过克隆植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因并在合适的表达盒中超量表达—例如在昆虫细胞中表达，裂解细胞并将细胞提取物直接，或浓缩，或分离磷酸核糖焦磷酸合成酶1后，应用于检测系统以便在低分子量化合物存在的情况下测定酶活性以鉴定具有潜在除草剂作用的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂的方法。
本发明的另一个主题涉及用以鉴定可抑制植物中磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的具有除草作用的活性物质的方法，该方法包括a)产生含有编码具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的酶以及能够超量表达具有酶活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1的额外DNA序列的转基因植物、植物组织或植物细胞；b)对转基因植物、植物细胞、植物组织或者植物器官和未转化的植物、植物细胞、植物组织或者植物器官使用一种物质；c)在使用该化学物质之后，确定转基因和未转化植物、植物细胞、植物组织或者植物器官的生长或者存活能力；以及d)比较在使用该化学物质之后，转基因和未转化植物、植物细胞、植物组织或者植物器官的生长或者存活能力；当b)中使用的物质可抑制未转化植物、植物细胞、植物组织或者植物器官的生长或者存活能力，但是基本上不抑制转基因植物、植物细胞、植物组织或者植物器官的生长或者存活能力时，可以确认该物质具有除草剂活性并可抑制植物中的磷酸核糖焦磷酸合成酶1的酶活性。
本发明的另一个主题是可用以上描述的检测系统鉴定的具有除草剂活性的化合物。
具有除草剂活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂可作为落叶剂、干燥剂、除茎杆剂，特别是除杂草剂使用。杂草在最广义上讲应理解为是指生长在不希望它们出现的地点的所有植物。在根据本发明的检测系统帮助下鉴定出的活性成分是以广谱除草剂还是选择性除草剂的形式起作用将尤其取决于使用的量。
例如，具有除草剂活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂可用来清除下述杂草下列种属的双子叶杂草
白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤属(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛膝菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、蕃薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、刺酸膜属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、蓳菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛茛属(Ranunculus)、蒲公英属(Taraxacum)。
下列种属的单子叶杂草稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、蟋蟀草属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高梁属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、蔍草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)、阿披拉草属(Apera)。
本发明的主题也涉及编码拟南芥或烟草磷酸核糖焦磷酸合成酶1或其功能等价物的表达盒序列在建立鉴定具有除草剂活性的化合物的检测系统中的用途。例如，该核苷酸序列可以是DNA或cDNA序列。
这样的表达盒还包含控制编码序列在宿主细胞中表达的调节核苷酸序列。按照优选的实施方案，根据本发明的表达盒包括上游(例如在编码序列的5′末端)启动子，和下游(例如在编码序列的3′末端)聚腺苷酸化信号以及，如果适当的话，操作性地连接磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因编码序列的其它调节元件，所述编码序列位于启动子和聚腺苷酸化信号之间。操作性连接应理解为是指启动子、编码序列、终止子以及，如果适当的话，其它调节元件均以一定的形式有序排列，以致每一调节元件都可象编码序列得到表达时期望的那样起作用。
根据本发明的这样表达盒通过利用常规的，例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册(Molecular CloningALaboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验操作(Experiments with genefusions)，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1984)和Ausubel，F.M.等人，最新分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)所描述的重组和克隆技术将适当的启动子同合适的磷酸核糖焦磷酸合成酶1 DNA序列和聚腺苷酸化信号相融合而得到。
本发明的主题也涉及编码磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的，以及依据DNA序列的总长度与SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5具有40～100％同源性的功能上等价DNA序列的用途。
本发明的优选主题涉及编码磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的，以及依据DNA序列的总长度与SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5具有60～100％同源性的功能上等价DNA序列的用途。
本发明的特别优选主题涉及编码磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的，以及依据DNA序列的总长度与SEQ-ID No.1，SEQ-ID No.3和SEQ-ID No.5具有80～100％同源性的功能上等价DNA序列的用途。
按照本发明，编码磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的功能上等价序列是保持有期望功能的(不论是否是衍生核苷酸序列)那些序列。因而，功能等价物包括此处所描述的序列的天然变体，也包括人工的核苷酸序列，例如通过化学合成并经改造过以适应植物密码子使用的人工核苷酸序列。
功能等价物也应理解为尤其是指编码磷酸核糖焦磷酸合成酶1并一直表现出期望功能的原始分离序列的天然或人工突变体。突变包括一个或多个核苷酸残基的替代、添加、缺失、交换或者插入。因此，例如本发明也扩展至通过修饰核苷酸序列而得到的那些核苷酸序列。例如，此类修饰的目的可以是进一步界定包含在其中的编码序列或引入其它的限制性酶切位点。
功能等价物也指那些与起始基因或起始片段相比较功能降低或增加了的变体。
此外，根据本发明的表达盒也可用于转化细菌、蓝细菌、酵母、丝状真菌和藻类以产生足够数量的磷酸核糖焦磷酸合成酶1。
本发明的另一个主题涉及烟草或拟南芥蛋白质，所述蛋白质的特征在于具有SEQ-ID No.2和SEQ-ID No.4的氨基酸序列，或者该蛋白质的具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的衍生物或部分，在建立鉴定具有除草剂活性的化合物的检测系统中的用途。
本发明的主题也涉及具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的植物蛋白质的用途，所述蛋白质在氨基酸序列上与具有SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4或SEQ-ID No.6序列的烟草、拟南芥或展叶剑叶藓磷酸核糖焦磷酸合成酶1有20～100％一致性，所述用途是指用以建立鉴定具除草剂活性的化合物的检测系统。
优选地，还涉及具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的植物蛋白质的用途，所述蛋白质在氨基酸序列上与具有SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4或SEQ-ID No.6序列的烟草、拟南芥或展叶剑叶藓磷酸核糖焦磷酸合成酶1有50～100％一致性，所述用途是指用以建立鉴定具除草剂活性的化合物的检测系统。
特别优选的是具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的植物蛋白质的用途，所述蛋白质在氨基酸序列上与具有SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4和SEQ-ID No.6序列的烟草、拟南芥或展叶剑叶藓磷酸核糖焦磷酸合成酶1有80～100％一致性，所述用途是指用以建立鉴定具除草剂活性的化合物的检测系统。
在植物中，编码磷酸核糖焦磷酸合成酶1的SEQ-ID No.1或SEQ-IDNo.3基因序列的超量表达导致植物对磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂的抗性增高。由此产生的转基因植物也是本发明的主题。
重组表达的磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的表达效率可通过，例如体外茎分生组织繁殖或萌芽测试来确定。此外，类型和水平已改变的磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的表达和其对磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂抗性的作用情况，可利用测试植物通过温室实验来检测。
本发明的主题还有用根据本发明的含有SEQ-ID No.1或SEQ-ID No.3 DNA序列的表达盒转化的、通过额外表达SEQ-ID No.1或SEQ-ID No.3的DNA序列而对磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂产生耐受性的转基因植物，以及此类植物的转基因细胞、组织、器官和繁殖材料。特别优选的是转基因农作物，例如大麦、小麦、黑麦、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、canola、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、油菜籽、紫花苜蓿、莴苣，以及多种树木、坚果和葡萄及豆类植物。
特别优选确保靶向质外体、原生质体、液泡、线粒体和内质网的序列，或由于缺少合适的操作性序列而确保表达产物保留在其形成的区室即细胞质中(Kermode，植物科学重要综述(Crit.Rev.Plant Sci).15，4(1996)，285-423)的序列。
例如，植物表达盒可以整合入植物转化载体pBinAR之中。
原则上，表达盒的合适启动子可以是能够控制外源基因在植物中表达的任何启动子。优选使用尤其是植物启动子或来源自植物病毒的启动子。尤其优选的是使用花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子(Frank等人，细胞(Cell)21(1980)，285-294)。该启动子包含有不同的转录效应因子识别序列，它们作为整体导致所导入基因的永久和组成型表达(Benfey等人，欧洲分子生物学杂志(EMBOJ.)，8(1989)，2195-2202)。
表达盒也可包含使外源磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因在植物中可以受控在特定时间点表达的化学诱导型启动子。在文献中描述过的和可以使用的这样的启动子有，尤其是PRP1启动子(Ward等人，植物分子生物学，22(1993)，361-366)、水杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、苯磺胺诱导型启动子(EP 388186)、四环素诱导型启动子(Gatz等人，植物杂志(PlantJ.)，2(1992)，397-404)、脱落酸诱导型启动子(EP 0335528)，或者乙醇或环己酮诱导型启动子(WO93/21334)。
特别优选的启动子还有那些确保表达发生在嘌呤或其前体进行生物合成的植物组织或器官中的启动子。特别要提到的是那些确保叶特异性表达的启动子。必须提到的启动子是马铃薯胞质FBPase或马铃薯ST-LSI的启动子(Stockhaus等人，欧洲分子生物学杂志，8(1989)，2445-245)。
在种子特异性启动子的作用下，外源蛋白质可在转基因烟草种子中稳定表达，直至占到种子全部可溶性蛋白质的0.67％(Fiedler和Conrad，生物工程技术(Bio/Technology)，10(1995)，1090-1094)。因此，根据本发明的表达盒可包含，例如，种子特异性启动子(优选地，phasolin启动子，USP启动子或LEB4启动子)，LEB4信号肽，待表达的基因和ER驻留信号(retention signal)。
编码磷酸核糖焦磷酸合成酶1的插入核苷酸序列可以通过合成产生，或者取自天然序列，或者是包含合成的或天然的DNA成分的混合序列。一般来讲，使用植物优选的密码子来制备合成的核苷酸序列。植物优选使用的密码子可通过研究在最感兴趣的植物品种中具有最高表达频率的蛋白质所使用的密码子来确定。当制备表达盒时，可能需要操作多种DNA片段以获得可在正确方向上顺利阅读和按正确读码框架拼接的核苷酸序列。为了将这些DNA片段彼此互相连接起来，可向片段增加衔接子或接头。
其他合适的DNA序列是人工DNA序列，只要它们能造成期望的表达磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因的性质即可。此类人工DNA序列可通过，例如，从具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白质反翻译来确定，或者它们可通过体外筛选而得出。特别合适的是按照宿主植物特异性密码子使用反翻译多肽序列所获得的编码DNA序列。特异性密码子使用可容易地由熟悉植物遗传学方法的技术人员利用计算机评价待转化植物的其它已知基因而确定。
必须提到的根据本发明的其它合适的等价核苷酸序列是编码融合蛋白质的序列，该融合蛋白质的组成成分是植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1多肽或者其功能上等价的部分。融合蛋白质的第二部分可以是，例如，具有酶活性的其它多肽、或者抗原性多肽的序列，在其帮助下可以检测磷酸核糖焦磷酸合成酶1的表达情况(例如myc标签或者His标签)。但是，优选的是调节蛋白质序列，例如是可将磷酸核糖焦磷酸合成酶1蛋白质引导到期望的作用位点的信号或转运肽。
有利地启动子和终止子区域应当在转录的方向上装备有包含1个或多个限制性位点的接头或多接头以便插入该序列。通常，接头有1至10，大部分是1至8，优选地是2至6个限制性位点。一般来讲，位于调节区域中间的接头大小小于100bp，常常小于60bp，但至少有5bp。根据本发明的启动子可以是宿主植物自身的，或者同源的，或者外来的，或者异种的启动子。根据本发明，表达盒按5’-3’转录方向包含依照本发明的启动子，任何序列和转录终止区。多种终止区可根据需要互相调换。
还可以进行提供适当限制性裂解位点或去除多余DNA或限制性裂解位点的操作。当适合出现插入、缺失或替代，例如转换或颠换时，可以使用体外诱变、引物修复、限制性酶切或连接技术。在适当操作，例如限制性酶切、削平或补平粘性末端以产生平端的情况下可产生片段的互补末端以供连接。
优选的聚腺苷酸化信号是植物聚腺苷酸化信号，优选的是与根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA聚腺苷酸化信号基本上符合的，特别是与Ti质粒pTiACH5的T-DNA的基因3(章鱼碱合成酶)(Gielen等人，欧洲分子生物学杂志，3(1984)，835)聚腺苷酸化信号基本上符合的那些，或者其功能等价物。
为了利用编码磷酸核糖焦磷酸合成酶1的DNA转化宿主植物，将根据本发明的表达盒作为插入片段整合到重组载体中，所述载体DNA上包含其它功能调节信号，例如复制和整合所需的序列。适当的载体在，尤其是“植物分子生物学和生物工程技术方法(Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology)”(CRC出版社，第6/7章，71-119)一书中得到描述。
转移外来基因到植物的基因组中术语称为转化。其利用以上描述的转化和从植物的组织或植物细胞再生植物的方法进行瞬时或稳定转化。适当的方法是利用聚乙二醇诱导的DNA摄入所进行的原生质体转化，利用基因枪进行的生物轰击方法、电穿孔、在含有DNA的溶液里浸泡干胚芽、微注射和农杆菌介导的基因转移。上述提到的方法在，例如，B.Jenes等人，基因转移技术，见转基因植物(Transgenic Plants)，第一卷，工程化和应用，S.D.Kung和R.Wu主编，Academic Press(1993)，128-143，和Potrykus，植物生理学和植物分子生物学综述年鉴(Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mole.Biol.)，42(1991)，205-225，中得到描述。优选地，将要表达的构建体克隆入适合转化根瘤农杆菌的载体，例如pBin19中(Bevan等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，12(1984)，8711)。
同样地，以根据本发明的表达盒转化的农杆菌可按已知方式用于转化植物，尤其是农作物例如谷类作物、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、canola、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、油菜籽、紫花苜蓿、莴苣，以及多种树木、坚果和葡萄及豆类植物，方式有例如通过将采下的叶片或叶的切片浸泡在农杆菌悬液中并接下来在合适的培养基中培养。
嘌呤的生物合成位点通常是叶组织，因此磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因在叶中特异性表达是有意义的。然而，很明显嘌呤生物合成不一定限制在叶组织，也可在植物所有其余部分中以组织特异性的方式发生，例如在富含脂肪的种子中。
此外，组成型表达外源性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因是有益的。另一方面，也可能希望进行诱导型表达。
使用以上引用的重组和克隆技术，可以将根据本发明的表达盒克隆入适当的载体中，所述载体能够使它们例如在大肠杆菌中扩增。适当的表达载体为，尤其是pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。特别适合的载体为二元载体，其能够在大肠杆菌和农杆菌两者中复制。
本发明的另一主题涉及依据本发明的表达盒在转化植物、植物细胞、植物组织或植物器官中的用途。该用途的优选目的是增加植物中磷酸核糖焦磷酸合成酶1的含量。
根据所选择的启动子，表达可特异性地发生在叶，种子或植物的其它部分。这样的转基因植物和它们的繁殖材料和它们的植物细胞、植物组织或植物器官是本发明的另一主题。
现在将通过下面的实施例来举例说明本发明，实施例并不能限制本发明。
实施例所依据的重组方法普通克隆方法克隆方法，例如限制性酶切、DNA分离、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段纯化、转移核酸至硝酸纤维素或尼龙膜、DNA片段连接、转化大肠杆菌细胞、细菌培养和重组DNA的序列分析按照Sambrook等人，冷泉港实验室出版社(1989)；ISBN 0-87969-309-6所描述的方法进行操作。转化根瘤农杆菌参照Hfgen和Willmtzer(核酸研究，16(1988)，9877)的方法进行操作。农杆菌使用YEB培养基培养(Vervliet等人，普通病毒学(Gen.Virol.)，26(1975)，33)。
重组DNA的序列分析重组DNA分子使用ABI激光荧光测序仪，按照Sanger法(Sanger等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，74(1977)，5463-5467)进行测序。对多聚酶链式反应的片段进行了序列测定和检查以避免在将要表达的构建体中有聚合酶引入的错误。
植物组织中总RNA的分析植物总RNA依照Logemann等人的方法，分析生物化学(AnalyticalBiochem.)，163(1987)，16)分离并利用含有甲醛的琼脂糖凝胶分开(Lehrach等人，生物化学(Biochem.)16(1977)，4743)。在20×SSC(1.5M氯化钠，150mM柠檬酸钠)中毛细作用过夜转移至尼龙膜(GeneScreen，NEN)。在杂交缓冲液(500mM磷酸钠(pH7.2)，7％SDS，0.5％牛血清白蛋白，1mM EDTA)中预杂交2小时后，使用放射性标记的NtPrs1探针在65℃杂交16小时。然后，在下列条件下洗涤65℃下6×SSC，0.1％SDS中10分钟，65℃下4×SSC，0.1％SDS中5分钟。
除非有其它说明，使用的都是购自Fluka(Neu-Ulm)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)和Sigma(Deisenhofen)公司的分析纯级化学试剂。溶液使用由Milli-Q水纯化系统(Millipore，Eschborn)制备的纯化无致热原的水，以下称为H2O，配制。限制性内切酶、DNA修饰酶和分子生物学试剂盒购自AGS(Heidelberg)、Amersham(Braunschweig)、Biometra(Gttingen)、Roche(Mannheim)、Genomed(Bad Oeynnhausen)、New England Biolabs(Schwalbach/Taunus)、Novagen(Madison，Wisconsin，USA)、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Pharmacia(Freiburg)、Qiagen(Hilden)和Stratagene(Freiburg)。除非有其它说明，试剂均按生产厂商的说明书使用。
大肠杆菌菌株(XL-1 Blue)购自Stratagene。转化植物使用的农杆菌菌株(含有质粒pGV3850kan的C58C1)参见Debleare等人，核酸研究，13(1985)，4777)所描述。
利用此克隆筛选克隆入λZAPII的枯斑三生烟的叶cDNA文库。该cDNA文库以2.5×105噬斑形成单位的滴度铺平板并利用噬斑筛选方法进行分析(T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY 1989)。分离到12个噬菌体群并用于进行第二轮筛选，结果分离得到遗传学上一致的噬菌体群用于体内切除。内切酶分析在不同的cDNA克隆间未见任何差别，挑选具有最大插入片段的4个克隆进行序列测定。序列资料显示它们是编码5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶的cDNA克隆。
cDNA克隆NtPrs1-参见SEQ-ID No.1-全长1251bp，在第21位有起始密码子，第1089位有终止密码子TAG。开放阅读框架编码包含356个氨基酸且分子量38.3kD的蛋白质。152bp的3’非翻译区没有聚腺苷酸化信号。在分析从cDNA克隆NtPrs1推导出的蛋白质序列-参见SEQ-IDNo.2-时，计算机分析在最初的36个氨基酸内鉴定出了叶绿体转运肽。
如

图1所示，cDNA文库的构建包括提供具EcoR I/Not I接头的各片段，然后将它们克隆入pBluescript多接头的EcoR I限制性位点。因此，Not I切割位点不是pBluescript的原始成分。
A 质粒pBluescript SK的多克隆位点B NtPrs1 cDNA 1251bpC 质粒pBluescript SK的多克隆位点图2显示了在烟草中以反义方向表达NtPrs1 cDNA(1226bp)的表达盒。
A花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，529bp，CaMV的6909至7437位核苷酸。
B自质粒pBluescript SK-NtPrs1作为BamH I片段分离的反义方向的NtPrs1 cDNA(1226bp)，包括NtPrs1编码区1-1208位的碱基。
CTi质粒pTiACH5的T-DNA基因3(章鱼碱合成酶，OCS)的聚腺苷酸化信号(192bp)。
此资料建立了降低的磷酸核糖焦磷酸合成酶1表达和烟草降低的生长之间的直接关系，因此证明磷酸核糖焦磷酸合成酶1可作为具除草作用的活性成分的合适靶标蛋白质。
接下来杂交信号通过磷光影像分析仪(phospho-imager)进行定量。与植物的表现型一致，在45-1株中NtPrs1合成酶mRNA的转录本积累显著地降低了。植株33.4、14.5和30.4仅仅显示mRNA转录本积累降低了，以及类似地，较不太明显的生长表型。
为了产生cDNA文库，从自生长9天的原丝体所提取的PolyA+ RNA起始，使用鼠白血病病毒反转录酶(Roche，Mannheim，德国)和Oligo-d(T)引物，进行第一链的合成。通过与DNA聚合酶I，Klenow酶，RNaseH在12℃(2小时)，16℃(1小时)，22℃(1小时)孵备进行第二链的合成。65℃作用(10分钟)后终止反应并移至冰上。利用T4 DNA聚合酶(Roche，Mannheim)在37℃(30分钟)作用补平双链DNA，核苷酸通过酚/氯仿抽提去除然后经Sephadex G50层析。EcoR I衔接子(Pharmacia，Freiburg，德国)通过T4 DNA连接酶(Roche，12℃，16小时)连接到cDNA末端，进而利用多核苷酸激酶(Roche，37℃，30分钟)进行磷酸化。DNA片段通过凝胶电泳得到分离，大于300碱基对的片段利用酚抽提进行分离并经Elutip-D柱(Schleicher和Schuell，Dassel，德国)得到浓缩。使用Gigapack Gold试剂盒(Stratagene，Amsterdam，荷兰)按照厂家说明书操作将所得的双链DNA连接入λZAPII。体内切除产生用于转化大肠杆菌菌株XL-1 Blue的质粒DNA。来自单菌落的克隆利用液体培养基进行培养，提取质粒DNA用于测序反应。通过同源性比较，鉴定出编码5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶的EST片段，见SEQ-ID No.5。
在细胞于裂解缓冲液(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，pH7.8)中超声裂解后，使用18μg总蛋白质。按照生产厂商的说明(Qiagen)，利用由载体引入的His标签可经亲和色谱法进行进一步的纯化。可利用PD-10柱(Pharmacia)和标准的浓缩方法，例如硫酸铵沉淀法更换蛋白质的缓冲液。所测量的是NADH在340nm处光吸收值的降低。结果表明，蛹虫草菌素5′-三磷酸(其它高等真核生物的5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶抑制剂)也可以抑制植物5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶1的酶活性。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>磷酸核糖焦磷酸合成酶1作为除草剂的靶标<130>BASF-OZ-0050/51207 PCT<140><141><160>6<170>PatentIn Vers. 2.0<210>1<211>1251<212>DNA<213>烟草<220><221>CDS<222>(22)..(1089)<400>1gcatccctct ctcttctcca c atg gca tct tta gct cta cct gga agc ttt51Met Ala Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ser Phe1 5 10tta gct acc agc aaa cct agt cct tgt aga tat gct gcc gga gac tca99Leu Ala Thr Ser Lys Pro Ser Pro Cys Arg Tyr Ala Ala Gly Asp Ser
15 20 25att gta aga tgt aat gtg gca gaa cca tta agt ttt aac aag gag aat147Ile Val Arg cys Asn Val Ala Glu Pro Leu Ser Phe Asn Lys Glu Asn30 35 40ggg aga tca aac atg cct ctt cag att aat ggc gac act tca ttt aac195Gly Arg Ser Asn Met Pro Leu Gln Ile Asn Gly Asp Thr Ser Phe Asn45 50 55aat ctt tgg aac gct aat caa gta aga aga ttt cca gtt cca cat gct243Asn Leu Trp Asn Ala Asn Gln Val Arg Arg Phe Pro Val Pro His Ala60 65 70cag att gat act aga ctc cgc att ttc tcc ggc act gcc aat cct gca291Gln Ile Asp Thr Arg Leu Arg Ile Phe Ser Gly Thr Ala Asn Pro Ala75 80 85 90ctt tct cag gaa ata gct tgc tac atg ggt ttg gaa ctt gga aag ata339Leu Ser G1n Glu Ile Ala Cys Tyr Met Gly Leu Glu Leu Gly Lys Ile95 100 105atg ata aaa cgt ttt gct gat ggc gaa atc tat gtc cag tta caa gag387Met Ile Lys Arg Phe Ala Asp Gly Glu Ile Tyr Val Gln Leu Gln Glu110 115 120agt gtt agg ggt tgt gat gta tat ctt gtc caa cct acg tgt ctc ctg435Ser Val Arg Gly Cys Asp Val Tyr Leu Val Gln Pro Thr Cys Leu Leu125 130 135cta atg aaa tct gat gga ctc ttg ata atg att gat gct tgc cgt aga483Leu Met Lys Ser Asp Gly Leu Leu Ile Met Ile Asp Ala Cys Arg Arg140 145 150gcc tca gcc aaa aat att act gca gtg att ccg tac ttt ggg tat gcc531Ala Ser Ala Lys Asn Ile Thr Ala Val Ile Pro Tyr Phe Gly Tyr Ala155 160 165 170cgt gct gat cgt aag act caa ggt cgt gaa tcg att gct gcc aaa ctt579Arg Ala Asp Arg Lys Thr Gln Gly Arg Glu Ser Ile Ala Ala Lys Leu175 180 185gta gca aac ctg att aca gaa gct ggt gca gat cga gtt ctt gct tgt627Val Ala Asn Leu Ile Thr Glu Ala Gly Ala Asp Arg Val Leu Ala Cys190 195 200gat ctt cat tct ggc cag tca atg ggt tac ttt gat att cca gtg gat675Asp Leu His Ser Gly Gln Ser Met Gly Tyr Phe Asp Ile Pro Val Asp205 210 215cat gta cat ggc cag cct gtc ata ctt gat tac ctt gcc agc aag act723His Val His Gly Gln Pro Val Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Ser Lys Thr220 225 230atc tgc tct gat gat cta gtt gtg gta tct ccg gat gtt ggt ggg gtt771Ile Cys Ser Asp Asp Leu Val Val Val Ser Pro Asp Val Gly Gly Val235 240 245 250gca agg gca aga gct ttt gcc aaa aag tta tct gat gca cct cta gct819Ala Arg Ala Arg Ala Phe Ala Lys Lys Leu Ser Asp Ala Pro Leu Ala255 260 265att gtg gat aaa agg cgt cat ggg cac aat gtt gct gag gta atg aat867Ile Val Asp Lys Arg Arg His Gly His Asn Val Ala Glu Val Met Asn270 275 280ttg att ggc gat gtt agg gga aaa gtg gca gtt atg gtt gat gac atg915Leu Ile Gly Asp Val Arg Gly Lys Val Ala Val Met Val Asp Asp Met285 290 295att gat acg gct ggt act att gca aaa gga gct gcc ctt tta cat caa963Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Ala Lys Gly Ala Ala Leu Leu His Gln300 305 310gga gcc agg gaa gtt tat gca tgc acc act cat gca gtt ttc agg gcg1011Gly Ala Arg Glu Val Tyr Ala Cys Thr Thr His Ala Val Phe Arg Ala315 320 325 330gct ttg agc ctt act ccg gat tgg gaa ttg att agt cct tcc tgt tca1059Ala Leu Ser Leu Thr Pro Asp Trp Glu Leu Ile Ser Pro Ser Cys Ser335 340 345ttg ctt gtt ttg aca ctg ttg tct gga act tgaagcagta tgttgatcag 1109Leu Leu Val Leu Thr Leu Leu Ser Gly Thr350 355atccaccaaa attttcgtcc agtaacaaag agagcatttt ctgttgtaca aatattttgt 1169gcggaatgtt acgttgtaaa tctttcaatc agtgacttgg atccatgtag tagatgagtt 1229ttttgattaa tatgaagttt ac 1251<210>2<211>356<212>PRT<213>烟草<400>2Met Ala Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ser Phe Leu Ala Thr Ser Lys Pro1 5 10 15Ser Pro Cys Arg Tyr Ala Ala Gly Asp Ser Ile Val Arg Cys Asn Val20 25 30Ala Glu Pro Leu Ser Phe Asn Lys Glu Asn Gly Arg Ser Asn Met Pro35 40 45Leu Gln Ile Asn Gly Asp Thr Ser Phe Asn Asn Leu Trp Asn Ala Asn50 55 60Gln Val Arg Arg Phe Pro Val Pro His Ala Gln Ile Asp Thr Arg Leu65 70 75 80Arg Ile Phe Ser Gly Thr Ala Asn Pro Ala Leu Ser Gln Glu Ile Ala85 90 95Cys Tyr Met Gly Leu Glu Leu Gly Lys Ile Met Ile Lys Arg Phe Ala100 105 110Asp Gly Glu Ile Tyr Val Gln Leu Gln Glu Ser Val Arg Gly Cys Asp115 120 125Val Tyr Leu Val Gln Pro Thr Cys Leu Leu Leu Met Lys Ser Asp Gly
130 135 140Leu Leu Ile Met Ile Asp Ala Cys Arg Arg Ala Ser Ala Lys Asn Ile145 150 155 160Thr Ala Val Ile Pro Tyr Phe Gly Tyr Ala Arg Ala Asp Arg Lys Thr165 170 175Gln Gly Arg Glu Ser Ile Ala Ala Lys Leu Val Ala Asn Leu Ile Thr180 185 190Glu Ala Gly Ala Asp Arg Val Leu Ala Cys Asp Leu His Ser Gly Gln195 200 205Ser Met Gly Tyr Phe Asp Ile Pro Val Asp His Val His Gly Gln Pro210 215 220Val Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Ser Lys Thr Ile Cys Ser Asp Asp Leu225 230 235 240Val Val Val Ser Pro Asp Val Gly Gly Val Ala Arg Ala Arg Ala Phe245 250 255Ala Lys Lys Leu Ser Asp Ala Pro Leu Ala Ile Val Asp Lys Arg Arg260 265 270His Gly His Asn Val Ala Glu Val Met Asn Leu Ile Gly Asp Val Arg275 280 285Gly Lys Val Ala Val Met Val Asp Asp Met Ile Asp Thr Ala Gly Thr290 295 300Ile Ala Lys Gly Ala Ala Leu Leu His Gln Gly Ala Arg Glu Val Tyr305 310 315 320Ala Cys Thr Thr His Ala Val Phe Arg Ala Ala Leu Ser Leu Thr Pro325 330 335Asp Trp Glu Leu Ile Ser Pro Ser Cys Ser Leu Leu Val Leu Thr Leu340 345 350Leu Ser Gly 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1.具有植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1编码区的DNA序列SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3或SEQ-ID No.5在制备鉴定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂的检测系统中的用途。
2.权利要求1的DNA序列的用途，所述DNA序列可与SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3或SEQ-ID No.5DNA序列或者其部分序列、或者通过对所述的序列进行插入、缺失或替代产生的并编码具有植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1生物活性的蛋白质的衍生物杂交。
3.权利要求1或2的DNA序列在导入原核或真核细胞中的用途，此序列任选地同控制元件相连接，该控制元件可确保在细胞中的转录和翻译并导致造成植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1合成的可翻译mRNA表达。
4.具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白质在制备用于鉴定抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的物质的检测系统中的用途。
5.权利要求4的具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白质的用途，其中蛋白质包含如SEQ-ID No.2、SEQ-ID No.4或SEQ-ID No.6所示的氨基酸序列。
6.权利要求5的具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的蛋白质的用途，其中蛋白质包含SEQ-ID No.2或SEQ-ID No.4的至少100个氨基酸的氨基酸亚序列。
7.用于鉴定抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的物质的方法，其包括，第一步，使用权利要求1、2或3中所提出的DNA序列产生磷酸核糖焦磷酸合成酶1，和第二步，在测试物质的存在下检测植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性。
8.权利要求7的方法，其中植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1通过高通量筛选(HTS)步骤来测定。
9.鉴定可抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的具除草作用的活性物质的方法，该方法包括a)产生转基因植物、植物组织或植物细胞，其包含有编码具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1活性的酶的额外DNA序列，并且能够超量表达具有酶活性的磷酸核糖焦磷酸合成酶1；b)对转基因植物、植物细胞、植物组织或植物器官和未转化的植物、植物细胞、植物组织或植物器官使用一种物质；c)在使用该化学物质之后，确定转基因和未转化的植物、植物细胞、植物组织或者植物器官的生长或者存活能力；以及d)比较在使用该化学物质之后，转基因和未转化的植物、植物细胞、植物组织或者植物器官的生长或者存活能力；当未转化植物、植物细胞、植物组织或者植物器官的生长或者存活能力受到抑制，但是转基因植物、植物细胞、植物组织或者植物器官的生长或者存活能力基本上不受抑制时，证实b)中的物质具有除草剂活性并可抑制植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1的酶活性。
10.一种检测系统，其基于权利要求1、2或3所述的SEQ-ID No.1、SEQ-ID No.3或SEQ-ID No.5或者其部分、或者衍生物的DNA序列的表达，用于鉴定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂。
11.权利要求10的用于鉴定植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂的检测系统，其包括将酶同待研究的测试物质一起孵育，在适当的反应时间后，测定酶的酶活性并同未受抑制的酶的活性相比较。
12.植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂。
13.使用权利要求10或11的检测系统鉴定出的植物磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂。
14.权利要求12或13之一的用做除草剂的抑制剂。
全文摘要
本发明涉及植物来源的编码具有磷酸核糖焦磷酸合成酶1(E.C.2.7.6.1)活性的多肽的DNA序列在制备鉴定磷酸核糖焦磷酸合成酶1抑制剂的检测系统中的用途。通过使用反义技术，本发明首次证明磷酸核糖焦磷酸合成酶1是除草剂的靶标。
文档编号C12Q1/25GK1426480SQ01805753
公开日2003年6月25日 申请日期2001年1月30日 优先权日2000年2月28日
发明者A·赖因德, J·莱尔希尔, U·苏恩瓦德, R·巴杜拉, R·博尔迪特 申请人:巴斯福股份公司