专利名称：制备用作生物材料、特别是用在显微成形外科中的成形微生物纤维素的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种用于制备成形微生物纤维素的方法和装置，这种成形微生物纤维素可用作生物材料、特别是用作显微成形外科中的生物材料，例如用作为造血管和其他的内部中空器官或用于包裹神经纤维的环带等等。
还已知(例如JP 8 126 697 A2、EP 186 495 A2、JP 63 205 109 A1、JP3 165 774 A1)微生物纤维素在制备过程中可制成特殊应用的形状，如片形、棒形、圆柱形和带形等。
已有人描述了下列的制备方法—在接种有产生纤维素的微生物的培养液的表面固定一块板并进行培养。这样就生成了中空的纤维素柱状体，其表面的横截面相应于与空气接触的培养液。—成形的微生物纤维素在可透气的材料(合成的或天然的聚合物)上构成，在此材料的一面与含氧的气体相接触，而另一面与培养液相接触，这样在这一面上就生成了微生物纤维素，接着将其分离出来。—复杂的中空纤维膜例如可通过在多孔表面(聚合化合物)上涂层微生物纤维素而制得，在此培养液被供给到分隔膜的外部(或内部)空隙中。这样空气就能通过中空纤维的内部(或外部)空隙而导入，从而构成复杂的薄膜。
这些方法对于所构成的中空体的内表面的质量有下列缺点—干燥—中空柱状体的内部不均匀的纤维素层的结构具有部分纤维素溶解的危险(特别是在微区不能用作为血管代用品)—复杂的、不仅只由纤维素构成的产品的结构(对生物适应性的影响)。
另外还已知(例如JP 3 272 772 A2)成形的生物材料可用作细微的血管代用品，在此血管假体在中空支撑物上培养，该支撑物是可透氧气的(例如赛璐玢、特氟龙、硅酮、陶瓷、未织构的组织、纤维)。
以这种方式制备的中空柱状体的缺点是没有平滑的内表面，这样就有可能在血管假体内形成血栓。血管代用品的直径越小，内表面的表面质量越重要，因为特别细微的血管容易被形成沉积的血栓堵塞。所以在显微成形外科中直径为1-3mm的血管使用血管假体是困难的，有时是完全不可能的。
在EP 396 344 A3中描述了一种通过微生物制成的中空纤维素、以及一种制备这种纤维素和由这种纤维素人工成形的血管的方法。
制备中空微生物纤维素的第一种方法包括，在可透氧气的中空支撑物内和/或外表面上培养生成纤维素的微生物，所述中空支撑物由赛璐玢、特氟龙、硅酮、陶瓷或一种未织构的或已织构的材料构成。这个可透氧气的中空支撑物被浸入到培养液中。生成纤维素的微生物和培养基被供给到中空支撑物的内和/外侧面。培养也在将含氧的气体(或液体)供给到上述中空支撑物的内和/或外侧面进行。这样就在中空支撑物的表面形成厚度为0.01-20mm的冻胶状的纤维素。由于生成纤维素的微生物的相互作用，所生成的纤维素和中空支撑物就形成纤维素和中空支撑物的复合。假如纤维素没有与支撑物连结，那么在纤维素合成后将中空支撑物移走，能够得到中空成形的制品，该制品只由纤维素构成。
用微生物细胞或用具有稀碱、稀酸、有机溶剂和热水的培养液成分单独或联合地净化这样制得的纤维素。
这个方法的缺点又在于中空柱状体的内部不均匀的纤维素层的结构，这种结构具有部分纤维素溶解的危险(对于特别在微区域的血管是有困难的)。
在EP 396 344 A3中描述了构成中空微生物纤维素的第二中方法，即由微生物制成的纤维素的浸渍、可能必要的后处理和剪切。注满培养液的容器用微生物进行接种。所形成的微生物纤维素用一种介质浸渍，如有必要，进行冷冻和压紧等后处理。这样就能保持住在形成微生物纤维素的纤维之间的液态成分，以阻止液态成分的自由流动。接着进行剪切过程。下列物质可单独或混合作为所述介质，即多元醇，如甘油、赤醇、甘醇、山梨醇和麦芽糖醇；糖类，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖和乳糖；天然的和合成的聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、羧甲基纤维素、琼脂、淀粉、藻酸盐、黄原胶、多糖、寡糖、胶原、明胶和蛋白质；以及水溶性的极性溶剂，如乙腈、二氧杂环己烷、醋酸和丙酸。
这个方法在制备费用和所构成的中空体的内表面的质量方面具有下列缺点—在生物合成过程中不能直接成型—例如决定内表面的粗糙度以及生物适应性的微生物纤维素的亲水性能是变化的。
在EP 396 344 A3中描述了用二个不同直径的玻璃管的制备作为制备中空微生物纤维素的第三种方法。二个玻璃管互相连接，在二个管壁之间的空隙内，在三十天之内进行微生物的培养。这样形成的中空柱状的微生物纤维素，由于其与活的生物、特别是血具有良好的适应性，所以可用来在活体中作为人造血管。血液适应性(抗血栓形成的性能)通过在一个成年的混血狗上的人造血管测试来判断。狗的下降的主动脉和颈静脉的一部分用内径为2-3mm人造血管代替。一个月以后去掉人造血管并且检测血栓的粘结状态。在缝合处形成轻度血栓沉积，在人造血管的整个内表面没有观察到明显的血栓粘结(参见该专利说明书的实施例10)。这就制成了生物学上较好适应的中空柱状纤维素，其特别地可用作直径小于6mm的人造血管。然而由于形成血栓沉积的危险，所以用于细微血管(在已描述过的例子中，2-3mm的直径)是令人担心的。此外显微成形外科的应用要求更小的血管直径，1mm甚至更小。在此，这种血管假体由于上述的在其内壁的血栓粘结而不可能使用。
这种生物材料应是可制成组织和血液适应性的，以及应是包括制备时间在内的尽可能低的成本的，并且可以任意的形状、特别可以不同的中空柱状成型而制备的。
然而根据本发明经接种的培养液并不注入模件壁之间的空隙，例如由优选可互相分开的玻璃件构成的玻璃原模(Glasmatrix)之间的空隙，而是在培养过程中将模件壁(玻璃原模)浸入到含有经过接种的培养液的容器中，这样就使得培养液通过毛细力进入模件壁之间的空隙。由此就保证了在整个培养过程中在容器中有一个用来生成纤维素的潮湿的、需氧的环境。
为了制备作为人造血管的中空柱状的纤维素，将上述已知的由一个外玻璃管和一个在该外玻璃管中固定的轴对称的玻璃件构成的玻璃原模浸入到已经过接种的培养液中，该培养液盛放于上述的容器中，例如锥形瓶中。培养结束后将玻璃原模从容器中取出，拆开该玻璃原模取出已制得的纤维素。
在每个培养过程中各个高表面性能的未使用过的模件用作与血液接触的假体材料表面的生物材料成型的模件壁。这样能够可靠地消除只有用显微镜才能看得见的在模件壁上的培养液成分和可能的纤维素纤维所形成的沉积，在模件的再次使用的情况下，尽管进行了最彻底的净化，还是要对在形成纤维素的模件壁的附着条件的变化产生影响。柱状的玻璃原模是指对于每个新的培养过程都要在外玻璃管中固定一个没使用过的和所要制备的人造血管的内壁的成型玻璃件。商业上可得到的具有标准尺寸的适宜的熔点小管可用作柱状的玻璃件。
本发明的这些方法步骤令人惊奇地表明，在EP 396 344 A3所描述的应用实施例中所用的相当长的时间内没有发现可对比的血栓沉积。以这种方式产生的以及在植入后与血液接触的假体材料表面的表面质量是可再现且非常高的，并且血栓粘结的危险是非常小的。所以根据本发明所制备的生物材料非常好地适合用于显微成形外科中的耐久的人造血管，特别是用于血管直径为1-3mm和更小的人造血管的制备。
本发明所提出的方法的另一个优点是培养时间短(在7-14天后已经在玻璃原模上生成了稳定形状的纤维素层)，以及通过用液体菌种接种液体培养液，在介质中的接种培养物具有良好的分布(“液—液接种培养”)。
用柱状的玻璃原模制备的管形的生物材料不仅可用作血管假体，而且还可用作包裹神经纤维的环带等等，以及用作练习材料、特别用作培训显微成形外科的技术人员的练习材料。由于具有最后所提到的用途，所以可减少试验用动物的数量。迄今为止所用的练习材料例如由橡胶制成，对实际的手术条件只能有不完全的模仿。在从属权利要求中还列出了本发明的其他优选实施方案。本发明还给出了用于实施这个制备方法的适宜的装置，在该装置中，内部的且在每个培养过程都要用新的玻璃原模的玻璃圆柱体用形状稳定的圆柱体和容易分开的套筒形的有弹性的环固定在外玻璃管中。以这种方式，玻璃原模的外玻璃管可再利用，而且在用最少的时间和操作费用进行上述的内玻璃圆柱体的更换的情况下是可拆开的，并且所制成的中空柱状的纤维素可对材料和表面无损伤地容易分离出来。在此，从或到玻璃原模的培养液循环和空气循环通过玻璃管的孔得到保证，玻璃管的孔位于玻璃原模的有弹性的环之间的区域。使用这样的装置是效率高的，因为在接着的培养过程中只需要更换内柱状的玻璃件，不用进行昂贵的净化步骤或将净化步骤限制到最低程度。
为了提高制备生物材料的效率，可同时将上述用于培养的多个玻璃原模浸入到盛放有接种培养的培养液的容器中。
这种制备方法并不限于生物材料的中空柱状成型，也不限于显微成形外科中的应用。
用下面的
图1所示的实施例可更清楚地解释本发明。
在容积为50ml的容器1中加入20ml培养液2(Schramm-Hestrin培养基)，该培养液中每升蒸馏水含有20.00g无水葡萄糖、5.00g细菌胨、5.00g酵母提取物、3.40g磷酸二氢钠二水合物和1.15g柠檬酸一水合物，并具有6.0-6.3的pH值。培养液2在120℃下蒸汽灭菌20分钟，接着接种由培养了十天的液体菌种培养基(Schramm-Hestrin培养基)得到的细菌Acetobacter xylinum(AX 5，莱不锡生物技术研究所的菌种保藏品)。接着将由一个外玻璃管4和一个轴对称地固定在该外管内且圆柱体直径为0.8mm的内玻璃管5构成的玻璃原模3浸入容器1中。由于毛细力的作用，容器1中经接种的培养液2充满于外玻璃管4和内玻璃管5之间的空隙6。在28℃-30℃的温度下培养时间为14天。在这一段时间内不仅在容器1中而且在玻璃原模3中间空隙6内生成了白色的微生物纤维素。
玻璃原模3从容器1中取出并且拆开；将在玻璃原模3中间空隙6中生成的柱状微生物纤维素分离出来，用水仔细小心地洗涤，用沸腾的0.1N氢氧化钠水溶液处理10分钟，再一次用水仔细小心地洗涤，即可得到内径为0.8mm、壁厚为0.7mm、长度可至1cm的微血管假体。
这种微血管假体的血液适应性通过动物试验研究来判断，即在WISTAR鼠上的一段颈动脉用已制得的人造血管代替。此外在手术前用含有纤维素材料的水与生理食盐水交换。在手术后可直接观察到无阻碍的血流。
一个月后取出人造血管，该人造血管通过植入结缔组织和在结缔组织内生成小的血管而很好地与动物体结合在一起，并且是完全没有例外的。人造血管假体、动静脉吻合术区域和具有人造血管的第二动静脉吻合术的颈动脉远侧部分的状态通过组织发生学和电子显微镜技术来检测。在缝合处、在移植处以及在血管中都没观察到血栓形成和增生过程。
假体的内表面包括动静脉吻合区域都被“生物化”，也就是说完全被内皮细胞覆盖了(形成了新的血管内膜)。动静脉吻合处的内表面是平滑的和完全不突出的。该结果通过总共20例动物试验证实。
为了将玻璃原模3在以后的培养过程中再次应用，用新的未使用过的玻璃件5更换已使用过的玻璃件5，就可重新进行上述的过程。
为了用尽可能少的操作费用稳定地将玻璃件5固定在玻璃管4内，而且低费用地、首先在不损伤已制得的纤维素材料的条件下能重新拆开玻璃原模3，玻璃件5用套筒形的硅酮环7固定在玻璃管4内。然而为了保证培养液的交换8和无阻碍的空气循环9，玻璃管4在硅酮环7之间的区域具有孔10。为了保证容器1中无菌和潮湿的、需氧的环境，在培养过程中用盖子11盖住容器。
相关的图例说明表1 - 容器2 - 培养液3 - 玻璃原模4 - 玻璃管5 - 玻璃件6 - 中间空隙7 - 硅酮环8 - 培养液交换9 - 空气循环10 - 孔11 - 盖子
权利要求
1.一种用来制备用作为生物材料的成形微生物纤维素的方法，这种微生物纤维素特别用于显微成形外科中，在该方法中经灭菌的培养液用生成纤维素的细菌例如一种生成稳定形状的纤维素层的微生物菌株Acetobacter xylinum进行接种，并且在模件壁之间的空隙培养所述细菌，而且在培养中生成的生物材料与模件壁分离并进行净化，其特征在于，模件壁浸入到盛有已经过接种的培养液的容器中，所述微生物不仅在容器中，而且在用来生成纤维素的模件壁之间的空隙内，在潮湿的、需氧的环境下培养，在每个制备过程中每次一个未使用过的高表面性能的模件用作为与血液接触的假体材料表面成型的模件壁。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，由优选可互相分开的玻璃件构成的玻璃原模作为模件壁，在该模件壁之间培养微生物。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，为了制备中空柱状的生物材料，将由一个外玻璃管和一个在该外玻璃管内置入的同轴对称的较小直径的玻璃件构成的玻璃原模，浸入盛有经过接种的培养液的容器中。
4.根据权利要求2的方法，其特征在于，为了同时制备多个生物材料，可将多个玻璃原模浸入盛有经过接种的培养液的容器中。
5.一种用来实施根据权利要求3的方法的装置，其特征在于，至少一个由一个外玻璃管(4)和一个在该外玻璃管内置入的同轴对称的较小直径的玻璃件(5)构成的玻璃原模浸入盛有经过接种的培养液(2)的容器(1)中，其中内置的玻璃件(5)出于可容易操作、置放稳定和容易分开的目的而通过弹性、优选由硅酮制成的环固定在玻璃管(4)内的轴对称中心处，这可保证由待制备生物材料成型的玻璃原模(3)的中间空隙(6)进或出的培养液交换(8)和空气循环(9)。
6.根据权利要求5的装置，其特征在于，培养液交换(8)和空气循环(9)通过在弹性环(7)之间的、在玻璃原模(3)的区域内的外玻璃管(4)的各至少一个孔而得到保证。
7.根据权利要求5的装置，其特征在于，一种已知的锥形瓶作为玻璃原模(3)浸入其中的容器(1)。
全文摘要
异体材料用作为人造血管有形成血栓的危险，所以特别地不适合或只能有条件地适合用于显微成形外科(1－3mm和更小的血管内径)。特别需要有下述性能的生物材料用作为非常细微的血管的代替品，这种生物材料保证了与血液接触的假体材料表面的非常高的质量，并且可靠地避免此等血栓粘结。为了制备这种生物材料，将模件壁，特别是由玻璃管和玻璃件构成玻璃原模浸入盛有经接种的培养液的容器中，结果这种经接种的培养液被吸入到模件壁之间的空隙，并在潮湿的、需氧的环境中培养。此外，在每个培养过程中都用一个未用过的模件(玻璃件)作为模件壁，该模件壁用于与血液接触的假体材料表面的生物材料的成型。只有这样，血管假体可再现的高表面质量才是可能的，并安全地避免了在所用的生物材料上血栓粘结的危险。本方法特别适合应用于显微成形外科，例如用作血管和其他的内部中空器官的代用品或用作包裹神经纤维的环带等。
文档编号C12M1/00GK1401005SQ01805153
公开日2003年3月5日 申请日期2001年2月13日 优先权日2000年2月17日
发明者迪特尔·克莱姆, 西尔维亚·马尔施, 迪特尔·舒曼, 乌尔丽克·乌德哈尔特 申请人:苏拉化学有限公司