专利名称：基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及呼吸道合胞病毒(RSV)，具体地说是一种基因NSl缺陷型呼吸道合 胞病毒(ANSIRSV)及其治疗肺癌的应用。
背景技术：
肺癌根据组织病理学可以可分为小细胞肺癌( 15% )和非小细胞肺癌 (NSCLC, 85%)。2009年仅美国新增大约219，440病人，159，390人死于肺癌.目 前还没有有效的治疗手段，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)对化疗有抗药性。放射疗法， 或者结合化疗，手术对治疗NSCLC有一定的帮助。但是肿瘤抗放射性，包括治疗前以及 治疗阶段过程中的内在的肿瘤抗放射性是放疗的一大难题。目前还没有更好的治疗恶化 或转移性的NSCLC。呼吸道合胞病毒包含大约10个不同的基因，成线行排列。目前，尚无运用基因 工程改造的呼吸道合胞病毒来治疗肺癌的报导。
发明内容
所要解决的技术问题本发明目的是提供一种通过基因工程改造的呼吸道合胞 病毒用于治疗肺癌。技术方案一种基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，其特征是所述基因NSl缺陷 型呼吸道合胞病毒是用Vero细胞合成、Vero细胞经用携带有NSl-缺陷病毒cDNA、病毒 N，M2-1，P和L基因的质粒共转染而形成。所述基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，是用反向基因策略删除呼吸道合胞病毒 中的基因NSl。所述基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒应用，是应用于治疗肺癌，杀伤肺癌细 胞。所述经过基因工程改造的呼吸道合胞病毒可为其他病毒，所说的其他病毒带有 类似RSVNSl基因，该基因被删除，从而具有杀伤癌症的效果。本发明有如下显著效果1、本发明基于杀瘤病毒疗法.该发明中，呼吸道合胞病毒的NSl基因被删除， 改良后的该病毒只杀死癌症细胞，而对正常细胞没有任何影响。本发明创造性地删除 NSl基因，生成的N S 1基因缺陷呼吸道合胞病毒(ANSI RSV)具有选择性杀伤癌症细 胞，而不影响正常细胞。本发明特点之一为反向基因策略(逆向分子生物学方法)去 除NSl基因(病毒正链RNA上122到630碱基序列).ANSI RSV营救则通过用携带有 NSl-缺陷病毒cDNA，病毒N，M2-1，P和L基因的质粒共转染Vero细胞。呼吸道合胞 病毒NSl蛋白为一型IFN拮抗剂，而ANSI RSV感染肿瘤组织局部能生成更多的IFN， 从而阻止病毒在正常细胞中的复制，但并不影响病毒杀伤肿瘤细胞，从而选择性地抗肿 瘤。
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2、呼吸道合胞病毒包含大约10个不同的基因，成线行排列。在启动子附近 的基因转录的几率大于远端的基因。NSl基因位于靠近于启动子，在基因全序列的3’ 端.因此他的mRNA转录最多，而且成启动-中止-再启动的模式。蛋白不存在呼吸道 合胞病毒的颗粒中而只见于受感染细胞故被称为非结构蛋白.研究证实，NSl能阻断一型 干扰素信号通路，表明NSl能直接抑制宿主的免疫放应。所谓杀瘤病毒疗法，是通过基 因工程改良病毒，选择性地杀死癌细胞，而保护正常组织不受伤害，从而达到治疗肿瘤 的目的。杀瘤病毒在肿瘤细胞中不断地复制，从而致使癌细胞裂解，或者诱导癌症细胞 凋亡。NSl基因去除后的改良型呼吸道合胞病毒，具有这样的功能。3、本发明也可以通过其他的方式，去除NSl基因，从而实现类似的功能.在临 床治疗上，可以通过静脉注射基因工程的NSl基因缺陷呼吸道合胞病毒，或直接肿瘤局 部运用该病毒，达到治疗的效果.4、本发明特别是对治疗肺癌具有很好的效果，细胞丧失正常的凋亡途径就可 能发展成癌症.本发明人事科的研究发现NSl缺陷RSV(ANSI RSV)可以选择性地诱导 A549肺肿瘤细胞产生凋亡，同时降低线粒体Δ Ψιη值和促进线粒体肿胀，提示ANSI RSV通过线粒体介道的细胞凋亡途径杀伤肿瘤细胞。
图1是呼吸道合胞病毒的基因序列。图2是免疫印迹确定病毒NSl蛋白。图3之A、B是病毒感染NSCLC及正常细胞，A是感染后24小时A549细胞和 WI-38细胞形状的变化。B是感染20小时后病毒滴度空斑实验。图3之C、D、E、F，其中，C、D为BALB/c裸鼠皮下注射A549癌细胞并进
行病毒治疗，对照鼠注射等量的悬浮病毒溶剂，治疗后对肿瘤大小测量，每个数据为平 均数士标准误。其中，E、F为治疗3天后，取肿瘤和其他组织器官，均浆.病毒滴度 用和总RNAs用RT-PCR测量F基因表达定量。图4为流式细胞仪测量细胞周期。A549细胞感染病毒(MOI = 5)，24hr后收 集细胞并用70%冷冻乙醇固定，细胞用PI(50yg/ml ； Sigma)和RNaseA (50 μ g/ml ； Sigma)室温染色30分钟，上机检测。图5为NSl蛋白阻止细胞凋亡和线粒体Δ Ψιη值.(A)A549细胞和NHBE细胞 分别感染病毒(MOI = 5)，20和48小时后用磷脂结合蛋白(annexinV)结合技术及PI吸 收技术检测细胞凋亡.。(B-C)感染后5小时及20小时A549裂解，并用免疫印迹法进 行检测。(D)H1299(p53-/-)细胞凋亡测试。图6为RSV病毒诱使A549肺癌细胞线粒体膜电势Δ Ψιη及其结构发生改变。 (A-B)JC-I染料用于检测线粒体膜电位Δ Ψιη。其荧光强度经由流式细胞仪界定。(C) 透射电子显微镜观测线粒体内电子密度及线粒体大小。图7为细胞病变测试检测ANSI RSV选择性地杀伤不同株人肺癌细胞。
具体实施例方式ANSI RSV勾建本发明呼吸道合胞病毒(RSV)，采用反向基因策略(逆向分子生物学方法)去除NSl基因(病毒正链RNA上122到630碱基序列)，被去除NSl基 因的呼吸道合胞病毒称为基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒(ANSI RSV)，ANSI RSV营 救则通过用携带有NSl-缺陷病毒cDNA，病毒N，M2-1，P和L基因的质粒共转染Vero 细胞。NSl基因也可以通过其他的方式，而达到同样目的。为确认生成的病毒ANSI RSV是否缺乏NSl基因，我们用野生wt RSV和ANSl RSV分别感染Vero细胞，NSl蛋白用免疫印迹检测，图2显示，NSl蛋白只现于野生 RSV,而未见于ANSI RSV.该结果表明，ΔNSl RSV缺乏NSl基因。Δ NSl RSV病毒选择性地杀伤NSCLC细胞。NSCLC细胞及WI-38正常人二倍 体肺.细胞分别感染野生性wt或基因工程ANSI RSV病毒(MOI = 5).感染后其细胞形 状以及病毒的复制分别进行了检测。图3之A显示ANS1RSV病毒选择性地诱导Α549 细胞产生病变效应(CPE)，并且感染24小时后，Α549细胞中ANSI RSV滴度明显高于 WI_38(图3之B)。该结果表明A549细胞有效地支持ANSI RSV病毒的繁殖，因为它不 能有效地生成IFN，并对其反应。Bose博士报道野生型wtRSV可以杀伤前列腺癌细胞。 为进一步的验证是否高浓度的野生型wt RSV杀伤肺癌症细胞，我们在高浓度下(MOI = 10)感染了不同的肺肿瘤细胞和正常细胞，并检测了感染后24hr的细胞病变效应，如表 格1所述，基因工程病毒ANSI RSV，而不是野生型wtRSV，特异性的杀伤了 NSCLC细 胞.这些体外结果证实ANSI RSV选择性杀伤癌细胞，发明人进一步进行了体内动物实 验，A549细胞注射到4-6周大的BALB/c裸鼠左右大腿外侧皮下(n = 4per group)待其 形成肿瘤块。然后局部注射ANSI RSV及对照试剂，结果表明只有ANSI RSV能特 异性缩小肿瘤块的大小，具有明显抗瘤特性。ANSI RSV病毒诱导A549细胞sub_Gl高峰，癌细胞的细胞分裂循环失控，因 此抑制细胞分裂循环可以有效地控制细胞复制，为检测ANSI RSV病毒能否诱导细胞分 裂的中止，用浓度为MOI = 5的病毒感染了 A549.碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色， 流式细胞仪分析显示病毒感染对细胞循环没有影响，但细胞凋亡指标sub-Gl峰在ANSI RSV感染的细胞中明显增高(图4)。ANSI RSV诱导癌细胞的凋亡，而非正常细胞，为检测ΔNSl RSV对细胞凋亡 的作用，分别感染Α549细胞和NHBE (MOI = 5)，细胞凋亡用磷脂结合蛋白(annexin V) 结合技术检测.图5中A显示ANSI RSV相对于细胞自发性的凋亡，选择性地诱导了肿 瘤细胞的凋亡，该结果进一步被免疫印迹证实(图5中B，C)。最近有研究报道，p53基因参与了 RSV诱导的凋亡，为进一步证实p53是否为 ANSI RSV诱导的凋亡所必需我们感染H1299细胞(p53缺陷型)，图5中D实验结果显示 ANSI RSV仍然可诱导H1299细胞发生凋亡，表明p53非ANSI RSV诱导凋亡所必需。ANSI RSV降低了线粒体Δ Ψιη值，并诱导线粒体肿胀。本发明表明ANSI RSV是通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡(Fig.5B_C)，为检测病毒感染对线粒体ΔΨιη 值的影响，本实验检测了病毒感染后Α549细胞中ΔΨιη值(ΜΟΙ = 5)图6中Α，B显示 NSl可以防止病毒感染后线粒体降低Δ Ψιη，电子显微镜下进一步证实该结果。在溶剂 治疗作为对照的Α549细胞，显示线粒体电子密度正常，而Δ NSl RSV感染的Α549细胞 线粒体出现肿胀，野生型wt RSV感染的线粒体其肿胀程度较ANSI RSV轻。ANS1RSV 感染后，干扰素IFN-β对线粒体形状没有作用(图6中C)。
所述用反向基因策略(逆向分子生物学方法)删除呼吸道合胞病毒中的基因 NS1。具体是以全长病毒正链cDNA为模板，设计一对带有核酸内切酶的PCR引物分 别对位于NSl基因的起始前端和NS2基因的起始端，用PCR方法逆向扩增出一段已不含 有NSl基因的(即从核酸序列上去除了硷基122到630的一小段NSl基因)DNA片段， 然后克隆到质粒中。该质粒可用于后续的质粒共转染制备NSl缺陷型RSV病毒。
权利要求
1.一种基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，其特征是所述基因NSl缺陷型呼吸道合胞 病毒是用Vero细胞合成、Vero细胞经用携带有NSl-缺陷病毒cDNA、病毒N，M2-1， P和L基因的质粒共转染而形成。
2.根据权利要求1所述的一种基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，其特征是用反向基 因策略删除呼吸道合胞病毒中的基因NSl。
3.—种基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒的应用，其特征是应用于治疗肺癌，杀伤肺 癌细胞。
全文摘要
本发明涉及一种基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用，其是由基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒是用Vero细胞合成、Vero细胞经用携带有NS1-缺陷病毒cDNA、病毒N，M2-1，P和L基因的质粒共转染而形成。所述基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒，是用反向基因策略删除呼吸道合胞病毒中的基因NS1。本发明应用于治疗肺癌，选择性地杀伤肺癌细胞。
文档编号C12R1/93GK102021149SQ20101024975
公开日2011年4月20日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者张卫东, 蒋礼先, 高利卫 申请人:张卫东, 蒋礼先, 高利卫