用于预防、诊断和治疗呼吸道合胞病毒感染的嵌合抗原及其抗体的制作方法

专利名称：用于预防、诊断和治疗呼吸道合胞病毒感染的嵌合抗原及其抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防、诊断和治疗呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytial virus，RSV)感染的嵌合抗原及其抗体，特别是可用于RSV疫苗制备的新抗原。
背景技术：
RSV属于副粘病毒科肺病毒属，是一种具被膜的非节段单链RNA(负链)病毒。RSV感染遍布全球，是引起婴幼儿严重下呼吸道感染的最主要的原因，也是引起严重老年性并发症的主要病原体。RSV感染率和患者的住院率都很高，而且患者在短时间内和终身发生多次重复感染。在发达国家，有0.5-1.5％的住院婴幼儿死于RSV感染。RSV在老人聚居地易发生暴发性流行，患病率和死亡率极高。全世界每年有6千5百万例感染，16万人死亡。
目前治疗RSV的药物限于利巴韦林(Ribavirin)，虽然它广泛用于治疗骨髓移植病人的RSV感染，但对儿童的RSV感染的疗效仍存争议。用大剂量的人免疫球蛋白或者人源化的单克隆抗体预防高危婴幼儿的RSV感染有一定的疗效，但抗体治疗的费用向来是很昂贵的。因此，在全球范围内，特别是发展中国家推广十分困难。然而，目前还没有研制出成功的RSV疫苗。所以研制安全、有效的疫苗是一项十分紧迫的任务。与治疗和预防相关的一个问题是成人RSV感染的临床上诊断，其可靠性仍待提高。

发明内容
RSV基因组编码10个蛋白，其中G蛋白是具有免疫原性的两种被膜蛋白之一。G蛋白含有中和抗体表位，可诱导中和抗体产生。RSV的另一个重要蛋白M2蛋白，含有CTL表位，可激发CTL反应。本发明中出乎意料地发现，特定的G蛋白片段和/或CTL表位特别适用于以下用途(1)通过化学偶联或者DNA重组技术，与载体蛋白偶联或者融合，所形成的新的缀合/重组抗原分子可用于构建预防RSV感染的疫苗；(2)编码这些缀合/重组抗原的DNA分子可用于构建预防RSV感染的核酸疫苗；(3)这些新的缀合/重组抗原分子可用于免疫宿主，产生可用于治疗和预防RSV感染的有效抗体；这些抗原以及相应的抗体可作为诊断试剂的组成成份，用于诊断RSV感染。其中包含来源于RSV A或B亚型的G蛋白片段，CTL表位和载体蛋白中的至少两种，即其中必有RSV A或B亚型的G蛋白片段或者CTL表位。
本发明的另一目的是提供编码所述抗原的核酸分子，以及含有所述核酸的重组表达载体。
本发明的又一目的是提供重组生产所述抗原的方法。
本发明还涉及针对所述抗原的抗体。
本发明最后涉及所述抗原、相应的核酸分子、抗体在预防、诊断和治疗呼吸道合胞病毒感染中的用途。


图1显示了重组质粒的PCR鉴定结果。其中各泳道说明如下AM为分子量标准DL-2000(大连TaKaRa公司产品)；1pET-DsbA-G151；2pET-DsbA-G126；3pET-DsbA-G101.B1阴性对照；2阳性对照；3398bp的DNA分子量标准；4-6分别为pET-CKS-G126，pET-GST-G126和pMBP-P-G126.C1阴性对照；2阳性对照；3353bp的DNA分子量标准；4-6分别为pET-CKS-G101 pET-GST-G101和pMBP-P-G101。
图2显示了部分重组抗原在E.coli中的表达产物的SDS-PAGE(12％)分析。其中各泳道说明如下A1-4分别为pET-DsbA，pET-DsbA-G101，pET-DsbA-G126和pET-DsbA-G151；5-7分别为pET-CKS，pET-CKS-G101和pET-CKS-G126；8，9分别为pET-GST和pET-GST-G101.B1，pET-MBP；2和4，pET-MBP-G126；3，pET-MBP-G101。
图3图示了重组蛋白在细菌裂解物中所占的比例。
图4是双向免疫扩散实验检测抗原-抗体结合的示意图。其中A 说明RSV与抗血清的结合。中心孔为原倍抗血清，A-F分别为不同倍数稀释的RSV抗原；B 说明重组抗原与抗血清的结合。中心孔为原倍抗血清，A-C为不同倍数稀释DsbA-G101，D-F为DsbA-G126；C 说明重组抗原与抗血清的结合。中心孔为原倍抗血清，A-C为不同倍数稀释DsbA-G151，D-F为DsbA。
图5显示了空斑抑制试验检测融合蛋白动物水平活性的结果。
图6显示了血清对RSV的抑制作用实验结果。
图7显示了含有G101和CTL表位的重组蛋白抗原DsbA-G101-Linker-F/M2的结构。
图8显示了小鼠肺匀浆上清中抗RSV的IgG抗体。
图9显示了小鼠血清中抗RSV的IgG抗体。
图10显示了小鼠肺匀浆上清中抗重组蛋白D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2的IgG抗体。
图11显示了小鼠血清中抗重组蛋白D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2的IgG抗体。
图12显示了小鼠血清中抗RSV的中和抗体滴度。
图13显示了D-G1-F/M2和D-G1LF/M2诱导的RSV特异性的CTL应答。
图14显示了血清抗体在体外对RSV病毒的抑制作用。
图15显示了鼻腔粘膜抗体在体外对RSV病毒的抑制作用。
图16显示了D-G1加强D-F/M2诱导产生的CTL应答。
图17显示了小鼠血清中抗G1和抗RSV的IgG抗体滴度。
具体实施例方式
为描述简便，在本发明中，G蛋白片段在表示抗原组成的示式中用“FG”表示，载体蛋白用“CP”表示，CTL表位用“CTL”表示。
G蛋白片段(FG)可以具有G蛋白的氨基酸序列中第m-n位氨基酸所示的序列，或其保留功能的变体，其中m是10-150之间的任何整数，n是180-300之间的任何整数。m优选是25-140，更优选是50-130，最优选是75-125。n优选是190-275，更优选是200-250，最优选是220-230，尤其是225。最优选地，G蛋白片段(FG)可以具有G蛋白的氨基酸序列中第75-225位、第100-225位或第125-225位氨基酸残基间的肽序列，或其保留功能的变体。
CTL表位主要来自M2蛋白。
载体蛋白(carrier protein，CP)选自热休克蛋白(HSPs)、牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、霍乱毒素亚单位CTB和TT蛋白、DsbA、CKS、GST和MBP，或其功能性片段，优选热休克蛋白(HSPs)、DsbA(二硫键合成酶)、CKS(CMP-KDO合成酶)、GST(谷胱甘肽转移酶)或MBP(分泌型麦芽糖结合蛋白)或其保留功能的变体或者它们的功能性片段。本发明优选的热休克蛋白载体蛋白，是一类分子伴侣，在正常情况下，它帮助蛋白质的正确折叠和装配，而且HSPs在保护性免疫中扮演着非常重要的角色。HSPs可以加强体液免疫和细胞免疫，尤其可进一步增加MHC I类分子限制的CD8+T细胞的激活，提高CTL活性，而CD8+CTL应答不仅可直接杀伤病毒感染细胞，而且可下调Th2应答，使免疫反应更加平衡。HSPs是第一类哺乳动物原性佐剂，HSPs不产生抗体，仅起佐剂作用诱导肽特异性的抗体和CD8+T细胞应答，可以避免象破伤风类毒素-肽和白喉类毒素-肽复合物所引起的疫苗之间的交叉免疫抑制。本发明优选的DsbA、CKS、GST和MBP载体蛋白，一方面可以辅助G蛋白片段的折叠，形成正确的空间构象，有利于保持抗原的自然特性。另一方面，可以增强G蛋白片段的稳定性和免疫原性。此外，还可以促进抗原在大肠杆菌内以可溶形式表达，这对下游的分离纯化是有利的，可以降低制备抗原样品的成本。
在本发明中，保留功能的变体是指与亲本多肽在氨基酸序列上具有至少80％同源性，优选至少90％同源性，更优选至少95％或98％同源性，或者因一或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或取代而有所不同的多肽，该多肽仍保留了亲本多肽的功能活性。优选这种取代是小的变化或保守性取代。
通常视为保守的取代是脂肪族氨基酸Ala，Val，Leu和Ile中相互之间的取代；羟基残基Ser和Thr的互换，酸性残基Asp和Glu的互换，酰胺残基Asn和Gln之间的取代，碱性残基Lys和Arg的互换以及芳香族残基Phe和Tyr的相互取代。
有关何种氨基酸变化很可能是表型沉默的(即不会对功能有显著不利的影响)的其它指南例见Bowie，J.U.等人的“译解蛋白质序列中的信息对氨基酸取代的耐受”，科学，2471306-1310(1990)。
本发明的载体蛋白、G蛋白片段与CTL表位间的连接方式是可变的，可以是由N端到C端为CP+FG+CTL，CP+CTL+FG，FG+CTL+CP，CTL+FG+CP，FG+CP+CTL，CTL+CP+FG，CTL+FG，FG+CTL，CP+FG，FG+CP，CP+CTL，或者CTL+CP。分子内伴侣和G蛋白片段可以重复出现在一个抗原分子中。本发明的载体蛋白与G蛋白片段间、载体蛋白与CTL表位间，以及G蛋白片段和CTL表位间还可以通过连接蛋白连接，连接蛋白可以选自存在于粘膜细胞表面的受体。
本发明的G蛋白片段、CTL表位与载体分子，G蛋白片段与CTL表位间，载体蛋白分子与CTL表位间的连接可以通过DNA重组或者化学偶联的方式实现。
本发明的抗原可以化学合成，或者由相应的组成成分经化学缀合方法产生，或者可以由其编码核酸分子经重组方法生产。
本发明也涉及编码本发明抗原的DNA分子，包含本发明DNA分子的重组载体，用重组载体进行基因工程改造的宿主细胞，和通过重组技术生产本发明所述抗原的方法。
用本发明的载体对宿主细胞进行基因工程改造(转导或转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体的形式可以是例如质粒，病毒颗粒，噬菌体等等。可在适当的常规营养培养基中培养经改造的宿主细胞。如温度，pH等的培养条件是选用来表达的宿主细胞以前所用的那些条件，这对于本领域技术人员而言应是显而易见的。
通过重组技术可将本发明的多核苷酸用于生产多肽，因此，例如，所述多核苷酸可包含在多种表达载体中的任一种中以表达多肽。这种载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA、病毒DNA(如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒和假狂犬病病毒)之联合的载体。然而，只要能在宿主中复制和存活，任何其它的载体都可使用。
用于表达的宿主可以是原核系统，如最普遍使用的E.coli，或真核生物或者它们的细胞系，包括但不限于酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳细胞、鸟细胞和高等植物细胞。
表达载体中的DNA序列与适当的表达控制序列(启动子)可操作连接，以指导其表达。至于这种启动子的代表性例子，应提及的有LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp，噬菌体λPL启动子和已知能控制原核细胞或真核细胞或它们的病毒中的基因表达的其它启动子。表达载体也含有用于起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。载体也包括用于增强表达的适当序列。
另外，表达载体优选含有一个或多个选择性标记基因以提供可用于选择已转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或大肠杆菌中的四环素和氨苄青霉素抗性。
可使用含有上文所述适当的DNA序列以及适当的启动子或控制序列的载体来转化适当的宿主以使宿主表达蛋白质。
至于适当宿主的代表性例子，应提及的有细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和Spodoptera Sf9；动物细胞，如CHO，COS或Bowes黑素瘤细胞；腺病毒；植物细胞等。根据本文的教导，本领域技术人员应能掌握如何选择适当的宿主。
更具体地，本发明也包括含有一个或多个上文广泛描述的序列的重组构建体。这些构建体含有载体，如质粒或病毒载体，其中插入了本发明的序列。大量的适当的载体和启动子是本领域技术人员熟知的，并可商购，例如用于细菌中的载体有pQE70(Qiagen)等，用于真核细胞中的有pSV2CAT(Stratagene)等。然而，只要能在宿主中复制和存活，任何其它的质粒或载体都可使用。
特别合适的细菌启动子包括lacI启动子，lacZ启动子，T3启动子，T7启动子，gpt启动子，λPR、PL启动子和trp启动子。真核启动子包括CMV即早期启动子，HSV胸苷激酶启动子，早期和晚期SV40启动子，逆转录病毒的LTR启动子和小鼠金属硫蛋白-I启动子。适当载体和启动子的选择是本领域技术人员熟知的。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞，或低等真核细胞如酵母细胞；或者宿主细胞也可以是原核细胞如细菌细胞。可通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔将构建体导入宿主细胞中。
可以常规方式使用宿主细胞中的构建体以产生由重组序列编码的基因产物。或者，也可通过常规的肽合成仪合成生产本发明的多肽。
在适当启动子的控制下，成熟的蛋白质可在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达。使用衍生自本发明DNA构建体的RNA，也可利用无细胞的翻译系统来产生这种蛋白质。可在原核和真核宿主中使用的适当的克隆和表达载体描述于Sambrook等人，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港，纽约(1989)，该文献已列入本文作为参考。
为了将翻译的蛋白质分泌到内质网腔、外周质空间或胞外环境中，可将适当的分泌信号掺入被表达的多肽中。所述信号对于该多肽而言可以是内源的，也可以是外源的。
多肽可以经修饰的形式，如融合蛋白的形式被表达，多肽不仅可包括分泌信号，也可包括其它的异源功能区域。例如，可在多肽的N-末端加上另外的氨基酸区域，尤其是带电的氨基酸以改善多肽在宿主细胞中、纯化过程中或随后的处理和储存过程中的稳定性和持久性。也可以在多肽中加入肽组成成分以便于纯化，最终制备多肽之前可除去这类区域。本领域技术人员熟知在多肽中加入肽组成成分以引发分泌或外泌，改善稳定性和便于纯化等等，这是本领域内的常规技术。优选的融合蛋白含有得自免疫球蛋白的异源区域，该区域可用于增溶受体。
用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的多个种，但并不限于此。
转化合适的宿主菌株并将宿主菌株培养至适当的细胞密度之后，通过适当的方式(如温度变化或化学诱导)诱导选定的启动子，并将细胞再培养一段时间。
一般通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破碎细胞，保留所得的粗提取物以进一步纯化。
通过包括冷冻-融化循环，超声处理，机械破碎，或使用细胞裂解剂等在内的任何便利方法可破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，这些方法是本领域技术人员所熟知的。
可使用多种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白，哺乳动物表达系统的例子包括Gluzman，细胞，23175(1981)所述的猴肾成纤维细胞COS-7系，以及能表达可容性载体的其它细胞系，如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。
通过包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阳离子或阴离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和凝集素层析等的方法从重组细胞培养物中回收和纯化KGF-2多肽。必要时，可进行蛋白质的重折叠步骤来完成成熟蛋白质的构型。最后，可使用高效液相层析(HPLC)完成最终的纯化步骤。
本发明的抗原可以是化学合成方法的产物，或由原核或真核宿主(如培养中的细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)通过重组技术产生。宿主的选择取决于重组生产所用的方法。本发明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
本发明还涉及编码所述抗原的RNA分子。获得抗原的方法还可以是但不限于体外无细胞体系，如麦胚提取物翻译体系、网织细胞裂解物翻译体系或其它人工翻译体系。
本发明还涉及对应于所述抗原的抗体，无论抗体的制备方式如何，如本领域专业人员所知的噬菌体库筛选法，或者通过杂交瘤细胞产生，或者免疫实验动物产生。
本发明的抗体可由本领域技术人员已知的众多技术制备。参阅，如Harlow和Lane，《抗体实验室手册》，冷泉港实验室，1988。在一种此类技术中，首先将含抗原性多肽的免疫原注射入多种哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊等)中的任一种中。在这一步中，本发明的多肽不需修饰即可作为免疫原。或者，特别是对于相对短的多肽而言，可将多肽与载体蛋白(如牛血清白蛋白或匙孔虫戚血蓝蛋白)连接在一起，以激发更强的免疫应答。将免疫原注射入动物宿主，优选根据预定的时间表，再注射一次或多次加强免疫，并定时对动物取血。对多肽特异的多克隆抗体可以从抗血清中，通过例如利用了偶联至合适固相支持物上的多肽的亲和层析法纯化得到。
特异于目的抗原性多肽的单克隆抗体，举例而言，可以用Kohler和Milstein，欧洲免疫学杂志，6511-519，1976的技术和改进方法制备。简单的说，这些方法涉及制备能产生具有所需特异性(也就是与目的多肽的反应性)的抗体的永久细胞系。这种细胞系，可以由例如上述免疫动物的脾脏细胞获取。接着将脾脏细胞永生化，例如通过与骨髓瘤细胞融合伙伴、最好是与免疫动物同系的骨髓瘤细胞融合伙伴融合。可以采用多种融合技术。例如，将脾脏细胞和骨髓瘤细胞与非离子型表面活性剂混合几分钟，然后以低密度平铺在能够支持杂合细胞生长而不能支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。优选的选择技术中利用了HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)筛选。经过足够时间，通常大约1到2周后，就可观察到杂合体集落。挑取单个集落，检测其与多肽的结合活性。优选具有高反应活性和特异性的杂交瘤。
单克隆抗体可以从正在生长的杂交瘤集落上清液中分离得到。此外，可采用多种技术提高产量，例如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主如小鼠的腹腔中，然后可从腹水或血液中收获单克隆抗体。抗体中的污染物可以用常规技术除去，如层析法、凝胶过滤、沉淀和抽提。本发明的多肽可在纯化过程中用于例如亲和层析步骤。
本发明的单克隆抗体可用作治疗剂，以抑制或消除RSV感染。抗体可单独使用，或与一种或多种治疗药剂偶联。在这方面合适的试剂包括放射性核素、分化诱导剂、药物、毒素和它们的衍生物。
本发明的抗原、抗体以及多核苷酸可用于制备药物或者诊断试剂，特别是用于诊断、预防和治疗RSV A或B亚型的感染的组合物。
可将本发明的抗原、抗体或核酸分子与适当的药用载体联合使用以制成药物组合物。这种组合物含有治疗有效量的多肽和药学可接受的载体或赋形剂。所述载体包括但不限于盐水，缓冲盐溶液，葡聚糖，水，甘油，乙醇及其联合。制剂应适合施用的模式。
考虑到各个患者的临床条件，药物组合物释放的位点，施用的方法，施用的计划和实际操作人员已知的其它因素，以与良好的医学实践一致的方式配制和服用治疗所用的药物组合物。因此，通过上述考虑可确定用于本文目的的“有效量”。
通常通过将本发明的抗原、抗体或核酸分子均匀和密切地与液体载体或精细分开的固体载体或这两者接触可制备制剂。然后，如有必要，将产物制成所需的制剂形状。优选载体是胃肠外载体，更优选为与受体血液等渗的溶液。这种载体的例子包括水，盐水，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。如固定油和乙基油酸之类的不含水的载体以及脂质体在本文中也是有用的。本领域中已知的适当的制剂见于Remington’s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton，PA。
本发明药物组合物的可以多种方式施用，例如口服，直肠，胃肠外等。“药学可接受的载体”是指无毒性的固体，半固体或液体填充剂，稀释剂，包裹材料或任何形式的制剂辅助物。本文所用的术语“胃肠外”指的是包括静脉内，肌内，腹膜内，胸骨内，皮下和动脉内注射和灌注等的施用模式。显然，组合物的精确剂量会因个体的临床状况、活性剂的清除速率等而改变。
下面通过实施例对本发明作进一步描述。
实施例实施例1.G蛋白基因全序列的克隆1.1病毒培养A型RSV(Long株，ATCC CCL-23)在宿主细胞HEp-2上繁殖，基本培养基为DMEM，添加2％胎牛血清，pH7.4-7.6。待CPE(致细胞病变效应)达50％-75％时以0.25％的胰酶(pH8.0)消化，300×g离心5min收集细胞，用于RSV RNA分离。
1.2RSV RNA的提取按QIAGEN公司的RNeasyMini Handbook的方法进行。在含有约1×105个细胞的1.5ml EP管内加入350μl RLT裂解液，颠倒混匀充分裂解细胞，加入350μl 70％的乙醇混匀，悉数加载到小柱，10000rpm离心5min，弃去液体。加载500μl RPE于小柱上，10000rpm 15s洗柱，重复一次。最后以30-50μl无RNase的纯水洗脱RNA，收集RNA溶液，-20℃保存备用。
1.3RT-PCR获得G蛋白基因根据GenBank中已知的G蛋白基因两端的序列设计引物5’端引物AGP1E为5’GCGAATTCGGGGCAAATGCAAACATG 3’，3’端引物AGP2H为5’GCAAGCTTTAACTACTGGCGTGTTGT 3’，其中画线部分分别为EcoR I和Hind III的酶切位点。合成第一链反应条件为在25μl反应体系中含有RNA 2.0μg，Ramdom primer1.0μg，H2O 10.8μl。70℃下保温5min，冰上冷却5min，补加First strand 5×buffer 5μl，RNasin 40U.37℃下保温3min后补加10mM dNTP 2.5μl，AMW 30U，37℃下保温1h，70℃下保温15min。冰上冷却后补加18U RNase H，37℃下保温20min。合成第二链的PCR条件为在50μl反应体系中含有H2O 35.6μl，10×buffer 5.0μl，2.5mM dNTP 4μl，Taqase 2U，cDNA 3μl，5’和3’端引物共3μl。反应条件为94℃2min，94℃45s，45℃45s，72℃1min，30个循环。
1.4G蛋白基因的克隆和鉴定PCR扩增产物经琼脂糖胶电泳分离，回收大小约为930bp的目标带，经EcoR I和Hind III双酶切，与同样双酶切的pUC 18载体连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，挑选重组子，经质粒小量提取后进行酶切和PCR鉴定，将通过双重鉴定含有目的基因的克隆进行测序，最终获得含有全长RSV G蛋白基因的重组质粒pUC18-G(10)。
实施例2.表达载体的构建2.1分子内伴侣DsbA基因片段的获得根据DsbA基因片段两端的序列设计引物，以重组质粒pUC18-DsbA(博士后出站报告“重组呼吸道合胞病毒蛋白疫苗研究”，范昌发，合作导师-梅兴国，博士后号19718，军事医学科学院博士后流动站)为模板，通过PCR扩增，获得目的基因片段。扩增产物经1.2％琼脂糖胶电泳分离，回收大小约为660bp的片段，纯化后4℃保存备用。5’端引物DsbA-F的序列为GCCCATGGGCAGCTCTCATCATCATCATCATCACTCTAGCGGTGCTCAGTACGAAGATGGTAAAC，其中下划线部分为Nco I位点，斜体部分为6组氨酸标签。3’端引物DsbA-R的序列为CGGGATCCACGCGGATACATGCTATCTTCATCTTCATCTTCATCACCTTTTTTCTCGGACAG，其中下划线部分为BamH I位点，粗体部分为凝血酶识别位点。扩增条件为预变性94℃2min后，94℃45s，60℃45s，72℃1min，共30个循环。
2.2G蛋白基因片段的获得本实施例共获得了三个G蛋白片段，命名为G101、G126和G151，分别对应于G蛋白基因的第125-225位、第100-225位和第75-225位氨基酸残基间的肽序列。PCR扩增所用5’端引物的名称和序列分别为G101-F5’-GCGGATCCAACCTGCAACCCACAACAG-3’，G126-F5’-GCGGATCCAGCTTCTCCAATCTGTCTGA-3’，G151-F5’-GCGGATCCATCATACAAGATGCAACAAGC-3’，其中下画线部分为BamH I位点。
所用3’端引物的名称和序列为Gx-R5’-GCGCGGCTAGCTACTTCCTTCGGTTTAGTGGT-3’其中下划线部分表示Nhe I位点。以G101-F/Gx-R、G126-F/Gx-R和G151-F/Gx-R引物对分别扩增G101、G126和G151。PCR扩增条件为预变性94℃2min后，94℃45s，55℃45s，72℃1min，共25个循环。扩增产物经琼脂糖胶电泳分离，回收大小约为300bp、380bp和450bp的片段，纯化后4℃保存备用。
2.3基因片段和表达载体的连接将DsbA基因用Nco I完全酶切，纯化后用BamH I完全酶切，G蛋白片段用BamH I和Nhe I双酶切，将表达载体pET以Nco I和Nhe I双酶切，然后对三者进行连接。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，挑选重组子提取质粒。将通过PCR和酶切确认含有目的基因的重组子进行测序，以检查阅读框架是否正确。最终获得表达载体pET-DsbA-G101、pET-DsbA-G126和pET-DsbA-G151，以及不含G蛋白基因片段的空白载体pET-DsbA，它将作为对照使用。
实施例3.诱导表达及检测将pET-DsbA-G101、pET-DsbA-G126、pET-DsbA-G151和pET-DsbA表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态菌。涂布有感受态菌的平板在37℃下培养11h左右，挑取单菌落接种于20ml LB培养基(附加葡萄糖至终浓度0.2％，氨苄青霉素至终浓度120μg/ml)，30℃培养至OD600约0.5，加诱导剂IPTG至终浓度100μg/ml，37℃下诱导1.5-3h。
吸取1ml菌液离心收集菌体，弃上清，以50μl PBS重悬，加2×SDS上样缓冲液，沸水浴8-10min，取适量裂解物走12％的SDS-PAGE电泳，以检测目的蛋白是否获得表达。pET-DsbA-G101的表达产物预期分子量为36.8kD，pET-DsbA-G126的表达产物预期分子量为39.8kD，pET-DsbA-G151的表达产物预期分子量为42.8kD，pET-DsbA的表达产物预期分子量为24.7kD。研究结果显示，所有表达载体均获得了表达，表达产物的大小与预期的分子量一致。经Gel-Pro IMAGER(美国Media Cybernetics公司)分析，表达产物含量达到很高水平，占总蛋白的14％-61％，目的蛋白的收率约为4-6mg/g菌体。
经过小样(20ml)表达测试确认表达的菌株，采用200ml摇瓶发酵确认表达产物是否可溶。按上述方法诱导表达，离心收集菌体，PBS约20ml悬浮菌体，冰浴中超声破碎，4℃下12000×g离心15min，取适量上清和沉淀分别走SDS-PAGE电泳检查。结果显示，表达产物主要以可溶形式存在，可溶部分为80％左右。
实施例4.分离纯化目的蛋白在1000ml三角瓶中发酵生长目的蛋白，培养物在4℃下8000×g离心收集菌体，按5μl/ml培养物的比例加入Start buffer重悬菌体，Start buffer为含有10mM咪唑，20mM磷酸盐和0.5M NaCl，pH7.4-7.6。菌体冻融三次，12000×g 4℃下离心15min，小心转移上清，0.45μl滤膜过滤，滤液用于纯化或者-20℃保存备用。
所用亲和层析介质为熬合金属Ni2+的凝胶(Pharmacia Biotech)，空柱为本室制备，柱床体积为3ml。上样体积为15ml，总蛋白含量约为36mg，流速为1ml/min。洗脱缓冲液含有300mM咪唑，20mM磷酸盐和0.5M NaCl，pH7.4-7.6，洗脱时流速为0.5ml/min。
含有目的蛋白的洗脱液用pH7.6的PBS平衡透析至无咪唑，然后冷冻干燥，溶于适量纯水中-20℃保存备用。最终获得目的蛋白的纯度为85％-98％，未发生降解。
实施例5.抗原的免疫反应性测试通过PEG沉淀法制备RSV 10倍浓缩抗原。方法是在3.5TCID50的RSV病毒液中加入NaCl至终浓度0.5M，PEG 8000至6％-10％，4℃下静置16h，12000×g 4℃下离心30min，弃上清，沉淀以适量PBS溶解，立即于-70℃保存备用。
所用实验动物为雄性新西兰大白兔，体重约2.5kg。初次免疫在背部多点注射2ml完全福氏佐剂-浓缩RSV混悬液，第三、五周再次背部皮下多点注射不完全福氏佐剂-浓缩RSV抗原混悬液2ml，以后间隔一周进行加强免疫，用不完全福氏佐剂。第七周耳静脉采血，测试效价后，以1ml不加佐剂的浓缩RSV抗原进行耳静脉注射，促进抗体合成，10天后耳动脉采血，获得抗血清30ml，于4℃保存备用。
通过双向免疫扩散实验测得抗血清效价为1∶64。同样通过双向免疫扩散实验检测发现，重组蛋白均能与抗血清形成明显的单一的沉淀线，表面重组蛋白具有良好的免疫反应性。
实施例6融合蛋白动物水平活性检测结果1.实验方法抗原蛋白DsbA-G101和DsbA-G126，小鼠昆明鼠和Balb/c，按对照组、实验组(不同剂量)分组，每组6只。选择了两个剂量，25ug和50ug，免疫了2组Balb/c和一组昆明鼠。
免疫过程中称重，以考察抗原蛋白的毒性。
30天后采血，病毒攻击；攻击后5天，处死取肺，检测其中RSV滴度。
血样用于分离血清，测针对抗原和RSV的抗体滴度。
2.结果(1)小鼠的体重考察结果分析初步分析显示，试验组和对照组(注射PBS)在体重上无差异。结合解剖后对各脏器的形态学观察，均未见异常。这表明抗原蛋白无明显的毒性。
(2)ELISA检测抗体以抗原蛋白包被酶标板，以免疫后的小鼠血清作为一抗，检测针对抗原蛋白的抗体滴度。多数血清样品以10倍和100倍稀释。结果发现，多数样品超过了读数范围，在抗体稀释4000倍后，OD492与对照血清(10倍稀释)的差值为1.3。表明产生了较高浓度的针对抗原蛋白的抗体。
以RSV提取液包被酶标板，检测产生的针对RSV的抗体。结果发现，减去对照组读数后，实验组的OD492最大值为0.881，最低为0.077。这一结果表明，至少部分小鼠产生了针对RSV的抗体。
(3)空斑抑制试验将Hep-2细胞接种于96孔细胞板，接种量为1.0～1.5×104/孔，37℃下培养17～24h，病毒样品稀释至500PFU/mL备用。将30μL以病毒维持液稀释的血清样品与等体积的RSV病毒样品混合，在37℃下结合1h，然后将病毒-血清混合物接种细胞，在37℃下吸附1.5h，然后，每孔加入200μL 0.8(w/v)的甲基纤维素。在5％的CO2培养箱中培养4天后在显微镜下(100×)统计病变数。
图5和图6显示了抗原蛋白能诱导产生针对RSV的抗体。
中和抗体滴度更能反应重组蛋白诱导产生的抗体对病毒的抑制作用。本研究采用空斑抑制实验在细胞水平检测抗体对病毒的抑制作用。将抗血清以病毒维持液作10倍稀释后，与已知滴度的病毒样品结合，然后将细胞-病毒混合物一起加载到单层Hep-2细胞上检测空斑的形成情况。如图所示，RSV抗血清阳性对照组能显著降低空斑的形成。即使在10倍稀释RSV抗血清的情况下，有很多孔甚至见不到空斑，表明对病毒的抑制作用非常明显。
3结论(1)抗原蛋白对小鼠无明显毒性，安全；(2)抗原蛋白能诱导产生较高浓度的抗体，免疫原性强。
(3)抗原蛋白能诱导产生针对RSV的抗体。
(4)诱导产生的抗体具有抑制RSV的能力。
实施例7.融合蛋白同时诱导小鼠产生中和抗体和CTL应答1.表达载体的构建构建过程中使用如下引物(划线部分为酶切位点)引物1CTL-F 5′-TTCGCGGGCGTTGTGC-3′；引物2CTL-R 5′-GAGCGGCTAGCAGCGCTCTGTTTGGTG-3′(Nhe I)；引物3Linker-F 5′-CGTAGCTTTAACTTTCCGATTCT-3′引物4Linker-R 5′-CATGCTGTTTTCCAGAATCGGAA-3′引物5G101-F 5′-GCGGATCCAACCTGCAACCCACAACAG-3′(BamHI)引物6G101-R 5′-TACTTCCTTCGGTTTAGTGGTTTGAGGTTTATGAT-3′载体构建分两步进行，首先将连接肽和CTL连接，获得中间载体pET-15b(LC)。用引物CTL-F和CTL-R从pUC18(CTL)中PCR扩增CTL基因片段，用Nhe I酶切备用。用EcoR I酶切pET-15b(DsbA)后用Klenow大片段补平，再用Nhe I酶切后与上述CTL基因片段和Linker基因进行连接，获得中间质粒pET(LC)。然后用引物G101-F和G101-R从pUC18(G10)中扩增G蛋白基因片段G101，用BamH I酶切。用引物Linker-F和CTL-R从pET(LC)扩增Linker-CTL片段，用Nhe I酶切。用BamH I和Nhe I双酶切pET(DsbA)后与上述两个片段进行连接，构建得到pET-15b(DsbA-GLC)表达载体。通过转化宿主细胞，表达得到融合蛋白DsbA-G101-Linker-F/M2。其结构见图7。
2.实验方法抗原蛋白为D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2(分别为重组蛋白DsbA-G101-F/M2和DsbA-G101-Linker-F/M2的简写，其中Linker代表连接肽，F/M2为CTL表位)。取重组蛋白30μg溶解在200μl PBS中，加佐剂Al(OH)3至终浓度0.4mg/200μl。以加佐剂的PBS作为对照。腹腔注射Balb/c小鼠200μl/只；每隔10天加强一次，共免疫3次，最后一次免疫后10天取血、肺和脾进行检测。用ELISA检测血清和肺组织中的抗体滴度，以空斑抑制实验测定血清中中和抗体滴度，以MTT法检测CTL应答反应。
3.结果图8～图11的结果表明重组蛋白D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2注射免疫小鼠后，在血清和肺组织中均诱导了高滴度的针对RSV和各自蛋白的抗体。经ELISA检测，D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2所诱导的抗体亚型IgG1/IgG2a的比值分别为1.85和2.66，可见D-G1-F/M2比D-G1-L-F/M2所诱导的免疫应答更为平衡。
图12的结果表明经重组蛋白D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2免疫后的小鼠在其血清中均可检测到较高滴度的抗RSV的中和抗体。
图13的结果表明以RSV病毒刺激增殖的效应细胞(重组蛋白免疫的小鼠的脾细胞)按不同的效靶比加入到RSV刺激的靶细胞(p815细胞)中后对靶细胞具有明显的杀伤作用，可见D-G1-F/M2和D-G1-L-F/M2均诱导了RSV特异性的CTL应答，其中D-G1-F/M2诱导CTL应答的能力更强。
实施例8.重组蛋白抗原对小鼠提供的保护作用1.实验方法抗原蛋白为D-G1和D-G2(分别为重组蛋白DsbA-G101和DsbA-G126的简写)。取重组蛋白50μg溶解在200μl PBS中，加佐剂Al(OH)3至终浓度0.4mg/200μl。以加佐剂的PBS作为对照。腹腔注射Balb/c小鼠200μl/只；每隔10天加强一次，共免疫3次，最后一次免疫后10天以104.95PFU/100μL的RSV进行鼻腔攻击。5天后处死小鼠取肺和鼻腔冲洗物(NTL)，同时收集血清。以空斑抑制实验测定血清抗体和NTL对RSV病毒的抑制作用。
2.结果图14的结果表明PBS和DsbA的血清抗体对病毒无抑制作用，其形成的空斑数与阴性对照组RSV组很接近。RSV阳性对照组能显著降低空斑的形成。实验组D-G1和D-G2的抗血清对病毒也表现出明显的抑制作用，其空斑抑制率可达60％左右。
图15的结果表明从重组蛋白D-G1和D-G2免疫的小鼠鼻腔收集的粘膜抗体也对RSV病毒具有明显的抑制作用。
表1中列出了用RSV攻击经各种重组蛋白抗原免疫的小鼠和对照小鼠后其肺和鼻腔冲洗物中的RSV滴度。
表1

由表1中的结果可看出，PBS和DsbA组在鼻腔和肺组织中均检测到较高滴度的病毒，而重组蛋白D-G1和D-G2免疫组均显著降低了鼻腔和肺组织中病毒的滴度。
实施例9.D-G1和D-F/M2共免疫1.实验方法抗原蛋白为D-G1和D-F/M2(分别为重组蛋白DsbA-G101和DsbA-F/M2的简写，其中F/M2代表CTL表位)。取重组蛋白50μg溶解在200μl PBS中，加佐剂Al(OH)3至终浓度0.4mg/200μl。以加佐剂的PBS作为对照。腹腔注射Balb/c小鼠200μl/只；每隔10天加强一次，共免疫3次，最后一次免疫后10天取血、肺和脾进行检测。用ELISA检测血清和肺组织中的抗体滴度，以空斑抑制实验测定血清中中和抗体滴度，以MTT法检测CTL应答反应。另外最后一次免疫后10天以104.95PFU/100μL的RSV进行鼻腔攻击。5天后处死小鼠取肺和鼻腔冲洗物(NTL)，同时收集血清。以空斑抑制实验测定血清抗体和NTL对RSV病毒的抑制作用。
2.结果图16的结果表明D-G1不能诱导明显的病毒特异性的CTL反应，单独的D-F/M2可以诱导产生病毒特异性的CTL反应。而经D-G1和D-F/M2共免疫可检测到更强的CTL活性。
图17的结果表明D-G1单独免疫以及D-G1和D-F/M2共免疫可以诱导产生高滴度的针对G1的IgG抗体，而且可以诱导产生较高滴度的针对RSV病毒的IgG抗体。
表2中显示了用RSV攻击经重组蛋白免疫的小鼠与对照小鼠后其肺和鼻腔冲洗物中的RSV滴度。
表2

由表2的结果可看出，单独的D-G1或D-F/M2免疫后可以显著降低肺组织和鼻腔中病毒的滴度；而经D-G1和D-F/M2共免疫后其病毒的清除作用加强。
除了上述实施例外，本发明还研究了其它分子内伴侣与G蛋白片段的组合CKS-G101、CKS-G126、CKS-G151、GST-G101、GST-G126、GST-G151、MBP-G101、MBP-G126和MBP-G151。它们在不同的载体中也获得表达，经测试也具有很好的免疫反应性。
表3RSVA亚型G蛋白的核酸序列

RSV A亚型G蛋白的氨基酸序列GANANMSKNKDQRTAKTLEKTWDTLNHLLFISSGLYKLNLKSIAQITLSILAMIISTSLIITAIIFIASANHKVTLTTAIIQDATSQIENTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDLKPQTTKPKEVPTTKPTEEPTINTTKTNITTTLLTNNTTGNPKLTSQMETFHSTSSEGNLSPSQVSTTSEHPSQPSSPPNTTRQ 303G101的核苷酸序列(303bp)AACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTAG101的氨基酸序列(101aa)NLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVG126的核苷酸序列(378bp)
AGCTTCTCCAATCTGTCTGAAATTACATCACAAACCACCACCATACTAGCTTCAACAACACCAGGAGTCAAGTCAAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTAG126的氨基酸序列(126aa)SFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVG151的核苷酸序列(453bp)ATCATACAAGATGCAACAAGCCAGATCGAGAACACAACCCCAACATACCTCACTCAGGATCCTCAGCTTGGAATCAGCTTCTCCAATCTGTCTGAAATTACATCACAAACCACCACCATACTAGCTTCAACAACACCAGGAGTCAAGTCAAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTAG151的氨基酸序列(151aa)IIQDATSQIENTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFH
FEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVCTL表位的序列(111bp)GGATCCTTCGCGGGCGTTGTGCTGGCCGGTGCGGCTCTGGGTGTTGCGGCTGCGGCACAGATCGAAAGCTACATCGGCAGCATTAACAACATCACCAAACAGAGCGCTAGCCTL表位的氨基酸序列(37aa)GSFAGVVLAGAALGVAAAAQIESYIGSINNITKQSASDsbA-G101的核苷酸序列(954bp)ATGGGCAGCTCTCATCATCATCATCATCACTCTAGCGGTGCTCAGTACGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAACCGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCCTTCTTCAGCCCGCATTCCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAAAAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATGGGTGGTGACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATGGCGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTACAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATCAACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGGCGTGGAACAGCTTCGTGGTGAAATCTCTGGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTGCAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTTGTTAACGGTAAATATCAGCTGAATCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGGATGTTTTTGTTCAGCAGTATGCTGATACAGTGAAATATCTGTCCGAGAAAAAAGGTGATGAAGATGAAGATGAAGATAGCATGTATCCGCGTGGATCCAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGC
AAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTADsbA-G101的氨基酸序列(318aa)MGSSHHHHHHSSGAQYEDGKQYTTLEKPVAGAPQVLEFFSFFSPHSYQFEEVLHISDNVKKKLPEGVKMTKYHVNFMGGDLGKDLTQAWAVAMALGVEDKVTVPLFEGVQKTQTIRSASDIRDVFINAGIKGEEYDAAWNSFVVKSLVAQQEKAAADVQLRGVPAMFVNGKYQLNPQGMDTSNMDVFVQQYADTVKYLSEKKGDEDEDEDSMYPRGSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVDsbA-G126的核苷酸序列(1029bp)ATGGGCAGCTCTCATCATCATCATCATCACTCTAGCGGTGCTCAGTACGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAACCGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCCTTCTTCAGCCCGCATTCCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAAAAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATGGGTGGTGACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATGGCGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTACAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATCAACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGGCGTGGAACAGCTTCGTGGTGAAATCTCTGGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTGCAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTT
GTTAACGGTAAATATCAGCTGAATCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGGATGTTTTTGTTCAGCAGTATGCTGATACAGTGAAATATCTGTCCGAGAAAAAAGGTGATGAAGATGAAGATGAAGATAGCATGTATCCGCGTGGATCCAGCTTCTCCAATCTGTCTGAAATTACATCACAAACCACCACCATACTAGCTTCAACAACACCAGGAGTCAAGTCAAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTADsbA-G126的氨基酸序列(343aa)MGSSHHHHHHSSGAQYEDGKQYTTLEKPVAGAPQVLEFFSFFSPHSYQFEEVLHISDNVKKKLPEGVKMTKYHVNFMGGDLGKDLTQAWAVAMALGVEDKVTVPLFEGVQKTQTIRSASDIRDVFINAGIKGEEYDAAWNSFVVKSLVAQQEKAAADVQLRGVPAMFVNGKYQLNPQGMDTSNMDVFVQQYADTVKYLSEKKGDEDEDEDSMYPRGSSFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVDsbA-G151的核苷酸序列(1104bp)ATGGGCAGCTCTCATCATCATCATCATCACTCTAGCGGTGCTCAGTACGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAACCGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCCTTCTTCAGCCCGCATTCCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAAAAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGAC
TAAATACCACGTCAACTTCATGGGTGGTGACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATGGCGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTACAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATCAACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGGCGTGGAACAGCTTCGTGGTGAAATCTCTGGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTGCAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTTGTTAACGGTAAATATCAGCTGAATCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGGATGTTTTTGTTCAGCAGTATGCTGATACAGTGAAATATCTGTCCGAGAAAAAAGGTGATGAAGATGAAGATGAAGATAGCATGTATCCGCGTGGATCCATCATACAAGATGCAACAAGCCAGATCGAGAACACAACCCCAACATACCTCACTCAGGATCCTCAGCTTGGAATCAGCTTCTCCAATCTGTCTGAAATTACATCACAAACCACCACCATACTAGCTTCAACAACACCAGGAGTCAAGTCAAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCTACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTADsbA-G151的氨基酸序列(368aa)MGSSHHHHHHSSGAQYEDGKQYTTLEKPVAGAPQVLEFFSFFSPHSYQFEEVLHISDNVKKKLPEGVKMTKYHVNFMGGDLGKDLTQAWAVAMALGVEDKVTVPLFEGVQKTQTIRSASDIRDVFINAGIKGEEYDAAWNSFVVKSLVAQQEKAAADVQLRGVPAMFVNGKYQLNPQGMDTSNMDVFVQQYADTVKYLSEKKGDEDEDEDSMYPRGSIIQDATSQIENTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILA
STTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVCKS-G101的核苷酸序列(1071bp)ATGAGTTTTGTGGTCATTATTCCCGCGCGCTACGCGTCCACGCGTCTGCCCGGTAAACCATTGGTTGATATTAACGGCAAACCCATGATTGTTCATGTTCTTGAACGCGCGCGTGAATCAGGTGCCGAGCGCATCATCGTGGCAACCGATCATGAGGATGTTGCCCGCGCCGTTGAAGCCGCTGGCGGTGAAGTATGTATGACGCGCGCCGATCATCAGTCAGGAACAGAACGTCTGGCGGAAGTTGTCGAAAAATGCGCATTCAGCGACGACACGGTGATCGTTAATGTGCAGGGTGATGAACCGATGATCCCTGCGACAATCATCCGTCAGGTTGCTGATAACCTCGCTCAGCGTCAGGTGGGTATGGCGACTCTGGCGGTGCCAATCCACAATGCGGAAGAAGCGTTTAACCCGAATGCGGTGAAAGTGGTTCTCGACGCTGAAGGGTATGCACTGTACTTCTCTCGCGCCACCATTCCTTGGGATCGTGATCGTTTTGCAGAAGGCCTTGAAACCGTTGGCGATAACTTCCTGCGTCATCTTGGTATTTATGGCTACCGTGCAGGCTTTATCCGTCGTTACGTCAACTGGCAGCCAAGTCCGTTAGAACACATCGAAACGTTAGAGCAGCTTCGTGTTCTGTGGTACGGCGAAAAAATCCATGTTGCTGTTGCTCAGGAAGTTCCTGGCACAGGTGTGGATACCCCTGAGGACGGTAGCATGCCAGACTCTCTCGAAGTTCTGTTTCAGGGTCCAGCAGGATCCAACCTGCAACCCACAACAGTCAAGACTAAAAACACAACAACAACCCAAACACAACCCAGCAAGCCCACTACAAAACAACGCCAAAACAAACCACCAAACAAACCCAATAATGATTTTCACTTCGAAGTGTTTAACTTTGTACCCTGCAGCATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACCACCAAGCCT
ACAAAAAAACCAACCTTCAAGACAACCAAAAAAGATCATAAACCTCAAACCACTAAACCGAAGGAAGTACKS-G101的氨基酸序列(357aa)MSFVVIIPARYASTRLPGKPLVDINGKPMIVHVLERARESGAERIIVATDHEDVARAVEAAGGEVCMTRADHQSGTERLAEVVEKCAFSDDTVIVNVQGDEPMIPATIIRQVADNLAQRQVGMATLAVPIHNAEEAFNPNAVKVVLDAEGYALYFSRATIPWDRDRFAEGLETVGDNFLRHLGIYGYRAGFIRRYVNWQPSPLEHIETLEQLRVLWYGEKIHVAVAQEVPGTGVDTPEDGSMPDSLEVLFQGPAGSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVCKS-G126的核苷酸序列(1146bp)ATGAGTTTTGTGGTCATTATTCCCGCGCGCTACGCGTCCACGCGTCTGCCCGGTAAACCATTGGTTGATATTAACGGCAAACCCATGATTGTTCATGTTCTTGAACGCGCGCGTGAATCAGGTGCCGAGCGCATCATCGTGGCAACCGATCATGAGGATGTTGCCCGCGCCGTTGAAGCCGCTGGCGGTGAAGTATGTATGACGCGCGCCGATCATCAGTCAGGAACAGAACGTCTGGCGGAAGTTGTCGAAAAATGCGCATTCAGCGACGACACGGTGATCGTTAATGTGCAGGGTGATGAACCGATGATCCCTGCGACAATCATCCGTCAGGTTGCTGATAACCTCGCTCAGCGTCAGGTGGGTATGGCGACTCTGGCGGTGCCAATCCACAATGCGGAAGAAGCGTTTAACCCGAATGCGGTGAAAGTGGTTCTCGACGCTGAAGGGTATGCACTGTACTTCTCTCGCGCCACCATTCCTTGGGATCGTGATCGTTTTGCAGAAGGCCTTGAAACCGTTGGCGATAACTTCCTGCGTCATCTTGGTATTTATGGCTACCGTGCAGGCTTTATCCGTCGTTACGTCAACTGGCAGCCAAGTCCGTTAGAACACATCGAAACGT
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权利要求
1.一种重组蛋白抗原，其中包含G蛋白片段，CTL表位和载体蛋白中的至少两种，所述G蛋白片段来源于RSV A或B亚型。
2.根据权利要求1的抗原，其特征在于G蛋白片段具有G蛋白的氨基酸序列中第m-n位氨基酸所示的序列，或其保留功能的变体，其中m是10-150之间的任何整数，n是180-300之间的任何整数；m优选是25-140，更优选是50-130，最优选是75-125，n优选是190-275，更优选是200-250，最优选是220-230，尤其是225；最优选G蛋白片段(FG)具有G蛋白的氨基酸序列中第75-225位、第100-225位或第125-225位氨基酸残基间的肽序列，或其保留功能的变体；或者具有与上述序列至少80％同源、优选至少90％同源、最优选至少95％同源的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的抗原，其特征在于CTL表位来自RSV A或B亚型的M2蛋白。
4.权利要求1的抗原，其特征在于载体蛋白选自热休克蛋白(HSPs)，牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、霍乱毒素亚单位CTB和TT蛋白，DsbA，CKS，GST或MBP，或其功能性片段。
5.权利要求1的抗原，其特征在于组成抗原的方式可以是由N端到C端为CP+FG+CTL，CP+CTL+FG，FG+CTL+CP，CTL+FG+CP，FG+CP+CTL，或CTL+CP+FG。
6.根据权利要求1的抗原，其特征在于组成抗原的方式可以是由N端到C端为CTL+FG，或者FG+CTL。
7.根据权利要求1的抗原，其特征在于组成抗原的方式可以是由N端到C端为CP+FG，或者FG+CP。
8.根据权利要求1的抗原，其特征在于组成抗原的方式可以是由N端到C端为CP+CTL，或者CTL+CP。
9.根据权利要求1和5-8中任一项的抗原，其特征在于载体蛋白、CTL表位和G蛋白片段间的连接是通过共价键方式偶联的。
10.根据权利要求1和5-8中任一项的抗原，其特征在于载体蛋白与G蛋白片段，载体蛋白和CTL，G蛋白片段和CTL之间的连接是通过化学偶联实现的。
11.根据权利要求1和5-8中任一项的抗原，其中载体蛋白和G蛋白片段之间、G蛋白片段和CTL表位之间，以及载体蛋白和CTL表位之间可以通过称为连接蛋白的短肽或者蛋白连接，连接蛋白优先选自存在于粘膜细胞表面的受体。
12.根据权利要求1的抗原，其选自下组DsbA-G101、DsbA-G126、DsbA-G101-F/M2和DsbA-G101-L-F/M2、CKS-G101、CKS-G126、CKS-G151、GST-G101、GST-G126、GST-G151、MBP-G101、MBP-G126和MBP-G151。
13.编码权利要求1-12中任一项所述抗原的核酸。
14.根据权利要求13的核酸，其特征在于它是RNA分子。
15.特异于权利要求1-12中任一项的抗原的抗体。
16.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1-12中任一项的抗原、权利要求13或14的核酸或者权利要求15的抗体。
17.一种诊断试剂盒，其特征在于至少含有权利要求1-12中任一项的抗原、权利要求13或14的核酸或者权利要求15的抗体。
18.权利要求1-12中任一项的抗原、权利要求13或14的核酸或者权利要求15的抗体在预防、诊断和治疗RSV感染中的用途。
19.含有权利要求13的核酸的重组表达载体。
20.转化了权利要求19所述的重组表达载体的宿主细胞。
21.根据权利要求20的宿主细胞，其特征在于它是原核细胞或者真核细胞。
22.获得权利要求1-12中任一项的抗原的方法，其特征在于培养权利要求20或21所述的宿主细胞，使其表达所述抗原，和从培养物中回收该抗原。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于抗原被表达、锚定并暴露在宿主细胞膜表面。
24.获得权利要求1-12中任一项的抗原的方法，其特征在于是通过DNA在体外表达获得的。
25.根据权利要求24的方法，其中所述体外表达方式可以是麦胚提取物翻译体系、网织细胞裂解物翻译体系或其它人工翻译体系。
全文摘要
本发明涉及可用于预防和诊断呼吸道合胞病毒(RSV)感染的重组蛋白抗原，及其特异性抗体。本发明所述抗原包含G蛋白片段，CTL表位和载体蛋白中的至少两种，所述G蛋白片段来源于RSV A或B亚型。
文档编号G01N33/563GK1814619SQ200510009119
公开日2006年8月9日 申请日期2005年2月3日 优先权日2004年2月3日
发明者梅兴国, 范昌发, 龚伟, 曾瑞红 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所