专利名称：一种猪流感灭活疫苗的效价测定方法
技术领域：
本发明一种疫苗效力的检验方法，特别涉及一种猪流感灭活疫苗的效价测定方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
猪流感(Swine Influenza, SI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种急性、高度接触传染性的猪呼吸道传染病。在临床上该病以突发性咳嗽、发热、呼吸困难、衰竭、迅速康复或死亡为特征。该病可发生于各年龄和各品种的猪，发病率可高达100%。SI不仅使患猪生产性能下降，肉料比降低，直接影响猪群健康状态，引起猪只死亡，而且猪流感病毒对猪呼吸道上皮细胞有高度的亲嗜性，感染后使猪体的呼吸道天然屏障被破坏，导致猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪胸膜肺炎放线菌等多种细菌或病毒的并发或继发感染，使疫情更为复杂和加重。另外，SI还是猪主要的免疫抑制性疾病之一，可造成人工、饲料和药物的巨大浪费，导致巨大的经济损失。使用灭活疫苗接种是控制猪流感的有效办法，然而目前国内尚无商品化的猪流感灭活疫苗，确定疫苗的效力检验方法是研制疫苗的关键技术。目前国内研究单位用于检验疫苗效力的方法有攻毒保护试验，该方法所需时间较长，可控性差，评价结果时常因使用的动物级别不同，检验结果也常有误差。无法快速、准确地确定猪流感疫苗的效价，已经成为研制猪流感疫苗的难点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪流感灭活疫苗的效价测定方法。本发明所采取的技术方案是
一种猪流感灭活疫苗的效价测定方法，包括如下步骤
1)使用猪流感灭活疫苗免疫猪，免疫后21 28日后采血分离血清；
2)去除血清中的非特异性成分,得到待检血清；
3)将猪流感灭活抗原稀释，配制浓度为4HA单位猪流感抗原稀释液；
4)将待检血清稀释，将血清稀释液与4HA单位猪流感抗原稀释液、红细胞混合，进行血凝抑制实验，以完全抑制4 HA单位猪流感抗原的血清最高稀释度为HI效价。优选的，所述方法包括如下步骤
1)使用猪流感灭活疫苗免疫猪，免疫后21 28日后采血分离血清；
2)将血清与受体破坏酶(RDE)混合，37°C水浴去除血清中非特异性成分；
3)将血清移至56°C水浴30min灭活残留的RDE，加入鸡红细胞，20 25°C下吸附血清中残余的非特异性成分；
4)将去除了非特异性成分的血清离心，取上清，上清即为待检血清；
5)将猪流感灭活抗原进行稀释，之后加入鸡红细胞悬液，在血凝板震荡均匀后于20 25°C下静置20 30 min,以红细胞完全凝集的最高稀释倍数为血凝价；、6)根据测得的血凝价配制浓度为4HA单位猪流感抗原稀释液；
7)将待检血清稀释，加入4HA单位猪流感抗原稀释液和鸡红细胞，同时设置阴性对照，进行血凝抑制实验，以完全抑制4 HA单位猪流感抗原的血清最高稀释度为HI效价。优选的，步骤3)中，加入鸡红细胞使血清中红细胞的体积浓度为5% 20%。优选的，步骤5)和7)中，鸡红细胞的体积浓度为1%。本发明的有益效果是
首先，本发明采用了测定经RDE处理的血清中红细胞凝集抑制效价的方法来评价疫苗的免疫效力。该方法大大缩短了测定时间，操作误差小，可控性强，批间差异小，同时也减少了用动物攻毒保护试验来检验效力时常常因为实验动物级别不同，检测结果常有的误差。 其次，本发明的红细胞凝集抑制效价的测定方法简便、快速、具有特异性强等特点，可用于疫苗免疫效力检验。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步说明本发明。猪血清的获得和预处理
1)用35日龄阴性(HI亚型流感HI抗体效价< 1:20)易感仔猪5头，各颈部肌肉分左右两点注射猪流感灭活疫苗(HlNl)3 ml，接种后21日，连同对照猪5头采血，分离血清；
2)为去除血清中非特异性成分,将血清与受体破坏酶(RDE)按I : 4的体积比例混匀，置于37°C水浴中作用16 18h后，移至56°C水浴30min灭活残留的RDE，取出后冷却；
3)加入浓的鸡红细胞，使其终浓度为5% 20%，在室温下吸附30min以去除其他非特异性成分；
4)然后低速离心(2000r/min)5 IOmin,吸取上清，即I: 5稀释的待测血清,备用。猪流感灭活疫苗(HlNl)红细胞凝集试验
1)取96孔V型微量血凝板，每孔加25W PBS,在第I孔加25W猪流感灭活抗原，反复抽打8 10次混匀，从第I孔吸取25W加入第2孔，混匀后吸取25W加入第3孔，如此进行2倍稀释至第11孔，第11孔吸取25W弃去；
2)每孔加入25^1%鸡红细胞悬液，将反应板在振荡器上震荡I 2min或轻扣反应板混合反应物，在室温(20 25°C)下静置20 30分钟；
3)在对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果，将反应板倾斜60度，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌(100%凝集)的最高稀释倍数为血凝价。4HA单位抗原的配制
1)根据测定的抗原血凝价，用PBS配制4HA单位抗原
2)将配置好的4HA单位抗原用PBS稀释，使其稀释度为I :2、I :3、I :4、I :5、I :6、I :7，在每一稀释度的25W抗原中加25 W PBS，再加入1%鸡红细胞悬液25 W，混匀，室温静置40min判结果。3) 如果I :4稀释为100%红细胞凝集终点，表明配制的是4HA单位抗原；如果100%红细胞凝集终点是I :5或I :6，表明配制的4HA单位抗原实际上是高于4个单位；如果100%红细胞凝集终点是I :2或I :3，表明配制的4HA单位抗原实际上是低于4个单位。应根据检验结果适当调整，使抗原工作液为4HA单位。
血凝抑制试验(HI):
1)取96孔V型微量反应板，第I 11孔加入25W PBS，第12孔加入50 W PBS ；
2)在第I孔加入25W待检血清，充分混匀后吸取25W于第2孔，依次2倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25W弃去，并在每块板上设标准阳性血清和阴性血清对照；
3)第I 11孔均加入25W 4HA单位的抗原，在室温静置30 min ；
4)每孔中加入25W 1% (V/V)鸡红细胞悬液，震荡混匀，在室温静置20 30 min,对照红细胞将呈钮扣状沉于孔底；
5)结果判定将反应板倾斜，凡血清反应孔与红细胞对照孔中红细胞以同样速度从 孔底流淌者判为血凝抑制，以完全抑制4HA单位抗原的血清最高稀释度作为HI效价。疫苗评价
以完全抑制4HA单位抗原的血清最高稀释度作为HI效价。若免疫后21日HI抗体免疫组至少有4/5猪只的HI效价不低于I : 160，对照组HI效价应不高于I :20，则判定疫苗合格。本发明方法可靠性的验证
取30头35日龄非免疫仔猪随机分成A、B、C共3组，10头/组，分别经颈部肌肉注射S0802批猪流感灭活疫苗(H1N1)，其中A组0. 3 ml/头，B组0. 5 ml/头，C组I ml/头，另取5头同日龄仔猪不免疫作空白对照；
免疫后21天，各组采集血液分离血清，按I :4的比例使用受体破坏酶(RDE)处理血清，用HI亚型猪流感灭活抗原测定HI效价，并根据HI抗体的高低将试验猪分成I、II JILIV共四组，其中I组的HI抗体效价< 1:40 ； II组的HI抗体效价=1 80 ;111组的HI抗体=1 160 ;IV组的HI抗体效价彡I :320。攻毒保护试验
上述I、II、III、IV共四组免疫猪连同5头同日龄抗体阴性猪(对照组)均用I :10倍稀释的HlNl亚型猪流感病毒SGDOl株进行攻毒，滴鼻和肌肉注射各I ml /头(约含5X 106_5EID5tl),攻毒后5日各组采集鼻拭子进行病毒分离，分别使用将每头猪采集的鼻拭子各放入装有Iml灭菌生理盐水(含有双抗)的塑料离心管中，4°C条件下静置3-4小时后，3000rpm离心后经尿囊腔接种9_11日龄SPF鸡胚5枚，每枚0. 2ml，35°C孵育观察72小时，测定鸡胚液血凝价，以5枚鸡胚中至少有I枚鸡胚的血凝价>1:8 (微量法)判为感染。以血凝价为阴性的鸡胚尿囊液盲传一次，判定方法同上。结果见表2。免疫后21日HI抗体情况
HlNl亚型猪流感疫苗S0802批以不同剂量免疫35日龄非免疫仔猪后21日的HI抗体情况见表I，结果表明HI抗体效价主要分布在I :80到I :160之间，约占60%。衣I,猪流感校衍CHIN! !Ml. SCiDOi株.)免疫Iim体分術情况
权利要求
1.一种猪流感灭活疫苗的效价测定方法，包括如下步骤 1)使用猪流感灭活疫苗免疫猪，免疫后21 28日后采血分离血清； 2)去除血清中的非特异性成分,得到待检血清； 3)将猪流感灭活抗原稀释，配制浓度为4HA单位猪流感抗原稀释液； 4)将待检血清稀释，将血清稀释液与4HA单位猪流感抗原稀释液、红细胞混合，进行血凝抑制实验，以完全抑制4 HA单位猪流感抗原的血清最高稀释度为HI效价。
2.根据权利要求I所述的猪流感灭活疫苗的效价测定方法，其特征在于所述方法包括如下步骤 1)使用猪流感灭活疫苗免疫猪，免疫后21 28日后采血分离血清； 2)将血清与受体破坏酶(RDE)混合，37°C水浴去除血清中非特异性成分； 3)将血清移至56°C水浴30min灭活残留的RDE，加入鸡红细胞，20 25°C下吸附血清中残余的非特异性成分； 4)将去除了非特异性成分的血清离心，取上清，上清即为待检血清； 5)将猪流感灭活抗原进行稀释，之后加入鸡红细胞悬液，在血凝板震荡均匀后于20 25°C下静置20 30 min,以红细胞完全凝集的最高稀释倍数为血凝价； 6)根据测得的血凝价配制浓度为4HA单位猪流感抗原稀释液； 7)将待检血清稀释，加入4HA单位猪流感抗原稀释液和鸡红细胞，同时设置阴性对照，进行血凝抑制实验，以完全抑制4 HA单位猪流感抗原的血清最高稀释度为HI效价。
3.根据权利要求2所述的猪流感灭活疫苗的效价测定方法，其特征在于步骤3)中，加入鸡红细胞使血清中红细胞的体积浓度为5% 20%。
4.根据权利要求2所述的猪流感灭活疫苗的效价测定方法，其特征在于步骤5)和7)中，鸡红细胞的体积浓度为1%。
全文摘要
本发明公开了一种猪流感灭活疫苗的效价测定方法，包括如下步骤使用猪流感灭活疫苗免疫猪，免疫后21～28日后采血分离血清；去除血清中的非特异性成分，得到待检血清；将猪流感灭活抗原稀释，配制浓度为4HA单位猪流感抗原稀释液；将待检血清作倍比稀释，依次加入4HA单位猪流感抗原稀释液、1%红细胞，进行血凝抑制实验，以完全抑制4HA单位猪流感抗原的血清最高稀释度为HI效价。该方法大大缩短了测定时间，操作误差小，可控性强，批间差异小，同时也减少了用动物攻毒保护试验来检验效力时常常因为实验动物级别不同，检测结果常有的误差。
文档编号G01N33/86GK102735853SQ201210186169
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月7日 优先权日2012年6月7日
发明者仇微红, 叶贺佳, 孙招金, 廖明, 李敏, 梁昭平, 王斌, 罗开健 申请人:华南农业大学, 广州市华南农大生物药品有限公司