牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供能对具有大范围的免疫表型的患者以高精度检查牙周病、并且能用自动化的机器进行高速处理的、血液试样中的针对牙周病原菌的抗体效价或抗体的检测试剂盒，适合用于该试剂盒的牙周病原菌抗原蛋白，以及使用该试剂盒的检测血液试样中的抗体效价或抗体的存在的方法，对牙龈卟啉单胞菌菌株进行分型的试剂盒。本发明公开了包含具有序列编号：1、3、9、15、19、31、41、43、63、65和67的氨基酸序列的一系列多肽的检测试剂盒，具有序列编号：67的氨基酸序列的改性多肽，以及测定从人身体中分离的血液试样中的针对牙周病原菌的抗体效价或抗体的存在的方法，该方法包括使该血液试样与上述一系列多肽接触的步骤。
【专利说明】牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，更详细地说，涉及适合于用机器自动化检测的包含特定的牙周病原菌抗原蛋白的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒、该试剂盒中使用的改性多肽、以及测定血液试样的针对牙周病原菌的抗体效价的方法。
【背景技术】
[0002]牙周病是因口腔细菌感染牙周组织而引发的细菌感染症。
[0003]在牙科临床的现场，将临床症状、口腔内照片、X光图像或牙周组织检查等临床检查的结果综合起来进行牙周病的诊断。这些检查中，口腔内照片和X光图像诊察是用视觉来评价牙周组织的形态变化，牙周组织检查是测定牙菌斑附着状况、牙周袋的深度、探诊时的出血或牙齿的松动度等各种临床项目来进行评价。因此，这些检查需要繁琐的操作，为了准确地诊断患者的牙周病病情，要求手术者有高超的技术。
[0004]S卩，根据情况的不同，会因手术者的熟练度而导致检查结果不同，甚至有可能导致对患者的诊断不同。此外，上述牙科临床检查中，虽然牙周病是细菌感染症，但并不是在牙周病原菌的“感染”水平上进行评价，而是在牙周组织的“形态上的变化”的水平上进行评价，可以说是由手术者主观地进行检查，一直以来对于从细菌学、免疫学的观点来看恰当、且不会因手术者的熟练度而导致检查结果产生差异的客观的牙周病检查方法都存在需求。
[0005]在这种状况下，建立了以针对牙周病原菌的血清抗体效价作为牙周病检查的指标的牙周病检查系统(非专利文献I)。该牙周病检查系统从由患者的指尖采集并分离的微量的血液来检查、定量针对牙周病原菌的“特异性抗体”，由此评价牙周病原菌的感染状态和牙周病的严重程度(炎症的状态)，能通过采用免疫学方法来客观且均一地评价牙周病的病情。
[0006]此外，该牙周病检查系统中，从由指尖采集的血液中分离血浆，将血浆试样邮递至检查机构，用检查机构测定针对牙周病原菌的IgG抗体效价，评价牙周病的严重程度后，通知各患者牙周病检查的结果(牙周病原菌血浆抗体效价检查)。因此，能对全科医师或家庭的牙周病检查实施辅助，并且通过一揽子收集并分析检查数据，也能利用庞大的数据来与病情进行关联。
[0007]另一方面，这种牙周病检查系统中，由于要处理大量的试样，因此要求自动进行高速处理。
[0008]这种检查系统中，试样(血液)中的针对作为检查对象的抗原的抗体的种类越多，则检查结果与牙周病的相关性越高，越能以良好的精度检查牙周病。此外，感染牙周病的人中，由于牙周病原菌和人的个体差异，导致识别的牙周病原菌抗原的种类不同，从这一点来看，也同样是作为检查对象的抗体的种类越多，越能以良好的精度检查牙周病。
[0009]然而，如果欲测定多种抗体的抗体效价，则难以进行试样的高速处理，不适合于用机器自动化检测。[0010]现在的抗体效价测定中使用的抗原是将牙銀卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)等牙周病原菌粉碎而配制成的溶液,是包含种类繁多的细菌蛋白(也包括LPS、膜脂)的混合物。因此，难以用机器来自动地高速处理大量的试样。
[0011]现有技术文献非专利文献
非专利文献1:工藤值英子、R山牙学会杂志、第28卷、第I号(2009) 1-14页。
【发明内容】
[0012]发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒、适合用于该试剂盒的牙周病原菌抗原蛋白、以及使用该试剂盒的检测血液试样的牙周病原菌血浆或血清抗体效价的方法，该试剂盒能涵盖由于变化的牙周病原菌的抗原性和检查对象的多样的免疫反应性而产生的多样的抗原抗体反应，能以高精度检查具有多样的免疫表型的广大范围内的患者的牙周病，并且能用自动化的机器进行高速处理。
[0013]用于解决技术问题的手段
基于该课题，本发明人对牙周病原菌蛋白的筛选进行了研究，该牙周病原菌蛋白即使种类少，也能涵盖多样的抗原抗体反应，能以良好的精度判定牙周病。其结果是，本发明人发现，特定的牙周病原菌蛋白的组合与从牙周病患者中分离的血液试样中的血浆抗体特异性地反应，通过选择性地使用这些细菌蛋白的组合，能涵盖多样的抗原抗体反应，能以良好的精度检测血液试样，并且能用自动化的机器进行高速处理，从而完成了本发明。
[0014]S卩，本发明提供:
[I]
牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其包含具有序列编号:1、3、9、15、19、31、41、43、63、65和67的氨基酸序列的一系列多肽。
[0015][2]
上述[I]所述的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其进一步包含具有序列编号:5和37的氨基酸序列的多肽。
[0016][3]
上述[I]或[2]所述的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其进一步包含具有序列编号:23、35和47的氨基酸序列的多肽。
[0017][4]
上述[I]?[3]中任一项所述的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其进一步包含具有序列编号:17的氨基酸序列的多肽。
[0018][5]
改性多肽，其具有序列编号:63的氨基酸序列。
[0019][6]
上述[5]所述的改性多肽，其包含由序列编号:64的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0020][7]
改性多肽，其具有序列编号:65的氨基酸序列。[0021][8]
上述[7]所述的改性多肽，其包含由序列编号:66的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0022][9]
改性多肽，其具有序列编号:67的氨基酸序列。
[0023][10]
上述[9]所述的改性多肽，其包含由序列编号:68的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0024][11]
改性多肽，其具有序列编号:141的氨基酸序列。
[0025][12]
上述[11]所述的改性多肽，其包含由序列编号:142的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0026][13]
改性多肽，其具有序列编号:145的氨基酸序列。
[0027][14]
上述[13]所述的改性多肽，其包含由序列编号:146的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0028][15]
牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其包含具有选自序列编号:1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、63、65、67、141、143、145、147、151、153 和 155 中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。
[0029][16]
上述[15]所述的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其中，所述多肽是具有选自序列编号:3、5、15、19、31、41、141和145中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。
[0030][17]
上述[15]所述的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其中，所述多肽是由选自序列编号:2、4、6、10、16、18、20、24、32、36、38、42、44、48、64、66、68、142、144、146、148、152、154和156中的一种或两种以上的多核苷酸序列编码的多肽。
[0031][18]
测定从人身体中分离的血液试样中的针对牙周病原菌的抗体效价的方法，该方法包括使该血液试样与牙周病原菌抗原多肽接触的步骤，该方法的特征在于，所述牙周病原菌抗原多肽是具有选自序列编号:1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、63、65、67、141、143、145、147、151、153和155中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。
[0032][19]
测定从人身体中分离的血液试样中的针对牙周病原菌的抗体的存在的方法，该方法包括使该血液试样与牙周病原菌抗原多肽接触的步骤，该方法的特征在于，所述牙周病原菌抗原多肽是具有选自序列编号:3、5、15、19、31、41、141和145中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。
[0033][20]
上述[19]所述的方法，其中，所述多肽是由选自序列编号:4、6、16、20、32、42、142和146中的一种或两种以上的多核苷酸序列编码的多肽。
[0034][21]牙龈卟啉单胞菌菌株的分型试剂盒，其包含具有选自序列编号:151、153和155中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。
[0035][22]
上述[21]所述的分型试剂盒，其中，所述多肽是由选自序列编号:152、154和156中的一种或两种以上的多核苷酸序列编码的多肽。
[0036][23]
多肽，其具有序列编号:151的氨基酸序列。
[0037][24]
上述[23]所述的多肽，其包含由序列编号:152的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0038][25]
多肽，其具有序列编号:153的氨基酸序列。
[0039][26]
上述[25]所述的多肽，其包含由序列编号:154的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0040][27]
多肽，其具有序列编号:155的氨基酸序列。
[0041][28]
上述[27]所述的多肽，其包含由序列编号:156的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0042]本发明的第一形态中，提供包含特定的抗原蛋白的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒。
[0043]本发明的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒是与从人身体中分离的少量的血液反应来测定血液试样(血浆或血清)的针对牙周病原菌的IgG抗体效价、从而检查对象的牙周病原菌感染的试剂盒，一般有:包括
(1)刺血针，该刺血针用于在对象身体上造成小的伤口来引起少量的出血
(2)毛细管，该毛细管用于采集该血液
(3)瓶子，该瓶子加入有包含特定的牙周病原菌抗原蛋白的溶液
(4)针筒，该针筒用于压缩该瓶子内部，从而从血液中分离血浆
(5)盖子，该盖子用于将该瓶子密闭
通过将用毛细管采集的血液与瓶子内的溶液混合，从而在血液试样中存在针对牙周病原菌的IgG抗体的情况下与瓶子内的抗原蛋白发生抗原抗体反应，通过测定免疫沉淀来检查牙周病原菌的感染的试剂盒；以及ELISA法中使用的试剂盒，该试剂盒是
(1)将抗原蛋白质固定化于进行固定化的96孔板中，
(2)将血液试样(血浆或血清)加入96孔板，进行抗原抗体反应，
(3)清洗96孔板后，加入抗人IgG二抗，进行抗原抗体反应，
(4)清洗96孔板后，进行因特异性结合的抗人IgG二抗的存在而导致的显色或发光反应，检测该信号；以及抗原固定化滤器法中使用的试剂盒，该试剂盒是
(1)将抗原蛋白固定化于滤器(生物素化等)，
(2)将血液试样(血浆或血清)加入滤器，在滤器中进行抗原抗体反应，
(3)清洗滤器后，加入抗人IgG二抗，进行抗原抗体反应，
(4)清洗滤器后，进行因特异性结合的抗人IgG二抗的存在而导致的显色或发光反应，检测该信号。
[0044]本发明的该形态的特征在于检测试剂盒中所包含的牙周病原菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原蛋白，其与牙周病患者所具有的针对牙周病原菌的抗体特异性地反应，并且与广大范围内的牙周病患者所具有的抗体反应。
[0045]即，本发明的牙周病原菌血浆或血清抗体血浆检测试剂盒中所包含的牙周病原菌抗原蛋白是具有选自序列表的序列编号:1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、141、143、145、147、151、153和155中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽，通过将这些抗原蛋白的一种或两种以上组合使用，能检测牙周病患者所具有的抗体的抗体效价和种类，能检查牙周病原菌的感染程度和感染类型。此外，虽然牙周病原菌的抗原蛋白和各牙周病患者的免疫表型(针对牙周病原菌的抗体的种类)存在个体差异，但通过将本发明的抗原蛋白组合使用，能涵盖广泛的免疫表型的牙周病患者。此外，能检出心血管或脑血管疾病的风险因素即牙周病原菌SU63株。
[0046]此外，本发明中使用的牙周病原菌抗原蛋白优选为由选自序列表的序列编号:2、4、6、10、16、18、20、24、32、36、38、42、44、48、142、144、146、148、152、154 和 156 中的一种或两种以上的核苷酸序列编码的多肽。
[0047]本发明的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒中所包含的牙周病原菌抗原蛋白更优选为具有选自序列表的序列编号:3、5、15、19、31、41、63和67中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽，优选为由选自序列编号:4、6、16、20、32、42、64和68中的一种或两种以上的多核苷酸序列编码的多肽。
[0048]本发明的第二形态中，提供所述牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒中使用的改性多肽。
[0049]本发明人在寻找适合用于抗体效价检测试剂盒的牙周病原菌抗原蛋白时发现，一部分抗原蛋白虽然与广大范围内的牙周病患者的抗体反应，但因为具有蛋白酶活性，所以会因其自体消化作用和其它抗原蛋白的分解作用而对检查造成阻碍。于是，本发明人通过基因工程方法制备了一种改性多肽，该改性多肽在维持这些抗原蛋白的抗原性的同时丧失了蛋白酶活性。
[0050]S卩，本发明的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒中使用的改性多肽是具有序列编号:63、65或67的氨基酸序列的多肽，是序列编号:51的野生型多肽的477或488位的半胱氨酸残基缺失、或置换成其它氨基酸残基、优选置换成丙氨酸残基的改性多肽(分别为序列编号:63和65)以及序列编号:57的野生型多肽的471位的半胱氨酸残基缺失、或置换成其它氨基酸残基、优选置换成丙氨酸残基的改性多肽(序列编号:67)。通过将这些改性多肽的一种或两种以上组合使用，特别能进行针对更广泛种类的牙周病原菌的抗体的检测。
[0051]本发明的第三形态中，提供测定从人身体中分离的血液试样中的针对牙周病原菌的抗体效价的方法，该方法包括使该血液试样与牙周病原菌抗原多肽接触的步骤，方法中使用的血液试样优选为从指尖毛细血管或静脉采集的血液、血清或血浆，牙周病原菌抗原多肽是具有选自序列编号:1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、63、65、67、141、143、145、147、151、153和155中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。牙周病原菌抗原多肽优选为具有选自序列编号:3、5、15、19、31、41、63和67中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。
[0052]本发明的该形态中的方法可适宜地用第一形态的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒来实施，优选可适宜地用牙周病原菌血浆抗体效价检测来实施。
[0053]还可以根据抗体效价来检测牙周病的发展程度(严重程度)。
[0054]本发明的第四形态中，提供牙龈卟啉单胞菌菌株的分型试剂盒，该试剂盒可对从人身体中分离的血液试样中存在的牙龈卟啉单胞菌菌株、特别是FDC381株和SU63株进行分型，能检查试样中是否存在任一种菌株。该试剂盒包含具有选自序列编号:151、153和155中的一种或两种氨基酸序列的多肽,多肽优选由选自序列编号:152、154和156中的一种或两种多核苷酸编码。
[0055]发明效果
通过本发明，可提供一种能高速且以高精度检查牙周病的牙周病检查试剂盒。此外，可提供一种能不依赖于手术者技术的熟练度来客观地检查牙周病的牙周病检查试剂盒。
[0056]此外，通过本发明的牙周病检查试剂盒的普及，全国的牙科医院都能用统一的方法来检查牙周病，此外，通过将所得的测定结果制成数据库，能制作或修订牙周病的判断标准和治疗方针。
[0057]本发明的牙周病检查试剂盒还能检出心血管或脑血管疾病的风险因素。
【专利附图】
【附图说明】
[0058][图1]是表示牙周病原菌抗原蛋白对人血清的抗原抗体反应的图。A:对健康人血清的抗原抗体反应，B和C:对牙周病患者血清的抗原抗体反应。
[0059][图2]是用抗体柱粗纯化的牙龈卟啉单胞菌FDC381菌株抗原蛋白的SDS-PAGE电泳图。泳道A:由健康人血清柱粗纯化的抗原蛋白，泳道B:由患者血清I柱粗纯化的抗原蛋白，泳道C:由患者血清2粗纯化的抗原蛋白。
[0060][图3]是表示粗纯化的FDC381菌株抗原蛋白与血清的抗原抗体反应的图。泳道A:由健康人血清柱粗纯化的抗原蛋白，泳道B:由患者血清I柱粗纯化的抗原蛋白，泳道C:由患者血清2柱粗纯化的抗原蛋白。
[0061][图4]是用抗体柱粗纯化的牙龈卟啉单胞菌SU63菌株抗原蛋白的SDS-PAGE电泳图。泳道A:由健康人血清柱粗纯化的抗原蛋白，泳道B:由患者血清I柱粗纯化的抗原蛋白，泳道C:由患者血清2柱粗纯化的抗原蛋白。
[0062][图5]是表示粗纯化的SU63菌株抗原蛋白与血清的抗原抗体反应的图。泳道A:由健康人血清柱粗纯化的抗原蛋白，泳道B:由患者血清I柱粗纯化的抗原蛋白，泳道C:由患者血清2柱粗纯化的抗原蛋白。
[0063][图6]是表示抗原蛋白的Mascot检索结果的图。
[0064][图7]是表示鉴定出的抗原蛋白的基因信息和筛选结果的图。
[0065][图8]是表示血清与合成抗原蛋白的抗原抗体反应的图。
[0066][图9]是表示血清与合成抗原蛋白的抗原抗体反应信号值的图。
[0067][图10]是表示合成抗原蛋白的稳定性的SDS-PAGE电泳图。
[0068][图11]是表不健康人血清与合成抗原蛋白的抗原抗体反应信号值的图。
[0069][图12]是表示各种患者血清与抗原蛋白的抗原抗体反应信号值的图。[0070][图13]是概括各种患者血清与抗原蛋白的抗原抗体反应的图。
[0071][图14]是表示改性多肽的稳定性和抗原性的图。
[0072][图15]是表示血清与合成抗原蛋白的抗原抗体反应的图。
[0073][图16]是表示血清与合成抗原蛋白的抗原抗体反应信号值的图。
[0074][图17]是概括各种血清与抗原蛋白的抗原抗体反应的图。
[0075][图18]是表不健康人和患者血清与抗原蛋白的抗原抗体反应彳目号平均值和S/N 值的图。
[0076][图19]是表示关于针对各种抗原蛋白的各血清的信号值而求得的R0C曲线和 AUC值的图。
[0077][图20]是表示血清与各种抗原蛋白（SU63株)的抗原抗体反应的图。
[0078][图21]是概括血清与抗原蛋白（SU63株）的抗原抗体反应的图。
【具体实施方式】
[0079]以下基于实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不限定于这些实施例。
[0080]在所有本实施例中都使用牙銀卩卜啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis)FDC381 菌株和SU63菌株作为牙周病原菌。FDC381菌株由住商医药国际（住商— >夕一 t '> 3 t )株式会社售卖，SU63菌株可作为II型或IV型菌毛保有株获得。
[0081]抗体柱的制备
在人感染牙周病原菌时，人身体内通过免疫反应而产生针对牙周病原菌的抗原的多种 抗体。这里产生的抗体所识别的抗原因个体的免疫反应的差异而不同。
[0082]因此，考察了在牙周病原菌的抗原制备液的组成中是何种抗原成为抗体的靶点， 基于其结果来筛选用于纯化更多的抗原的血清。
[0083]抗原蛋白的制备
将牙龈卟啉单胞菌（FDC381株和SU63株）超声波粉碎，回收超离心后的上清组分，向 所得抗原制备液（株式会社特殊免疫研究所、200 ii g蛋白质当量）中加入磷酸缓冲生理盐 水（PBS)，使其达到270iU。向其中加入三氯乙酸，在冰中静置后，在低温下进行离心，除去 上清。向该沉淀中加入冰冷乙醇进行清洗，再次在低温下进行离心后，除去上清。然后进行 上述操作2次。风干后，加入添加有0. 06%的十二烷基硫酸钠（SDS)的PBS 120 u 1，将沉 淀溶解，针对各菌株分别配制抗原蛋白溶液。
[0084]抗原蛋白的定量
在96孔板的孔中分别加入配制的标准物（浓度：1000、500、250、125、62. 5或31. 25ng/ U l)25iU、用PBS稀释的抗原蛋白溶液25 ill、作为对照的PBS 25 yl，接着在各孔中加入 蛋白质工作液（以Thermo scientific, Reagent A:B=50:1的用量混合）200 ii 1。接着，用 摇床搅 拌反应液，在恒温恒湿机内于37°C孵育30分钟后，用酶标仪（Intermed，NJ2000)测 定577nm的吸光度，对收集的抗原蛋白进行定量。
[0085]SDS-PAGE 电泳
对于经定量的牙龈卟啉单胞菌（FDC381菌株和SU63菌株）抗原蛋白，用各试样缓冲液 (Invitrogen)配制成蛋白质浓度400ng/ u 1。将配制的试样热变性后，供于SDS-PAGE电泳 (蛋白质溶液5iU)。[0086]对于SDS-PAGE电泳后的凝胶,用iBlot干式转印系统(Invitrogen)在聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)上进行转印。
[0087]转印至PVDF膜后，将电泳后的布局(layout)(分子量标准、FDC381株、SU63株)作为一组切出。对于切出的一组狭条(slit)进行丽春红染色，确认蛋白质的转印。对于其余的狭条，加入Falcon管中，浸溃于封闭溶液(添加有3%的脱脂牛奶和0.1%的TWeen20的Tris缓冲生理盐水(下称“TBS”))中。
[0088]使用血清的抗原抗体反应
对于封闭后的狭条，除去封闭溶液后，加入血清反应液(在添加有3%的脱脂牛奶的TBS 20ml中加入从健康人或牙周病患者米集的血清8μ I而得的溶液)，在室温下振汤。接着，用添加有0.05%的Tween20的TBS清洗狭条。清洗后，加入5000倍稀释的结合有辣根过氧化物酶的山羊抗人IgG抗体反应液(在添加有3%的脱脂牛奶的TBS中加入抗人二抗(CHEMIC0N)而得的溶液)，在室温下振荡。接着，用添加有0.05%的Tween20的TBS清洗狭条。清洗后，将狭条浸溃于含有0.61mg/mL的4-甲氧基-1-萘酚和0.018%的过氧化氢水的TBS，确认显色后，用纯水清洗，进行干燥。
[0089]抗原蛋白与人血清的反应结果示于图1。
[0090]与健康人血清的抗原抗体反应中，几乎未观察到信号(图1A:健康人对象血清)。
[0091]另一方面，与牙周病患者血清的抗原抗体反应中，观察到明确的信号，其图样多种多样(图1B和图1C)。此外，在与患者血清的抗原抗体反应中观察到的多样的信号大致可分为两类。即，分为显示出明确的条带的信号(图1B)和显示出整体扩散的模糊的信号(图1C)。多样的抗原抗体反应图样是基于它们的大小的不同和对菌株的特异性的不同而形成的。
[0092]然后，如下所示大小的信号能在多数患者的血清中特异性地强烈观察到。 46kDa(FDC381菌株和SU63菌株的抗原蛋白)
25-37kDa (FDC381菌株和SU63菌株的抗原蛋白)
100-1 IOkDa (FDC381菌株和SU63菌株的抗原蛋白)
57kDa(SU63菌株的抗原蛋白)
150-250kDa(SU63菌株的抗原蛋白)。
[0093]由使用牙周病患者血清的抗原抗体反应的结果可见，大致可以观察到两种信号图样(明确的条带和整体扩散的模糊)，通过它们的组合(大小、菌株)而形成多样的抗原抗体反应图样。即，这就表示,牙龈卟啉单胞菌感染症产生的抗体多种多样,有时用某种血清能作为抗原蛋白识别、而用另一血清则完全无法识别。这与多样的牙周病患者血清中所含的抗体以多样的蛋白质作为抗原这一报道不矛盾。因此表明，为了通过抗体效价来测定牙龈卟啉单胞菌的感染，需要多样的检测抗原蛋白。
[0094]此外，将FDC381菌株和SU63菌株中共有的抗原蛋白用于检查时，认为菌株的鉴定困难。另一方面，如果仅将对菌株有特异性的抗原蛋白用于检查，则该检查中显示出阳性的情况下，怀疑是该菌株的感染。
[0095]患者血清中观察到的抗原抗体反应图样多种多样，但在初诊患者(FV)和维护患者(SPT)的图样中未观察到显著的差别。因此，鉴定在患者血清中显示出强信号的抗原蛋白，将其作为检查中使用的抗原的候选。[0096]作为对于多数患者血清显示出强信号的条带，如结果所示，可例举46kDa、25-37kDa、100-110kDa、57kDa和150_250kDa的抗原蛋白组。于是，考察了这些蛋白组对于
各种患者的血清有无抗原性。其结果示于表I。
[0097][表 I]
【权利要求】
1.牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其包含具有序列编号:.1、3、9、15、19、31、41、43、63、65和67的氨基酸序列的一系列多肽。
2.权利要求1所述的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其进一步包含具有序列编号:5和37的氨基酸序列的多肽。
3.权利要求1或2所述的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其进一步包含具有序列编号:23、35和47的氨基酸序列的多肽。
4.权利要求1-3中任一项所述的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其进一步包含具有序列编号:17的氨基酸序列的多肽。
5.改性多肽，其具有序列编号:63的氨基酸序列。
6.权利要求5所述的改性多肽,其包含由序列编号:64的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
7.改性多肽，其具有序列编号:65的氨基酸序列。
8.权利要求7所述的改性多肽，其包含由序列编号:66的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
9.改性多肽，其具有序列编号:67的氨基酸序列。
10.权利要求9所述的改性多肽，其包含由序列编号:68的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
11.改性多肽，其具有序列编号:141的氨基酸序列。
12.权利要求11所述的改性多肽，其包含由序列编号:142的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
13.改性多肽，其具有序列编号:145的氨基酸序列。
14.权利要求13所述的改性多肽，其包含由序列编号:146的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
15.牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其包含具有选自序列编号:.1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、63、65、67、141、143、145、147、151、153 和 155 中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。
16.权利要求15所述的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其中，所述多肽是具有选自序列编号:3、5、15、19、31、41、141和145中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。
17.权利要求15所述的牙周病原菌血浆或血清抗体效价检测试剂盒，其中，所述多肽是由选自序列编号:.2、4、6、10、16、18、20、24、32、36、38、42、44、48、64、66、68、142、144、146、148、152、154和156中的一种或两种以上的多核苷酸序列编码的多肽。
18.测定从人身体中分离的血液试样中的针对牙周病原菌的抗体效价的方法，该方法包括使该血液试样与牙周病原菌抗原多肽接触的步骤，该方法的特征在于，所述牙周病原菌抗原多肽是具有选自序列编号:.1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、63、65、67、141、143、145、147、151、153和155中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。
19.测定从人身体中分离的血液试样中的针对牙周病原菌的抗体的存在的方法，该方法包括使该血液试样与牙周病原菌抗原多肽接触的步骤，该方法的特征在于，所述牙周病原菌抗原多肽是具有选自序列编号:3、5、15、19、31、41、141和145中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。
20.权利要求19所述的方法，其中，所述多肽是由选自序列编号:.4、6、16、20、32、42、142和146中的一种或两种以上的多核苷酸序列编码的多肽。
21.牙龈卟啉单胞菌菌株的分型试剂盒，其包含具有选自序列编号:151、153和155中的一种或两种以上的氨基酸序列的多肽。
22.权利要求21所述的分型试剂盒，其中，所述多肽是由选自序列编号:.152、154和156中的一种或两种以上的多核苷酸序列编码的多肽。
23.多肽，其具有序列编号:151的氨基酸序列。
24.权利要求23所述的多肽，其包含由序列编号其包含由序列编号:152的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
25.多肽，其具有序列编号:153的氨基酸序列。
26.权利要求25所述的多肽，其包含由序列编号154的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
27.多肽，其具有序列编号:155的氨基酸序列。
28.权利要求27所述的多肽，其包含由序列号156的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
【文档编号】G01N33/569GK103443627SQ201180067623
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2011年10月18日 优先权日:2010年12月15日
【发明者】野添干雄 申请人:新时代株式会社