专利名称：高效价抗体生产的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及用于在细胞培养物中生产大量蛋白质例如抗体的方法；以及该细胞培养物自身。
背景技术：
培养用于治疗性蛋白质商业生产的细胞是一个昂贵的过程。所需设备费用昂贵并且研发及生产成本高昂。开发使每升细胞培养物生产的治疗性蛋白质的量最大化的细胞培养方法将会使生产给定量蛋白质所需的资源最少化。因此，期望使用商业上可行的生产大量蛋白质的方法。在标准的培养条件下，许多天然存在的细胞并不产生大量的期望蛋白质。相反地， 必须进行广泛的会诱使培养中的细胞产生大量治疗性蛋白质的细胞培养方法的研发。通常，鉴定最佳的细胞培养条件是困难的并且需要大量的创造性投入。发明概述本发明一般地提供了用于通过利用各种培养添加物以及对培养条件的其它改变， 从培养中的细胞产生大量蛋白质的方法和组合物。本发明提供了用于生产蛋白质的方法，包括用表达该蛋白质的宿主细胞接种初始哺乳动物细胞生长培养基并加入任选地处于接近所示浓度(不包括来自其它来源例如来自初始哺乳动物细胞培养基的每种成分的量)的添加物，所述添加物包括如下所列的那些
硫酸腺嘌呤: 腺苷 机酸铵 生物素
1.632 mg/L 17.6 mg/L 0.00078 mg/L 0.28 mg/L氯化胆碱
氯化钴(Cobalt chloride):
硫酸铜
胞苷
D-泛酸钙
盐酸乙醇胺
黄素腺嘌呤二核苷酸
叶酸
甘氨酸
鸟苷
次黄嘌呤
i-肌醇(i-Inositol) L-丙氨酸 L-精氨酸 L-天冬酰胺 天冬氨酸 L-瓜氨酸 L-半胱氨酸盐酸盐 L-胱氨酸 L-谷氨酸 L-组氨酸硫辛酸 L-异亮氨酸 L-亮氨酸 L-赖氨酸 L-曱硫氨酸 L-鸟氨酸盐酸盐 L-苯丙氨酸 L-脯氨酸 L-丝氨酸 L-苏氨酸 L-色氨酸
50.2 mg/L 0.0025 mg/L 0.0032 mg/L 17.6 mg/L 23.8 mg/L 4.4 mg/L 0.05 mg/L 4.6 mg/L 72 mg/L 17.6 mg/L 11.8 mg/L 73.2 mg/L 8.9 mg/L 312.4 mg/L 842 mg/L 97.6 mg/L 12.6 mg/L 224 mg/L 34 mg/L 155.4 mg/L 167 mg/L 0.52 mg/L 422 mg/L 384 mg/L 365 mg/L 147.2 mg/L 25.6 mg/L 207 mg/L 239 mg/L 281 mg/L 211.6 mg/L 109.2 mg/LL-酪氨酸 L-缬氨酸
四7K合氯化铩(Manganese chloride tetrahydrate):
烟酸
六水合二氯化镍 孕酮
二盐酸腐胺 盐酸吡哆素 核黄素 无水钼酸钠 磷酸二氢钠 亚石西酸钠 盐酸破υ胺素 胸苷
无水氯化锡(Tin chloride dehydrate): 尿苷
维生素B12: 维生素Ε: 硫酸锌 葡萄糖
234 mg/L 308.8 mg/L
0.0003 mg/L 31.4 mg/L 0.0004 mg/L 0.015 mg/L 0.4 mg/L 3 mg/L 1.86 mg/L 0.00016 mg/L 288.2 mg/L 0.01426 mg/L 16 mg/L 7.8 mg/L
0.00008 mg/L 17.6 mg/L
3.4mg/L 0.376 mg/L 1.08 mg/L
1.5g/L 150 mg/L
L-谷氛酰胺在本发明的一个实施方案中，一些添加物是从包含以约如下浓度存在的氨基酸的氨基酸进料(feed)储液(例如50X储液)加入的
L-精氨酸 L-胱氨酸 L-组數酸 L-异亮氨酸: L-亮氨酸
6.32 g/L 1.7 g/L 2.1 g/L 2.6 g/L 2.6 g/L
L-赖氨酸3.6 g/LL-甲疏氨酸0.76 g/LL-苯丙氨酸1.65 g/LL-苏氨酸2.38 g/LL-色氨酸0.51 g/LL-酪氨酸1.8 g/LL-缬氨酸2.34 g/L
在本发明的一个实施方案中，每升培养物加入约20ml氨基酸进料储液。在本发明的一个实施方案中，下列添加物是从包含以约如下浓度存在的氨基酸的氨基酸进料储液(例如100X储液)加入的
L-丙氨酸0.89 g/LL-天冬酰胺1.5 g/LL-天冬氨酸1.33 g/LL-谷氨酸1.47 g/L甘氨酸0.75 g/LL-脯氛酸1.15 g/LL-丝氨酸1.05 g/L
在本发明的一个实施方案中，以每升培养物加入约IOml氨基酸进料来加入氨基酸进料储液。在本发明的一个实施方案中，一些添加物是从包含以约如下浓度存在的添加物的营养物进料储液(例如50X储液)加入的
L-天冬酰胺40.6 g/LL-脯氨酸10.81 g/LL-异亮氨酸18.53 g/LL-半胱氨酸盐酸盐11.19 g/LL-亮氨酸16.58 g/LL-苏氨酸8.2 g/LL-酪氨酸9.9 g/L7.13 X ΙΟ-4 g/L 0.0816 g/L 0.88 g/L 0.88 g/L 0.88 g/L 0.88 g/L 0.59 g/L
L-精氨酸9.29 g/LL-天冬氨酸3.56 g/LL-谷氨酸6.28 g/L甘氨酸2.83 g/LL-组氨酸6.23 g/LL-甲较κ氨酸6.58 g/LL-色氨酸4.93 g/LL-赖氨酸14.66 g/LL-苯丙氨酸8.64 g/LL-缬氨酸13.08 g/LL-丝氨酸13 g/L磷酸二氢钠14.41 g/L硫酸锌0.054 g/L疏酸铜0.00016 g/L钒酸铵0.000039 g/L氯化钴0.000125 g/L六水合二氯化镍0.00002 g/L无水钼酸钠0.000008 g/L无水氯化锡0.000004 g/L四水合氯化锰0.000015 g/L在本发明的一个实施方案中，每升培养物加入约20ml营养物进料储液。在本发明的一个实施方案中，一些添加物是从包含以约如下浓度存在的添加物的维生素/盐进料储液(例如50X储液)加入的
亚石西酸钠
疏酸腺嘌呤:
腺苷
胞苷
鸟苷
尿苷
次黄嘌呤
L-瓜氨酸0.63 g/LL-鸟氨酸盐酸盐1.28 g/L生物素0.014 g/L黄素腺嘌呤二核苷酸0.0025 g/L叶酸0.23 g/L硫辛酸0.026 g/L烟酸1.57 g/L盐酸吡哆素0.15 g/L核黄素0.093 g/L盐酸硫胺素0.8 g/L维生素E:0.0188 g/L维生素B12:0.17 g/L氯化胆碱2.51 g/L盐酸乙醇胺0.22 g/Li-肌醇3.66 g/L胸苷0.39 g/L二盐酸腐胺0.02 g/L孕酮0.00075 g/LD-泛酸钙1.19 g/L在本发明的一个实施方案中，每升培养物加入约20ml维生素/盐进料。在本发明的一个实施方案中，该方法进一步包括从细胞收获培养基；其中所述蛋白质由所述细胞分泌至培养基中。例如，在本发明的一个实施方案中，在细胞生存力低于约60%时，从细胞收获培养基。可例如通过对培养基进行离心和/或对培养基进行深层过滤(cbpth filtering)和/或经0. 2微米过滤器对培养基进行过滤而从细胞收获培养基。使用本发明方法表达的蛋白质可以是任何蛋白质，例如，抗体或其抗原结合片段，例如特异性结合 IGFlR的抗体或其抗原结合片段，例如其中该抗体或片段包含含有示于选自SEQ ID NOs 1、3，-6,13,21和26的成员的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；或其成熟片段或来自其的一个或更多个⑶Rs ；和含有选自SEQ ID NOs :2、7_9、17和25的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链，或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs ；例如，其中该抗体或片段是完整抗体，其包含含有 SEQ ID NO :3、4、5或6的氨基酸20-128的轻链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO :8或9的氨基酸20-137的重链免疫球蛋白，例如其中轻链免疫球蛋白连接于κ免疫球蛋白恒定链并且重链免疫球蛋白连接于Y-I免疫球蛋白恒定链。在本发明的一个实施方案中，加入了添加物的初始哺乳动物细胞生长培养基包含HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、非必需氨基酸、 重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分。本发明在其范围中包括用于生产抗体(例如单克隆、重组和/或全人抗体)的方法，包括用表达抗体轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白的CHO DXBll宿主细胞接种预热至约37°C的初始哺乳动物细胞生长培养基至约2. 5-5X IO5个细胞/ml的细胞密度；该培养基包含HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、非必需氨基酸、重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且其不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分；并且，在所述接种前、 同时或之后立即在培养基中加入下列添加物大豆水解物至约10g/L的终浓度；以及，任选地，加入氨基酸至约下列终浓度(不包括来自其它来源例如初始哺乳动物细胞生长培养基的所述氨基酸的量)
L-精氨酸126.4 mg/LL-胱氨酸34 mg/LL-组氨酸42 mg/LL-异亮氨酸52 mg/LL-亮氨酸52 mg/LL-赖氨酸72 mg/LL-曱破氨酸15.2 mg/LL-苯丙氨酸33 mg/LL-苏氨酸47.6 mg/LL-色氨酸·.10.2 mg/LL-酪氨酸36 mg/LL-缬氨酸46.8 mg/LL-丙氨酸8.9 mg/LL-天冬酰胺30 mg/LL-天冬氨酸26.6 mg/LL-谷氨酸29.4 mg/L甘氨酸15 mg/LL-脯氨酸23 mg/LL-丝氨酸21 mg/L；并且，在活细胞密度达到超过约1.2X IO6个细胞/ml时，加入添加物进料，其中来自所述添加物进料的成分(不包括来自其它进料的每种成分的量)达到大约如下所列的最终培养物浓度
亚石西酸钠0.01426 mg/L疏酸腺嘌呤1.632 mg/L腺苷17.6 mg/L胞苷17.6 mg/L鸟苷17.6 mg/L尿苷17.6 mg/L次黄嘌呤11.8 mg/LL-瓜氨酸12.6 mg/LL-鸟氨酸盐酸盐25.6 mg/L生物素0.28 mg/L黄素腺嘌呤二核苷酸0.05 mg/L叶酸4.6 mg/L硫辛酸0.52 mg/L烟酸31.4 mg/L盐酸吡哆素3 mg/L核黄素1.86 mg/L盐酸疏胺素16 mg/L维生素E:0.376 mg/L维生素B12:3.4 mg/L氯化胆碱50.2 mg/L盐酸乙醇胺4.4 mg/Li-肌醇73.2 mg/L胸苷7.8 mg/L二盐酸腐胺0.4 mg/L孕酮0.015 mg/LD-泛酸钙23.8 mg/LL-天冬酰胺812 mg/LL-脯氨酸216 mg/LL-异亮氨酸370 mg/LL-半胱氨酸盐酸盐224 mg/LL-亮氨酸332 mg/LL-苏氨酸164 mg/LL-酪氨酸198 mg/LL-精氨酸186 mg/LL-天冬氨酸71 mg/LL-谷氨酸126 mg/L甘氨酸57 mg/LL-组氨酸125 mg/LL-曱硫氨酸132 mg/LL-色氨酸99 mg/LL-赖氨酸293 mg/LL-苯丙氣酸174 mg/LL-缬氨酸262 mg/LL-丝氨酸260 mg/L磷酸二氢钠288.2 mg/L硫酸锌1.08 mg/L疏酸铜0.0032 mg/L钒酸铵0.00078 mg/L氯化钴0.0025 mg/L六水合二氯化镍0.0004 mg/L无水钼酸钠0.00016 mg/L；并且，在细胞生长期间，在葡萄糖水平降至低于约1. 5g/L时在培养基中加入葡萄糖并且在L-谷氨酰胺水平降至低于约150mg/L时加入L-谷氨酰胺；并且在细胞生长期间，维持O2浓度处于约60% ；pH处于约6. 8 士0. 02且温度处于约36. 5°C 士0. 5°C。在本发明的一个实施方案中，抗体包含含有示于选自SEQ ID NOs :1、3，-6、13、21和26的成员的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs ；和含有选自SEQ ID NOs :2、7_9、17和25的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链，或其成熟片段或来自其的一个或更多个⑶Rs，例如其中抗体包含含有SEQ ID N0:3、4、5或6的氨基酸20-128的轻链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO :8或9的氨基酸20-137的重链免疫球蛋白。例如，在本发明的一个实施方案中，轻链免疫球蛋白连接于κ免疫球蛋白恒定链并且重链免疫球蛋白连接于Y-I免疫球蛋白恒定链。该方法任选地进一步包括通过对培养基进行叠盘(disk-stack)离心、对培养基进行深层过滤和经具有0. 2微米孔径的过滤器对培养基进行过滤而从细胞回收培养基，以及，任选地，通过柱色谱分离而从培养基纯化免疫球蛋白链的进一步的步骤。本发明还提供了含水液体细胞培养基，包含约10g/L大豆水解物，约1.5g/L 葡萄糖，约150mg/L L-谷氨酰胺，约6. 8 士 0. 02 的 pH，HEPES，碳酸氢钠缓冲剂，无机盐，非必需氨基酸，重组人胰岛素，痕量元素，表面活性剂，氨基酸进料，其中通过所述氨基酸进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些
L-精氨酸 L-胱數酸
126.4 mg/L 34 mg/L
权利要求
1.用于生产蛋白质的方法，包括用表达该蛋白质的宿主细胞接种初始哺乳动物细胞生长培养基并将添加物加入该培养基中，所述添加物包括 葡萄糖； L-谷氨酰胺；大豆水解物或小麦水解物或两者；硫酸腺嘌呤；腺苷；钒酸铵；生物素；氯化胆碱；氯化钴；硫酸铜；胞苷；D-泛酸钙；盐酸乙醇胺；黄素腺嘌呤二核苷酸；叶酸；甘氨酸；鸟苷；次黄嘌呤；i-肌醇；L-丙氨酸；L-精氨酸；L-天冬酰胺；L-天冬氨酸；L-瓜氨酸；L-半胱氨酸盐酸盐；L-胱氨酸；L-谷氨酸；L-组氨酸；硫辛酸；L-异亮氨酸；L-亮氨酸；L-赖氨酸；L-甲硫氨酸；L-鸟氨酸盐酸盐；L-苯丙氨酸；L-脯氨酸；L-丝氨酸；L-苏氨酸； L-色氨酸； L-酪氨酸； L-缬氨酸； 四水合氯化锰·， 烟酸；六水合二氯化镍； 孕酮；二盐酸腐胺； 盐酸吡哆素； 核黄素； 无水钼酸钠； 磷酸二氢钠； 亚硒酸钠； 盐酸硫胺素； 胸苷；无水氯化锡； 尿苷；维生素B12; 维生素E ；和硫酸锌。
2.权利要求1的方法，其中从所述添加物加入培养基的成分的终浓度约为如下所列的那些硫酸腺嘌呤1.632 mg/L腺苷17.6 mg/L钒酸铵0.00078 mg/L生物素0.28 mg/L氯化胆碱50.2 mg/L氯化钴0.0025 mg/L硫酸铜0.0032 mg/L胞苷17.6 mg/LD-泛酸钙23.8 mg/L盐酸乙醇胺4.4 mg/L黄素腺嘌呤二核苷酸0.05 mg/L叶酸4.6 mg/L甘氨酸72 mg/L鸟苷17.6 mg/L次黄嘌呤11.8 mg/Li-肌醇73.2 mg/LL-丙氛酸8.9 mg/LL-精氨酸312.4 mg/LL-天冬酰胺842 mg/LL-天冬氨酸97.6 mg/LL-瓜氨酸12.6 mg/LL-半胱氨酸盐酸盐224 mg/LL-胱氨酸34 mg/LL-谷氨酸155.4 mg/LL-组氨酸167 mg/L硫辛酸0.52 mg/LL-异亮氨酸422 mg/LL-亮氨酸384 mg/LL-赖氨酸365 mg/LL-甲硫氨酸147.2 mg/LL-鸟氨酸盐酸盐25.6 mg/LL-苯丙氨酸207 mg/LL-脯氨酸239 mg/LL-丝氨酸281 mg/LL-苏氨酸211.6 mg/LL-色氨酸109.2 mg/LL-酪氨酸234 mg/LL-缬氨酸308.8 mg/L四水合氯化锰0.0003 mg/L烟酸31.4 mg/L六水合二氯化镍0.0004 mg/L孕酮0.015 mg/L二盐酸腐胺0.4 mg/L盐酸吡哆素3 mg/L核黄素1.86 mg/L无水钼酸钠0.00016 mg/L磷酸二氢钠288.2 mg/L亚石西酸钠0.01426 mg/L盐酸较υ胺素16 mg/L胸苷7.8 mg/L无水氯化锡0.00008 mg/L尿苷17.6 mg/L维生素Β12:3.4 mg/L维生素Ε:0.376 mg/L硫酸锌1.08 mg/L葡萄糖1.5 g/LL-谷氨酰胺150 mg/L
3.权利要求1的方法，其中添加物是从包含以约如下浓度存在的氨基酸的氨基酸进料加入的L-精氨酸6.32 g/LL-胱氨酸1.7 g/LL-组氨酸2.1 g/LL-异亮氨酸 L-亮氨酸 L-赖數酸 L-甲硫氨酸: L-苯丙氨酸: L-苏氨酸 L-色氨酸 L-酪氨酸 L-缬氨酸·2.6 g/L 2.6 g/L 3.6 g/L 0.76 g/L 1.65 g/L 2.38 g/L 0.51 g/L 1.8 g/L 2.34 g/L
4.权利要求3的方法，其中每升培养基加入约20ml氨基酸进料。
5.权利要求1的方法，其中添加物是从包含以约如下浓度存在的氨基酸的氨基酸进料加入的L-丙氨酸0.89 g/LL-天冬酰胺1.5 g/LL-天冬氨酸1.33 g/LL-谷氨酸1.47 g/L甘氨酸0.75 g/LL-脯氨酸1.15 g/LL-丝氨酸1.05 g/L
6.权利要求5的方法，其中每升培养基加入约IOml氨基酸进料。
7.权利要求1的方法，其中添加物是从包含以约如下浓度存在的添加物的营养物进料加入的L-天冬酰胺40.6 g/LL-脯氨酸10.81 g/LL-异亮氨酸18.53 g/LL-半胱氨酸盐酸盐11.19 g/LL-亮氨酸16.58 g/LL-苏氨酸8.2 g/LL-酪氨酸9.9 g/LL-精氨酸9.29 g/LL-天冬氨酸3.56 g/LL-谷氨酸6.28 g/L甘氨酸2.83 g/LL-组氨酸6.23 g/LL-甲疏氨酸6.58 g/LL-色氨酸4.93 g/LL-赖氨酸14.66 g/LL-苯丙氨酸8.64 g/LL-缬氨酸13.08 g/LL-丝氨酸13 g/L磷酸二氢钠14.41 g/L硫酸锌0.054 g/L破υ酸铜0.00016 g/L钒酸铵0.000039 g/L氯化钴0.000125 g/L六水合二氯化镍0.00002 g/L无水钼酸钠0.000008 g/L无水氯化锡0.000004 g/L四水合氯化锰0.000015 g/L。
8.权利要求7的方法，其中每升培养基加入约20ml营养物进料。
9.权利要求1的方法，其中添加物是从包含以约如下浓度存在的添加物的维生素/盐进料加入的亚硒酸钠7.13 X ΙΟ-4石充酸腺嘌呤0.0816 g/L腺苷0.88 g/L胞苷0.88 g/L鸟苷0.88 g/L尿苷0.88 g/L次黄嘌呤0.59 g/LL-瓜氨酸0.63 g/LL-鸟氨酸盐酸盐1.28 g/L生物素0.014 g/L黄素腺嘌呤二核苷酸0.0025 g/L叶酸0.23 g/L硫辛酸0.026 g/L烟酸1.57 g/L盐酸吡哆素0.15 g/L核黄素0.093 g/L盐酸疏胺素0.8 g/L维生素E:0.0188 g/L维生素B12:0.17 g/L氯化胆碱2.51 g/L盐酸乙醇胺0.22 g/Li-肌醇3.66 g/L胸苷0.39 g/L二盐酸腐腰0.02 g/L孕酮0.00075 g/LD-泛酸钙1.19 g/L
10.权利要求9的方法，其中每升培养基加入约20ml维生素/盐进料。
11.权利要求1的方法，进一步包括从宿主细胞收获培养基；其中所述蛋白质由所述细胞分泌至培养基中。
12.权利要求13的方法，其中在细胞生存力低于约60%时，从宿主细胞收获培养基。
13.权利要求11的方法，进一步包括通过对培养基进行离心和/或对培养基进行深层过滤和/或经0. 2微米过滤器对培养基进行过滤而从细胞纯化培养基。
14.权利要求1的方法，其中蛋白质是抗体或其抗原结合片段的一条或更多条免疫球蛋白链。
15.权利要求14的方法，其中抗体或片段特异性结合IGF1R。
16.权利要求15的方法，其中抗体或片段包含含有示于选自SEQID NOs :1、3，_6、13、 21和沈的成员的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；或其成熟片段或来自其的一个或更多个 CDRs ；和/或含有选自SEQ ID NOs :2、7-9、17和25的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链，或其成熟片段或来自其的一个或更多个⑶Rs。
17.权利要求16的方法，其中由宿主细胞分泌的抗体或片段是包含以下成分的抗体 含有SEQ ID NO :3、4、5或6的氨基酸20-1 的轻链免疫球蛋白；和含有SEQ ID N0:8或9 的氨基酸20-137的重链免疫球蛋白。
18.权利要求17的方法，其中轻链免疫球蛋白连接于κ免疫球蛋白恒定链并且重链免疫球蛋白连接于Y-I免疫球蛋白恒定链。
19.权利要求1的方法，其中加入了添加物的初始哺乳动物细胞生长培养基包含 HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、非必需氨基酸、重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分。
20.用于生产抗体的方法，包括用表达抗体轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白的CHO DXBll宿主细胞接种预热至约37°C的初始哺乳动物细胞生长培养基至约2. 5-5X IO5个细胞/ml的细胞密度；该初始培养基包含HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、非必需氨基酸、重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且其不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分；并且在所述接种前、同时或之后立即在培养基中加入下列添加物大豆水解物至约10g/L的终浓度；以及，任选地，加入氨基酸进料，其中通过所述氨基酸进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些L-精氨酸 L-胱氨酸 L-组氛酸 L-异亮氨酸 L-亮氨酸 L-赖氨酸 L-甲疏氨酸 L-苯丙氨酸 L-苏氨酸 L-色氨酸 L-酪氣酸 L-缬氨酸 L-丙氛酸 L-天冬酰胺: L-天冬氨酸: L-谷氛酸 甘氨酸 L-脯氨酸 L-丝氨酸·126.4 mg/L 34 mg/L 42 mg/L 52 mg/L 52 mg/L 72 mg/L 15.2 mg/L 33 mg/L 47.6 mg/L 10.2 mg/L 36 mg/L 46.8 mg/L 8.9 mg/L 30 mg/L 26.6 mg/L 29.4 mg/L 15 mg/L 23 mg/L 21 mg/L；并且，在活细胞密度达到超过约1.2X IO6个细胞/ml时，加入添加物进料，其中通过所述添加物进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些亚石西酸钠0.01426 mg/L硫酸腺嘌呤1.632 mg/L腺苷17.6 mg/L胞苷17.6 mg/L鸟苷17.6 mg/L尿苷17.6 mg/L次黄嘌呤11.8 mg/LL-瓜氨酸12.6 mg/LL-鸟氨酸盐酸盐25.6 mg/L生物素0.28 mg/L黄素腺嘌呤二核苷酸0.05 mg/L叶酸4.6 mg/L疏辛酸0.52 mg/L烟酸31.4 mg/L盐酸吡哆素3 mg/L核黄素1.86 mg/L盐酸硫胺素16 mg/L维生素E:0.376 mg/L维生素B12:3.4 mg/L氯化胆碱50.2 mg/L盐酸乙醇胺4.4 mg/Li-肌醇73.2 mg/L胸苷7.8 mg/L二盐酸腐胺0.4 mg/L孕酮0.015 mg/LD-泛酸钙23.8 mg/LL-天冬酰胺812 mg/LL-脯氨酸216 mg/LL-异亮氨酸370 mg/LL-半胱氨酸盐酸盐224 mg/LL-亮氨酸332 mg/LL-苏氨酸164 mg/LL-酪氨酸198 mg/LL-精氨酸186 mg/LL-天冬氨酸71 mg/LL-谷氨酸126 mg/L甘氨酸57 mg/LL-组氨酸125 mg/LL-甲疏氨酸132 mg/LL-色氨酸99 mg/LL-赖氨酸293 mg/LL-苯丙氨酸174 mg/LL-缬氨酸262 mg/LL-丝氨酸260 mg/L磷酸二氢钠288.2 mg/L硫酸锌1.08 mg/L较υ酸铜0.0032 mg/L机酸铵0.00078 mg/]氯化钴0.0025 mg/L六水合二氯化镍0.0004 mg/L无水钼酸钠0.00016 mg/L；并且，维持培养基中的葡萄糖浓度处于约1. 5g/L并维持培养基中的L-谷氨酰胺浓度处于约150mg/L ；并且在细胞生长期间维持&浓度处于约60% ；pH处于约6. 8 士0. 02并且温度处于约36.5°C 士0.5°C ；并且，任选地，在细胞生存力低于约60%时，从培养基中除去宿主细胞。
21.权利要求20的方法，其中抗体包含含有示于选自SEQID NOs :1、3，_6、13、21和 26的成员的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs ； 和/或含有选自SEQ ID NOs :2、7-9、17和25的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链，或其成熟片段或来自其的一个或更多个⑶Rs。
22.权利要求21的方法，其中抗体或片段包含由宿主细胞分泌的抗体，所述抗体包含 含有SEQ ID NO :3、4、5或6的氨基酸20-1 的轻链免疫球蛋白；和含有SEQ ID N0:8或9 的氨基酸20-137的重链免疫球蛋白。
23.权利要求22的方法，其中轻链免疫球蛋白连接于κ免疫球蛋白恒定链并且重链免疫球蛋白连接于Y-I免疫球蛋白恒定链。
24.权利要求23的方法，进一步包括通过对培养基进行叠盘离心、对培养基进行深层过滤和经具有约0. 2微米孔径的过滤器对培养基进行过滤而从细胞回收培养基。
25.权利要求M的方法，进一步包括通过柱色谱分离而从培养基中纯化免疫球蛋白。
26.含水液体细胞培养基，包含 约10g/L大豆水解物，约1.5g/L葡萄糖， 约150mg/L L-谷氨酰胺， 约 6.8 士 0. 02 的 pH， HEPES，碳酸氢钠缓冲剂， 无机盐， 非必需氨基酸， 重组人胰岛素， 痕量元素， 表面活性剂，氨基酸进料，其中通过所述氨基酸进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些L-精氨酸126.4 mg/LL-胱氨酸34 mg/LL-组氨酸42 mg/LL-异亮氨酸52 mg/LL-亮氨酸52 mg/LL-赖氨酸72 mg/LL-甲疏氨酸15.2 mg/LL-笨丙氨酸33 mg/LL-苏氨酸47.6 mg/LL-色氨酸10.2 mg/LL-酪氛酸36 mg/LL-缬氨酸46.8 mg/LL·丙氨酸8.9 mg/LL-天冬酰胺30 mg/LL-天冬氨酸26.6 mg/LL-谷氨酸29.4 mg/L甘氨酸15 mg/LL-脯氨酸23 mg/LL-丝氨酸21 mg/L；其中该培养基不包含抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分。
27.通过如下方法生产的含水液体培养基，该方法包括用表达抗体轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白的CHO DXBll宿主细胞接种预热至约37°C的初始哺乳动物细胞生长培养基至约2. 5-5X IO5个细胞/ml的细胞密度；该培养基包含HEPES、碳酸氢钠缓冲剂、无机盐、 非必需氨基酸、重组人胰岛素、痕量元素和表面活性剂；并且其不包含L-谷氨酰胺、抗生素、抗真菌剂或动物来源的成分；并且在所述接种前、同时或之后立即在培养基中加入下列添加物大豆水解物至约10g/L的终浓度；以及，任选地，加入氨基酸进料，其中通过所述氨基酸进料加入的成分的浓度约为如下所列的那些
28.权利要求27的含水液体培养基，其中宿主细胞包含编码抗体的免疫球蛋白的载体，其中该抗体分泌入培养基中。
29.权利要求观的含水液体培养基，其中宿主细胞生存力为约60%或更低和/或其中宿主细胞生长已进行约14-M天。
30.权利要求四的含水液体培养基，其中从培养基中除去宿主细胞。
31.权利要求30的含水液体培养基，其中通过对培养基进行离心和/或对培养基进行深层过滤和/或经0. 2微米过滤器对培养基进行过滤而从培养基中除去宿主细胞。
32.权利要求31的含水液体培养基，其中抗体特异性结合IGF1R。
33.权利要求32的含水液体培养基，其中免疫球蛋白重链包含示于选自SEQID NOs 1、3，-6,13,21和沈的成员的氨基酸序列；或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs ；并且免疫球蛋白轻链包含选自SEQ ID NOs :2、7-9、17和25的氨基酸序列，或其成熟片段或来自其的一个或更多个CDRs。
34.权利要求33的含水液体培养基，其中抗体或片段是由宿主细胞分泌的抗体，其包含含有SEQ ID NO :3、4、5或6的氨基酸20-1 的轻链免疫球蛋白；和含有SEQ ID NO 8 或9的氨基酸20-137的重链免疫球蛋白。
35.权利要求34的含水液体培养基，其中轻链免疫球蛋白连接于κ免疫球蛋白恒定链并且重链免疫球蛋白连接于Y-I免疫球蛋白恒定链。
36.包含权利要求27的含水液体培养基的容器。
37.权利要求36的容器，其是烧瓶、生物反应器、罐式生物反应器、袋式生物反应器或一次性生物反应器。
38.权利要求37的容器，其中生物反应器是搅拌罐式生物反应器、泡罩塔生物反应器、 气升式生物反应器、流化床生物反应器或填充床生物反应器。
全文摘要
本发明部分地提供了用于以高水平重组表达蛋白质的方法以及用于该方法的细胞培养基。
文档编号C07K16/28GK102224239SQ200980146837
公开日2011年10月19日 申请日期2009年9月24日 优先权日2008年9月26日
发明者D·伦代罗, R·克里什南, S·桑达迪 申请人:先灵公司