一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明具体公开了一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法与应用。所述方法为将硝酸纤维素膜固定于96孔板上，然后直接将红细胞膜包被硝酸纤维素膜上，与待测抗体反应，通过酶标二抗形成抗原-抗体复合物。所述Dot-ELISA板可以用商业化的ELISA检测分析仪器，进而能够达到自动化操作的目的，达到节省人力，减少人为误差，和高通量检测的目的。本研究用的斑点酶联免疫吸附测定方法是间接Coombs实验的8倍以上，高灵敏度可以增加低浓度和弱亲和抗体的检测准确度，进一步改进了血型检测方法和改善输血安全。
【专利说明】—种血型抗体的间接Dot-EL ISA检测方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于血型鉴定【技术领域】，具体涉及一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法与应用。
【背景技术】
[0002]血型鉴定在输血治疗中非常重要，并且每天都在发生在全世界。试剂红细胞包括ABO反定型用的试剂红细胞、各种红细胞谱细胞(Panel cell RBC)及特殊或稀有血型红细胞，用于血型鉴定、红细胞血型抗体研究和检查红细胞抗体等方面，这些红细胞血型抗原十分宝贵，也是难得的必备工作试剂。所有的血型血清学实验室都是必须常规配备的。目前，绝大多数血型血清学实验室使用的试剂红细胞，主要是全血经生理盐水多次洗涤，再添加一定量的红细胞保存液后而制成。目前反定型检测使用试剂红细胞，由于其易溶血、保存期短等原因，试剂质量难以保证，由此导致A B O血型反定型检测至今未达到规范化、标准化。
[0003]现在技术中所建立的红细胞抗体检测方法有试管法，纸片法，微柱凝胶检测卡法等，常规的这些方法都避免不了用到试剂红细胞。
[0004]斑点酶联免疫吸附测定法(Dot-ELISA)是以纤维素膜代替免疫酶固相载体法中常用的聚苯乙烯微量反应板而建立的一种免疫检验方法。Dot-ELISA不仅保留了常规ELISA的优点，而且还弥补了抗原或抗体对载体包被不牢等不足，所以具有敏感性高，特异性强，被检样品用量少，节省材料，不需特殊仪器，结果判定简单易行和便于长期保存等特点。
[0005]Dot-ELISA的基本原理与常规ELISA和免疫酶染色法基本相同，即将抗原或抗体首先吸附在纤维素薄膜(如 硝酸纤维素膜，NC)表面，并保持其免疫活性，通过与相应的抗体或抗原和酶标记物的一系列免疫反应，形成酶标记抗原抗体复合物，在底物的参与下，结合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色物质，沉着于抗原抗体复合物吸附的部位，呈现出肉眼可见的颜色斑点。试验的结果可通过颜色斑点的出现与否和色泽深度进行判定。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法。
[0007]本发明的另一个目的是提供一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法的应用。
[0008]本发明通过以下技术方案实现上述目的:
一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法，包括如下步骤:
51.将硝酸纤维素膜固定于96孔板底部得Dot-ELISA96孔板；
52.取I~5ML红细胞膜点在SI所述96孔板孔内的硝酸纤维素膜上，26~37°C干燥10~30min，用100~250ML 3%的脱脂乳封闭96孔板15~45min ； 53.洗板、拍干后向孔中加入100?200ML待检血清溶液，26?37°C反应30?60min；
54.洗板、拍干后向孔中加入100?200ML酶标二抗溶液，37°C反应30?45min;洗板、拍干后向孔中加入80?150ML底物显色溶液,显色5?IOmin,终止反应,记录结果。
[0009]优选地，Dot-ELISA 96孔板的制备方法为:将硝酸纤维素膜用蒸馏水侵泡，制合适大小的圆形膜，干燥后放入96孔板中，用固定环压紧硝酸纤维素膜于96孔板底部，放入干燥箱中干燥I?2h即的；
所述固定环为塑料材料制成，固定环为高度为2?4mm,厚度为0.04?0.08mm的圆柱形环。环外径与所用的96孔板孔的内径配套，固定环两端外径分大小端，大端外径稍大于或等于96孔板内孔径，使固定环能与96孔板孔贴紧，不易滑脱，小端外径稍小于96孔板孔内径，使固定时容易压进96孔板孔内。市场上常用的96孔板孔内径大小为6.8_，对于这样规格的96孔板,所述固定环的大端外径稍大于或等于6.8mm,小端外径稍小于6.8mm即可。所以固定环两端一定要光滑平整，能紧密压紧硝酸纤维素膜与96孔板底部。固定环要有一定厚度使其能与硝酸纤维素膜有一定的接触面积。
[0010]优选地，步骤S2所述红细胞膜的制备方法为:向5?20mL抗凝血中加入10?40mL预冷生理盐水，离心得红细胞，按照与红细胞体积比为30?40: I的量加入预冷0.01mol/L, pH7.4 Tric-HCl，4°C放置I?2 h，离心、弃上清，重复3?5次至无肉眼可见的红细胞为止，沉淀物用PBS溶液溶解即得红细胞膜。
[0011]更优选地,步骤S2所述红细胞膜的制备方法为:向20mL抗凝血中加入20mL预冷生理盐水，3000rpm离心15min，弃上清和白细胞层得红细胞，用预冷生理盐水重复洗涤红细胞3次，按照与红细胞膜体积比为40: I的量加入预冷0.01 mol/L, pH7.4 Tric-HCl,4°C放置2 h，9 000 r/min，4°C离心20 min，弃上清，重复3?5次至无肉眼可见的红细胞为止，沉淀物用0.01 mol/L, pH7.4的PBS溶液溶解即得。
[0012]所述洗板具体步骤为向板内加入200?250ML 0.01 mol/L pH为7.4的PBS溶液，振摇洗涤3次，每次5min。
[0013]如上所述血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法的应用，其特征在于，应用于血型鉴定。
[0014]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
1、本发明将硝酸纤维素膜固定在96孔板板底部，制作成一个Dot-ELISA板，这样可以用现在已经商业化的ELISA检测分析仪器，进而能够达到自动化操作的目的，达到节省人力，减少人为误差，和高通量检测的目的。这种设计是很容易实现自动化检测。本研究用的斑点酶联免疫吸附测定方法特别是用于检测识别临床意义抗体比传统血清学检测技术有更高的灵敏性，结果表明Dot-ELISA检测方法是间接Coombs实验的8倍以上。高灵敏度可以增加低浓度和弱亲和抗体的检测准确度。进一步改进了血型检测方法和改善输血安全。
[0015]2、当前所用的抗体筛查实验方法并不能检测到所有临床意义的抗体。例如对低浓度和低亲和力的抗体可能检测不出。有些抗体表现出剂量依赖效应。本发明所述间接Dot-ELISA方法具有较高的灵敏度，并且可以调整抗原浓度以便增加抗原的量，进一步提高检测灵敏度。这样可以提高低浓度或低亲和里抗体的检测可能性。
[0016]3、输血前的血清学检测是保证一最低的成本提高输入血细胞的存活率。本发明所述D0T-ELISA法是一个有价值的替代传统的输血前检测血型抗体检测方法。这种方法可以使血型抗原长期保存，易于自动化操作，易推广，并在输血医学有很大的临床意义和经济意义。
[0017]4、由于惯性思维或者技术偏见的原因，一直以来临床上用于血型反定型检测血清中抗体都是用试剂红细胞进行血凝检测，但是由于试剂红细胞的保存期比较短，很难标准化。研究人员反复试验为提高试剂红细胞的保存时间，至今最长时间只能保存120天。而现在已经商业化的试剂红细胞试剂盒说明书上标注的保存期仅仅为60天。由于血型抗原纯化非常复杂和困难，很多研究对血型抗原提取纯化仅仅围绕血型抗原结构和生化分析上，由于不能大批量纯化及纯化费用昂贵，纯化的血型抗原至今没有用于血型抗体的检测上。而本实验避免了血型抗原的纯化，仅仅是提取血型抗原所在的红细胞膜，不进行特定血型抗原的纯化。用特性血型的红细胞膜进行作为血型抗原，对血型抗体进行检测。本研究应用非常简单的实验方法，解决了红细胞上血型抗原长期保存的难题。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1.Dot-ELISA 96孔板模式图，A.固定环；B.硝酸纤维素膜；C.固定环结构图。
[0019]图2.Dot-ELISA方法检测结果；DEA1.1+:犬血型DEA1.1阳性抗原细胞膜。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作出进一步地详细阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
[0021]实施例1
S1.Dot-ELISA 96孔板制备:将硝酸纤维素膜用蒸馏水侵泡后，稍加干燥进行，用打孔器制合适大小的圆形膜。将干燥后的硝酸纤维素膜放入96孔板中，用固定环压紧硝酸纤维素膜于96孔板底部(如图.1)。然后将96孔板放入干燥箱中干燥2h，干燥保存备用。
[0022]所述固定环的结构如图1中C所示；所述固定环为塑料材料制成，固定环为高度为2?4mm,厚度为0.04?0.08mm的圆柱形环。环外径与所用的96孔板孔的内径配套，固定环两端外径分大小端，大端外径稍大于或等于96孔板内孔径，使固定环能与96孔板孔贴紧，不易滑脱，小端外径稍小于96孔板孔内径，使固定时容易压进96孔板孔内。固定环两端一定要光滑平整，能紧密压紧硝酸纤维素膜与96孔板底部。固定环要有一定厚度使其能与硝酸纤维素膜有一定的接触面积。
[0023]S2.红细胞膜提取:取抗凝血20mL,加预冷生理盐水20mL, 3000rpm离心15min。弃上清和白细胞层，用预冷生理盐水重复洗涤3次后，按照与红细胞膜体积比为40: I的量加入预冷 0.01 mol/L,pH7.4 Tric-HCl 混合，4°C放置 2 h。再以 9 000 r/min 4°C离心 20min，弃上清，重复3?5次至无肉眼可见的红细胞为止。沉淀物用0.01 mol/L PBS (pH7.4)溶液溶解即得，置_20°C保存。
[0024]S3.间接Dot-ELISA实验:用0.01 mol/L PBS溶液(pH7.4)适当稀释相应血型的细胞膜，取I?5ML点在Dot-ELISA 96孔板孔内的硝酸纤维素膜上，37°C烘箱干燥IOmin0加入250ML 3%的脱脂乳，在37°C培养箱封闭Dot-ELISA 96孔板30min。向板内加A 200 ML 0.01 mol/L PBS溶液(pH7.4)振摇洗涤3次，每次5min，弃去液体拍干。向孔中加入200 ML 20?50倍稀释的待检血清溶液中，同时用针对检测的抗原的阳性单克隆抗体和针对需要检测抗原的阴性血清做阴阳性对照，37°C培养箱反应30min。向板内加入200~250ML 0.01 mol/L PBS溶液(pH7.4)振摇洗涤3次，每次5min，弃去液体拍干。向孔中加A 100~200ML —定2000-4000倍稀释的酶标二抗溶液，37°C培养箱反应30min。向板内加入200~250ML 0.01 mol/L PBS溶液(pH7.4)振摇洗涤3次，每次5min，弃去液体拍干。向孔中加入80~150ul底物显色溶液，避光振摇显色5~lOmin。用蒸馏水洗涤终止反应。用成像系统记录结果。
[0025]判定标准根据显色反应有无或颜色深浅，进行定性或半定量:斑点呈深褐红色为+++，褐红色为++，无色为阴性。
[0026]红细胞膜中血红蛋白残留检测:提取的红细胞膜用0.01 mol/L PBS (pH7.4)稀释，2倍倍比稀释后，每Dot-ELISA板孔膜上点2ML，37°C烘箱干燥lOmin。用3%的脱脂乳37°C培养箱，封闭Dot-ELISA 96孔板30min。向板内加入0.01 mol/L PBS溶液(pH7.4)振摇洗漆3次,每次5min,弃去液体拍干。向孔中加入一定系适度底物显色溶液,避光振摇显色5~lOmin。用蒸懼水洗漆终止反应。用成像系统记录结果。
[0027]结果:抗原包被浓度跟所提取的红细胞膜内血红蛋白含量有关。血红蛋白可以和底物反应显色，抗原包被浓度较大可能提高血红蛋白含量和与血清中抗体进行非特异性结合而出现阴性血清出现斑点的情况。所以在摸索过程中一定要做不加血清只加底物显色的试验组，排除血红蛋白残留的干扰。结果显示出的没有出现斑点或颜色变化的稀释度。是确定抗原包被浓度时所用到的最大浓度。
[0028]实施例2
抗原量的确定:用0.01 mol/L PBS溶液(PH7.4)稀释相应血型的细胞膜，2倍倍比稀释抗原，每Dot-ELISA板孔膜上点2ML，根据结果判断包被的浓度。血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法的具体步骤同实施例1。
[0029]判断标准为:抗原的浓度越大越容易出现非特异性结合。阴性抗体血清显示无色或没有斑点出现，阳性抗体血清显示颜色最深的浓度为最佳的抗原包被浓度。
[0030]本实验结果显示:抗原包被浓度在I~2吒(2ML，500~lOOOl^g/ml)均能达到很高的灵敏度，并且没有非特异性结合。
[0031]实施例3 特异性实验:
用不同浓度的犬DEA1.1阳性抗原和ABO抗原分别与阴性、阳性抗体抗血清反应。不同浓度的DEA1.1阴性抗原分别与犬阴性，阳性抗体抗血清反应。观察间接Dot-ELISA方法的特异性。间接Dot-ELISA检测方法的具体步骤同实施例1。
[0032]结果显示如图2，具有相应抗原的红细胞膜，与阳性抗体抗血清反应，结果显示深褐色斑点，结果为+++，其他的无斑点，说明间接Dot-ELISA检测方法具有很高的特异性。
[0033]实施例4 灵敏度实验:
一定浓度的犬DEA1.1阳性抗原与不同稀释度的阳性抗血清反应，并与间接Coombs实验相比,观察实施例1所述血型抗体的间接Dot-ELISA方法的灵敏性。
[0034]结果显示:两种方法相比，实施例1所述血型抗体的间接Dot-ELISA方法比间接Coombs实验灵敏度高8倍。说明Dot-ELISA方法具有很高的灵敏度。能检测出弱抗体或浓度较低的抗体。
[0035]实施例5
稳定性实验:
将实施例1所述方法制备得到的红细胞膜在_20°C长时间保存，反复冻融20次，固定于Dot-ELISA板，4°C保存后进行检测。观察实施例1所述血型抗体的间接Dot-ELISA方法的灵敏性。
[0036]结果显示:-20°C长时间保存并不影响检测结果。反复冻融20次也不影响检测结果。固定在Dot-ELISA板4°C保存后发现2个月内不影响检测结果。说明Dot-ELISA具有很高的稳定性，可以长期保存抗原，替换掉试剂红细胞。
[0037]实施例6
利用实施例1所述血型抗体的间接Dot-ELISA方法进行临床样本检测:
提取158只犬红细胞膜用DEA1.1抗血清进行细胞抗原检测。并与间接Coombs实验相比，观察两种方法的符合率。用其中一份DEA1.1抗原阳性的细胞膜对158分犬血清进行DEA1.1抗体检测。
[0038]用提取的ABO试剂红细胞细胞膜对580人血清样本进行检测，并与血型反定型试剂盒检测方法相比，观察两种方法符合率。
[0039]临床样本检测，各个对比实验显示，符合率均为100%。说明Dot-ELISA检测方法可以用于临床检测。
[0040]分析与讨论:
在这项研究中，把硝酸纤维素膜固定在96孔板板底部，制作成一个Dot-ELISA板，这样可以用现在已经商业化的ELISA检测分析仪器，进而能够达到自动化操作的目的，达到节省人力，减少人为误差，和高通量检测的目的。这种设计是很容易实现自动化检测。本研究用的斑点酶联免疫吸附测定方法特别是用于检测识别临床意义抗体比传统血清学检测技术有更高的灵敏性，结果表明Dot-ELISA检测方法是间接Coombs实验的8倍以上。高灵敏度可以增加低浓度和弱亲和抗体的检测准确度。进一步改进了血型检测方法和改善输血安全。
[0041]本发明所使用的抗原可以长时间保存和反复冷冻，并不影响检测结果。它会解决长期保存和运输血型抗原问题。高稳定性结果提供更高的可靠性，进一步提高实验室标准化和控制程序。多种红细胞抗原(犬的DEA1.1，人的ABO)都可以用于血型抗体的检测，说明Dot-ELISA具有很广泛的应用范围。可以用于红细胞谱细胞、筛选红细胞和稀有血型红细胞血型抗原的保存和抗体的检测。并且可以在一个96孔Dot-ELISA板上同时检测多种血型抗体。这将大大提高血清中血型抗体的筛选效率，进一步节省输血前检测的时间，增加了输血医学的安全性和时效性。当前所用的抗体筛查实验方法并不能检测到所有临床意义的抗体。例如对低浓度和低亲和力的抗体可能检测不出。有些抗体表现出剂量依赖效应。Dot-ELISA具有较高的灵敏度，并且可以调整抗原浓度以便增加抗原的量，进一步提高检测灵敏度。这样可以提高低浓度或低亲和里抗体的检测可能性。
[0042]输血前的血清学检测是保证一最低的成本提高输入血细胞的存活率。D0T-ELISA法是一个有价值的替代传统的输血前检测血型抗体检测方法。这种方法可以是血型抗原长期保存，易于自动化操作，易推广，并在输血医学有很大的临床意义和经济意义。
【权利要求】
1.一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.将硝酸纤维素膜固定于96孔板上； 52.取I?5ML红细胞膜包被硝酸纤维素膜，26?37°C干燥10?30min，用100?250ML 3%的脱脂乳封闭96孔板15?45min ； 53.洗板、拍干后向孔中加入100?200ML待检血清溶液，26?37°C反应30?60min； 54.洗板、拍干后向孔中加入100?200ML酶标二抗溶液，37°C反应30?45min;洗板、拍干后向孔中加入80?150ML底物显色溶液,显色5?IOmin,终止反应,记录结果。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，将硝酸纤维素膜固定于96孔板上的具体步骤为:将硝酸纤维素膜用蒸馏水侵泡，制合适大小的圆形膜，干燥后放入96孔板中，用固定环压紧硝酸纤维素膜于96孔板底部，放入干燥箱中干燥I?2h即的； 所述固定环为高度为2?4mm,厚度为0.04?0.08mm的圆柱形环,环外径与96孔板孔的内径配套，固定环两端外径分大小端，大端外径大于或等于96孔板内孔径，小端外径小于96孔板孔内径。
3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤S2所述红细胞膜的制备方法为:向5?20mL抗凝血中加入10?40mL预冷生理盐水，离心得红细胞，按照与红细胞体积比为30?40: I的量加入预冷0.01 mol/L, pH7.4 Tric-HCl，4°C放置I?2 h，离心、弃上清，重复3?5次至无肉眼可见的红细胞为止，沉淀物用PBS溶液溶解即得红细胞膜。
4.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，所述红细胞膜的制备方法为:向20mL抗凝血中加入20mL预冷生理盐水，3000rpm离心15min，弃上清和白细胞层得红细胞，用预冷生理盐水重复洗涤红细胞3次，按照与红细胞膜体积比为40: I的量加入预冷0.01mol/L, pH7.4 Tric-HCl, 4°C放置 2 h, 9 000 r/min, 4°C离心 20 min,弃上清,重复 3?5 次至无肉眼可见的红细胞为止，沉淀物用0.01 mol/L, pH7.4的PBS溶液溶解即得。
5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述洗板具体步骤为向板内加入200?250ML 0.01 mol/L pH为7.4的PBS溶液，振摇洗涤3次，每次5min。
6.权利要求1所述血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法的应用，其特征在于，应用于血型鉴定。
【文档编号】G01N33/80GK103487590SQ201310394101
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】李守军, 李华涛 申请人:华南农业大学