一种用于血型抗体检测的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于血型抗体检测和鉴定技术领域，具体涉及一种用于血型抗体检测的试剂盒及其在血型抗体检测中的应用。
【背景技术】
[0002]血型鉴定在输血治疗中非常重要，血型鉴定是基于抗原-抗体反应导致的细胞凝集反应。使用红细胞表面抗原检测血清/血浆中的血型抗体称之为反定型。在临床输血中，必须保证正、反定型法鉴定结果一致，才能确保输血的安全性。目前大多数的反定型试验都是以有活力的红细胞表面抗原作为标准抗原，然而新鲜红细胞不易保存，并且红细胞表面抗原的抗原性随保存时间延长而逐渐降低。这类试剂不仅需要低温保存，且最长保存期只有3至6个月。
[0003]现有技术中所建立的红细胞抗体检测方法有试管法、纸片法、微柱凝集检测卡法等。微柱凝集法是目前最常用的检测方法，实验时红细胞抗原与相应抗体的反应在微柱凝集介质中进行，微柱凝集具有分子筛的作用，如果红细胞抗原与相应抗体结合，形成的凝集块经离心后不能通过分子筛而留在凝集介质的上层；如果红细胞与抗体没有结合，反应后没有形成凝集块，则离心后红细胞可以通过分子筛沉淀到底部，从而达到鉴定ABO血型的目的。但是该方法干扰因素多，可能产生假阴性或假阳性检测结果，导致检测结果容易出现误差。
[0004]CN103487590B公开了一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法与应用，所述方法为将硝酸纤维素膜固定于96孔板上，然后直接将红细胞膜包被硝酸纤维素膜上，与待测抗体反应，通过酶标二抗形成抗原-抗体复合物。然而该方法操作复杂，不易实现，需肉眼判断检测结果，易产生误差且无法实现定量检测。
[0005]CN1032926A同样公开了将已用酶标记的ABH单克隆抗体用斑点ELISA (酶联免疫吸附法)进行ABO血型测定，通过结合在抗体上的酶作用底物出现颜色变化来判断血型。同样的，上述方法也需通过肉眼观察颜色判断检测结果，易产生误差并无法实现定量检测。
[0006]A sandwich enzyme-linked immune-sorbent assay for ABO blood typing ofsemen by using anli_P84 monoclonal antibody as a marker of blood group substancein semen (Sato I et al.，J Forensic Sci，2000，45 (4):795)公开了利用 ELISA 法测定精液中的血型物质P84，实验利用抗血型物质P84的单克隆抗体包板，捕捉精液或精斑样本中的相应抗原，实验证明即使样本在40°C下保存8个月，样本中仍有超过60%的P84血型物质生物学活性存在，仍然可以用这种办法顺利进行血型物质的鉴定。
[0007]为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒及应用。
【发明内容】
[0008]本发明的一个目的是提供一种血型抗体鉴定和/或检测方法，解决了现有检测方法中只能定性或半定量检测血液中血型抗体的缺陷，实现了对血型抗体特别是血液中存在的弱抗体定量鉴定和/或检测，提高了输血的安全性。
[0009]本发明的另一个目的是提供一种血型抗体鉴定和/或检测方法，解决了现有检测方法中操作繁琐复杂的问题，能够实现用十系及以上谱细胞进行不规则抗体的自动化和批量化检测。
[0010]本发明的再一个目的是提供一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒，解决了现有检测产品中红细胞保存周期过短，检测重现性差、不能实现检测标准化的问题。
[0011]本发明的一方面提供了一种用于血型抗体鉴定和/或检测的试剂盒，包括：固定有血型抗原的固相载体、补体、酶标记的抗补体和显色液。
[0012]本发明所述的血型抗原是指人体红细胞存在的抗原物质。可以理解，现有已知的红细胞表面的抗原均可以被用于血型抗体鉴定和/或检测，其取决于需要鉴定和/或检测的血型抗体，优选的，所述的血型抗原为选自ABO血型系统、Rh血型系统、丽S血型系统、P血型系统、Kell血型系统、Kidd血型系统、Lewis血型系统、Duffy血型系统的抗原。所述的ABO血型系统抗原为A、B抗原，所述的Rh血型系统抗原为C、c、D、E、e抗原，所述的丽S血型系统抗原为M、N、S、s抗原，所述的P血型系统抗原为Pl抗原，所述的Kell血型系统抗原为K、k、Kpa、Kpb、Jsa、化^^原，所述的Kidd血型系统抗原为Jk a、见’允原，所述的Lewis血型系统抗原为Lea、Leb抗原，所述的Duffy血型系统抗原为Fy a、Fyb抗原。更优选的，所述的血型抗原为ABO血型系统抗原，即A抗原或B抗原。
[0013]本发明所述的固相载体作为吸附剂和容器，本身不参与化学反应。本发明所述的固相载体材质可以为聚苯乙烯、聚氯乙烯，优选为聚苯乙烯。更优选的，本发明所述的固相载体为微量滴定板或微孔板，包括8孔板、48孔板、96孔板，最优选的，本发明所述的固相载体为96孔板，更为优选的，本发明所述的固相载体为条与条之间可拆卸的微孔板。
[0014]本发明所述的补体能够与抗原抗体复合物（例如IgG、IgM)反应，并且不与单独的抗原和抗体反应，因此可以特异性的用于血型抗体的检测中。Clq为各种补体分子中分子量最大（410kDa)的γ球蛋白，其分子结构较特殊和复杂，由Α、B、C三种不同类型的肽链所组成。Clq可以用于识别抗原抗体复合物，当Ig补体结合位点暴露时，Clq能与Ig受体部位结合，并由此导致Clq的活化。因此，本发明所述的补体优选为Clq补体，更优选的，本发明所述的试剂盒中补体Clq的浓度是O. 04-400 μ g/mL，最优选的，本发明所述的试剂盒中补体Clq浓度为O. 1-100 μ g/mL，特别优选的，本发明所述的试剂盒中补体Clq浓度为
O.1-0. 4 μg/mL。
[0015]本发明所述的酶标记的抗补体用于与补体结合，同时酶标记的抗补体与显色液作用，最终实现定量检测。本发明所述的酶标记的抗补体优选为酶标记的抗补体Clq，更优选的，本发明所述的酶标记的抗补体Clq可以为辣根过氧化物酶标记的抗补体Clq，最优选的，本发明所述的辣根过氧化物酶标记的抗补体Clq浓度为O. 1-100 μ g/mL,最优选的，本发明所述的辣根过氧化物酶标记的抗补体Clq浓度为O. 5-10 μ g/mL,特别优选的，本发明所述的试剂盒中辣根过氧化物酶标记的抗补体Clq浓度为O. 625-2. 5 μ g/mL。
[0016]优选的，本发明所述的显色液可以为现有技术中任何与酶标记的抗补体中的酶作用后显色的物质。更优选的，本发明所述的显色液为TMB显色液。
[0017]在本发明的【具体实施方式】中，所述的血型抗原可以采用合成方法或血液提取法获得。在本发明的【具体实施方式】中，固定有血型抗原的固相载体的制备方法，包括:将固相载体的表面氨基化或醛基化；用6°Co辐照固相载体或用紫外线照射固相载体；将血型抗原或含血型抗原的红细胞膜蛋白提取物用碳酸盐缓冲液稀释，以50-500 μ L包被固相载体，放置l_36h后去除液体，加入含5-20%牛血清白蛋白BSA的磷酸盐缓冲液，在室温下封闭l_8h，甩去液体，干燥即得。优选的，所述的固相载体的表面氨基化采用多聚赖氨酸进行表面氨基化，更优选的，所述的固相载体的表面氨基化包括加入50-500 μ L的浓度为0.05-lg/L的多聚赖氨酸，水浴l-10h，除去液体后以蒸馏水洗涤，最优选的，所述的固相载体的表面氨基化包括加入100-200 μ L的浓度为0.05-0.2g/L的多聚赖氨酸，水浴2_4h，除去