一种表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒株的制作方法

本发明属于基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种表达h9亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒株。

背景技术：

我国自1994年首次报道从鸡群中分离到h9亚型禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)以来，该亚型禽流感在我国一直呈地方性流行，严重危害我国养禽业的发展。h9亚型aiv传播能力强，流行范围广，感染家禽主要表现为产蛋下降，该亚型病毒虽然对鸡低致病性，但并发或继发感染其他病原可引起高发病率和死亡率，给我国养禽业造成巨大的经济损失。

目前灭活疫苗的使用成为预防和控制禽流感的主要手段，但常规的灭活疫苗存在着一些难以克服的缺陷：灭活疫苗生产费时费力，且油乳佐剂会引起局部的不良反应，导致动物不适和肉质下降；不能诱导有效的细胞免疫应答和粘膜免疫igg抗体的产生，因而无法有效地抑制呼吸道中流感病毒的复制；免疫效率低下，免疫剂量大，不能与自然感染区分，影响禽流感的监控，而且存在着散毒的危险等。因此，急需研制新型禽流感疫苗来克服现有疫苗的不足。而基因重组活载体疫苗在很大程度上可以避免上述情况。

目前用于构建重组病毒的活载体有很多，如马立克氏病毒(mdv-1)、火鸡疱疹病毒(hvt)、新城疫病毒(ndv)、鸭瘟病毒(dev)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、鸡痘病毒(fpv)等。与其他禽病毒载体相比，hvt具有很多独特的优势。其优势主要包括：hvt有20多个可供外源基因插入的复制非必需区，因此其复制非必需区可以插入较长外源基因，有利于构建多价重组活疫苗，其中已报道的复制非必需区有us1、us2、us3、us6、us10、us7、ul23、ul44、ul45、ul46、tk、pk等；hvt可在鸡体内持续感染，为外源基因的表达提供良好的活载体，可以刺激机体持续的产生抗体；hvt作为疫苗对鸡无致病性，不影响其生产性能，安全性好；hvt可刺激机体产生坚强的细胞免疫反应，且持续时间长，接种一次可达到终生免疫的效果；hvt具有很强的细胞结合特性，可以在细胞间传播；以hvt为载体的基因工程苗可以突破母源抗体的干扰等。因此，以hvt为载体的基因工程苗具有广阔的应用前景。

就aiv而言，ha蛋白作为主要免疫保护性抗原，是体液免疫的靶抗原，主要诱导机体产生中和抗体，因此如何能够以火鸡疱疹病毒(hvt)为载体进行h9亚型禽流感病的活疫苗研究成为一项亟待攻克的难题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种表达h9亚型禽流感病毒ha基因重组火鸡疱疹病毒株，该病毒株可用于家禽中诱导针对h9亚型aiv的保护性免疫应答。

本发明首先提供一种在火鸡疱疹病毒中插入外源基因的方法，是将外源基因插入火鸡疱疹病毒(hvt)的两个插入位点us2和us10，

更具体的，所述的插入位点位于hvt基因组us2区的140276nt-140285nt之间。

本发明再一方面提供一种重组火鸡疱疹病毒，是通过在火鸡疱疹病毒的us2区和us10区分别插入h9亚型禽流感病毒ha基因和h9亚型禽流感病毒的ha2基因构建的；

本发明所提供的表达h9亚型禽流感病毒ha基因重组火鸡疱疹病毒(rhvt-h9-ha)株，于2017年1月18日保藏在位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:v201707。

本发明的rhvt-h9-ha株用于表达ha基因蛋白，

本发明的rhvt-h9-ha株的另一方面的用途是用于制备疫苗；

本发明以火鸡疱疹病毒(hvt)fc-126疫苗毒株为载体，分别以其复制非必需区us2和us10为插入位点，构建表达egfp标记基因的重组病毒rhvt-egfp。本发明选择h9亚型禽流感病毒yz140706株的ha基因完整的开放阅读框和ha2基因分别构建表达盒，再次利用同源重组原理，用上述两个基因表达盒分别替换重组病毒rhvt-egfp的标记基因egfp，分别筛选出表达完整ha基因和部分ha基因的重组hvt。

免疫保护评价结果表明，本发明的rhvt-h9-ha株对h9亚型禽流感病毒，可以提供100％攻毒保护。

附图说明

图1：转移的构建模式图；

图2：重组病毒rhvt-h9-ha的构建示意图；

图3：ha基因及其表达盒pcr电泳图；

图4：重组病毒rhvt-egfp的荧光图；

图5：重组病毒rhvt-h9-ha的噬斑图；

图6：鉴定重组病毒rhvt-h9-ha外源基因表达的ifa试验；

图7：鉴定重组病毒rhvt-h9-ha外源基因表达的western-blot试验图片；

图8：hvt亲本毒和重组病毒在cef上的生长曲线图。

具体实施方式

下面以构建表达ha基因完整开放阅读框的重组hvt为例，对本发明进行详细的描述，。

实施例1

1实验材料

1.1毒株、菌株和质粒

hvtfc-126疫苗株由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室保存。

h9亚型aiva/chicken/yangzhou/14/0706(h9n2)株(yz140706株)由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室保藏。

感受态细胞trans-t1购自北京全式金生物技术有限公司；鸡胚成纤维细胞系(df-1)由青岛易邦生物工程有限公司保藏。

质粒：peasy-t3，peasy-blunt，peasy-m1购自北京全式金生物科技有限公司；pcr2.1、pt-egfp由本扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室保存，其中pt-egfp包含表达绿色荧光蛋白(gfp)的表达盒，表达盒两端分别有notⅰ和avrⅱ酶切位点。

2实验方法

2.1中间转移载体pfr的构建

2.1.1同源臂引物的设计

选择hvt的us2区插入外源基因，参照genbank中登录的hvtfc126株(登录号：af291866)的全基因序列，用primerpremier5.0引物设计软件设计两对引物，分别pcr扩增fwd、rev同源臂。fwd同源臂上游引入kpnⅰ酶切位点，下游引入speⅰ和avrⅱ酶切位点。rev同源臂上游引入notⅰ酶切位点，下游引入apaⅰ酶切位点。引物序列如下：

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rev-r:tattgggcccggagcgagagatgaaagaatact

引物用超纯水稀释至10μm，-20℃保存备用。

2.1.2转移载体pfr的构建

以hvtfc-126株感染cef病变细胞的总dna为模板，分别以fwd-f/fwd-r和rev-f/rev-r为引物扩增fwd、rev同源臂，回收目的片段。回收产物与peasytm-t3克隆载体进行连接转化。测序鉴定正确的克隆，分别命名为pt-fwd和pt-rev，提取质粒，置于-20℃冰箱保存备用。

将质粒pt-fwd和pcr2.1用kpnⅰ、speⅰ进行酶切，1％凝胶电泳后切胶回收pt-fwd载体中的fwd片段和线性化pcr2.1载体。将回收后的fwd片段和线性化载体pcr2.1连接，构建质粒p-f。将质粒pt-rev和p-f用notⅰ和apaⅰ进行酶切，1％凝胶电泳后切胶回收pt-rev载体中的rev片段和线性化载体p-f，将回收后的rev片段和线性化载体p-f连接，构建质粒p-fr。

2.2真核表达载体pt-cmv-ha的构建

2.2.1引物设计

参照genbank中登录的h9亚型aiv的ha基因序列和peasy-m1载体序列，用primerpremier5.0软件设计两对引物，分别用于pcr扩增ha基因和peasy-m1载体表达盒。ha基因下游去掉终止密码子后，添加v5标签。扩增peasy-m1载体表达盒引物的5’端引入notⅰ位点，引物3’端引入avrⅱ位点。

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ha2-r:5’-gatccaaatgttgcaatcgcaagac-3’

引物用超纯水稀释至10μm，-20℃保存备用。

2.2.2ha基因的扩增

取禽流感病毒h9亚型yz140706株无菌尿囊液400μl，提取rna，以ha-f/ha-r为引物，进行rt-pcr，反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，回收产物放置-20℃冰箱保存备用；其中ha基因的核苷酸序列为seqidno:1，ha2的核苷酸序列为seqidno:2。

2.2.3pcr产物连接与阳性克隆的鉴定

将上述回收的目的片段定向连接到真核表达载体peasy-m1中，pcr鉴定阳性克隆送测序，测序正确的克隆命名为pm1-h9-ha。

2.2.4克隆载体pt-cmv-ha的构建

以质粒pm1-h9-ha为模板，以cmv-pa-f/cmv-pa-r为引物，pcr扩增ha基因表达盒。反应结束后，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。回收大小约为3000bp左右目的条带。回收产物连接peasytm-t3克隆载体，鉴定正确的阳性克隆命名为pt-cmv-h9-ha。

2.3转移载体pfr-egfp和pfr-ha的构建

质粒pt-egfp、pt-cmv-h9-ha和p-fr用notⅰ、avrⅱ进行双酶切。1％凝胶电泳后，回收notⅰ-egfp-avrⅱ、notⅰ-h9-ha-avrⅱ片段，与同样经notⅰ、avrⅱ酶切的线性化载体p-fr进行连接。构建的阳性克隆分别命名为pfr-egfp、pfr-h9-ha。

2.4转移载体的鉴定表达

2.4.1载体pfr-egfp的鉴定

将构建成功的转移载体pfr-egfp瞬时转染到长至80％的df1细胞培养皿中，继续培养18～24h后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。

2.4.2载体pfr-h9-ha的鉴定

①western-blot试验

转移载体pfr-h9-ha转染df1细胞，继续培养24h后收集细胞。western-blot试验鉴定蛋白表达。

②间接免疫荧光试验(ifa)

转移载体pfr-h9-ha瞬时转染于铺有df1细胞的96孔板中，24h后进行简接免疫荧光，倒置荧光显微镜下观察转染细胞的荧光情况。

2.5表达egfp的重组火鸡疱疹病毒(rhvt-egfp)构建

2.5.1hvtfc-126株基因组的提取

按常规方法制备cef，hvtfc-126毒株接种于长满单层cef的细胞瓶中，37℃、5％co2细胞培养箱中培养60～84h，待80％的细胞产生典型蚀斑病变后，收集细胞，用于提取病毒dna。具体操作步骤如下：弃掉培养液，pbs洗三次，每t75细胞瓶加入5mlpk(20mmtris-hcl，ph8.0；0.5％sds；150mmnacl；2mmedta，ph8.0；0.2mg/ml胰蛋白酶)溶液，37℃培养箱静置2h；细胞裂解物转移至50ml离心管中，加入1/2体积的饱和酚(使蛋白变性)，轻轻颠倒混匀，作用1min；加入1/2体积的的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，轻轻混匀，8000r/min离心15min；吸取上清于新离心管中，再次加入等体积的氯仿/异戊醇抽提杂蛋白，8000r/min离心5min；吸取上清于新离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积的3m醋酸钠(ph5.2)，-20℃静置30min；4500r/min离心5min，弃上清，加入10ml预冷的70％乙醇清洗dna沉淀物，4500r/min离心10min，弃上清，瞬离吸干上清；自然干燥后，加适量te缓冲液溶解dna；紫外分光光度计测定dna的浓度及纯度，4℃保存备用。

2.5.2表达egfp的重组病毒拯救

转染前制备次代cef细胞，细胞生长于加入m199培养基(含3％类胎牛血清)的60mm培养皿中，待细胞长至铺满单层的80％时，配制转染体系，进行转染。采用磷酸钙共沉淀法拯救重组病毒，配制体系如下：

上述体系混匀后，从管底缓慢加入2mcacl231μl；缓慢加入2×hbsp溶液(10mg/mlherpes；0.74mg/mlkcl；16mg/mlnacl；0.25mg/mlna2hpo4；2mg/ml葡萄糖，ph值调至6.96)250μl，轻轻颠倒混匀，室温静置30min；向制备次代cef的60mm培养皿中加入上述混合物，37℃，5％co2条件下继续培养。转染细胞培养4h后，配制甘油休克液，对细胞进行休克。配制2.5ml体系如下：

取出细胞培养皿，弃掉培养基，用m199培养基洗涤细胞2～3次；加甘油休克液静置1min；再次用m199培养基清洗细胞2～3次；加适量3％m199培养基(含3％类胎牛血清)；37℃，5％co2条件下培养5～7d，荧光显微镜下观察，挑选带有绿色荧光的病毒蚀斑。

2.5.3重组病毒rhvt-egfp的纯化

荧光显微镜下观察转染细胞，用记号笔标注出带有绿色荧光的病毒蚀斑，胰酶消化法挑取标记的病变细胞，接种于次代cef单层细胞上，37℃，5％co2条件下培养3～4d；重复上述步骤，至所有蚀斑均显示荧光，完全纯化的重组病毒命名为rhvt-egfp。

2.6表达h9亚型aiv重组火鸡疱疹病毒的构建

将重组病毒rhvt-egfp接种于原代cef细胞上，待80％细胞出现特征性病变时，提取细胞基因组，提取步骤同上。依据同源重组原理，将转移载体pfr-h9-ha与rhvt-egfp基因组磷酸钙法转染次代cef细胞，转染方法同上。若rhvt-egfp基因组dna与转移载体在细胞内发生同源重组，即转移载体中ha基因表达盒将重组病毒rhvt-egfp基因组中的egfp表达盒替换，产生新的重组病毒蚀斑将不含有绿色荧光。筛选不带荧光的病毒蚀斑，采用有限稀释法不断筛选纯化，直至培养皿中所有蚀斑均不带有荧光，拯救成功重组病毒命名为rhvt-h9-ha；于2017年1月18日保藏在位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:v201707。

2.7重组病毒的传代及鉴定

2.7.1pcr鉴定

rhvt-h9-ha在cef连续传20代，每隔5代次，以rhvt-h9-ha基因组为模板，以ha-f和ha-r为引物进行pcr，均可扩增出1700bp左右的目的条带，表明ha基因成功插入到hvt基因组中，并未出现基因丢失现象。

2.7.2western-blot试验鉴定

重组病毒rhvt-h9-ha接种原代cef细胞，3～4d后收集病变细胞制备蛋白样品。western-blot检测蛋白表达情况，试验中用h9亚型禽流感病毒阳性血清作为一抗，用hrp标记的羊抗鸡igg作为二抗。试验中设置阴性对照(用rhvt-egfp细胞毒制备蛋白样品)。增强型化学发光法(ecl)显色，结果表明，由接种rhvt-h9-ha的cef制备的蛋白样品可以扩增出预期的特异性条带，而阴性对照样品未出现特异性条带出现。

2.7.3间接免疫荧光试验(ifa)鉴定

将重组病毒rhvt-h9-ha接种于长满单层cef的96孔细胞培养板中，37℃，5％co2条件下培养，待细胞出现典型蚀斑后，将培养液弃掉，用80％丙酮固定10min，pbs洗3次，每个空中加入50μl(1:100稀释)flag单抗，37℃恒温培养箱中孵育1h，用pbs洗3次，每孔加50μlfitc标记抗鼠igg荧光抗体，放置37℃恒温培养箱中孵育1h，用pbs洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，rhvt-h9-ha感染孔出现特异性绿色荧光，而hvt感染孔无荧光，表明rhvt-h9-ha病毒株中ha基因能够正确的表达。

2.8重组病毒对h9亚型aiv的免疫保护评价

将120只1日龄spf鸡随机分成6组，分别为rhvt-us2-h9-ha组、rhvt-us10-h9-ha组、rhvt-us2-h9-ha2组、rhvt-us10-h9-ha2组、灭活疫苗免疫组、攻毒对照组；其中rhvt-us2-h9-ha组于1日龄时通过颈部皮下接种5000pfu保藏编号为cctccno:v201707的重组疫苗、rhvt-us10-h9-ha组于1日龄时通过颈部皮下接种5000pfurhvt-us10-h9-ha、rhvt-us2-h9-ha2组于1日龄时通过颈部皮下接种5000pfurhvt-us2-h9-ha2、rhvt-us10-h9-ha2组于1日龄时通过颈部皮下接种5000pfurhvt-us10-h9-ha2，灭活疫苗免疫组于14日龄时通过肌肉注射接种1羽份的青岛易邦生物工程有限公司灭活疫苗ybf003株，攻毒对照组均接种无菌pbs。各组于28日龄用1×10⁵eld50剂量的h9亚型aiv经滴鼻点眼途径进行攻毒。攻毒后3d、5d，各试验组随机抽取10只鸡采集喉头、泄殖腔棉拭样品，监测各组试验鸡的排毒情况，从表中可以看出rhvt-us2-h9-ha组于攻毒后3d、5d均不排毒，攻毒保护率可达100％，而rhvt-us2-h9-ha2组、rhvt-us10-h9-ha组、rhvt-us2-h9-ha2组有部分鸡排毒，攻毒对照组全部排毒，保护率为0。

每组随机挑选10羽spf鸡，从1日龄开始，每隔7天采血，分离血清用于血凝抑制试验抗体效价的测定；通过抗体效价的监测来揭示鸡群免疫重组疫苗后外源基因在体内的表达水平。

免疫评价结果表明，在hvt基因组的us2区，构建的表达ha基因完整开放阅读框的重组hvt可以提供更好的免疫保护效果。

2.9重组病毒在体外生长特性评价

将hvt亲本毒(fc126株)、表达禽流感ha基因的重组病毒(保藏编号为cctccno:v201707的重组病毒rhvt-us2-h9-ha、rhvt-us10-h9-ha、rhvt-us2-h9-ha2、rhvt-us10-h9-ha2)以100pfu的毒量接种于长满单层细胞的35mmdish中，37℃，5％co2条件下培养，分别在病毒感染的不同时间点(0h，24h，48h，72h，84h和96h)用胰酶消化法收集细胞，检测病毒滴度：用m199培养基将收集的细胞毒定容至1ml，采用有限稀释法对病毒液进行10倍连续稀释，设置6个稀释度；分别接种于长满单层细胞的24孔培养板中，每个稀释度做3个重复；96h后显微镜下观察细胞培养板，计算不同时间点的病毒滴度，从而绘制出hvt和重组病毒在cef上的生长曲线(图8)。结果表明，在us2区构建表达完整ha基因开放阅读框的重组病毒rhvt-h9-ha具有更好的体外生长特性。

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<110>扬州大学青岛易邦生物工程有限公司

<120>一种表达h9亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒株

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