专利名称：一种新亚型CaMKIIα3的基因及克隆方法、表达的蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)，特别是猴脑中一种新亚型CaMKIIα3的基因、克隆方法、鉴定方法及其应用。
背景技术：
钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在大脑组织中大量表达。其表达具有神经细胞特异性和脑区特异性，而且表达量和神经系统发育相关、是构成突触后密度的主要成分。CaMKIIα具有广泛的底物，并具有钙离子依赖活性和自身磷酸化的特性。CaMKIIα在过去的二十多年中成为神经科学家们研究的焦点，并被公认为“记忆分子”。大量实验证据也表明CaMKIIα确实在突触可塑性、LTP等学习与记忆机制中起着重要的作用。随着衰老，CaMKIIα在脑中的表达量和活性明显下降，研究显示CaMKIIα与老年痴呆相关的tau蛋白和淀粉样前体蛋白(APP)的磷酸化有关，并发现在老年痴呆脑中的CaMKII磷酸化水平下降，而且在大脑的海马区表达量也明显下降。
CaMKIIα是CaMKII家族中在进化中出现的最晚的一种亚型，仅存在于鸟类和哺乳动物中。在哺乳动物中，CaMKIIα的序列是高度保守的。在mRNA水平上，大鼠的CaMKIIα的的编码区序列和人的有93％同源性。而在蛋白水平，大鼠和人的CaMKIIα的氨基酸序列是完全一致的。包括CaMKIIα在内CaMKII家族的四种亚型在结构上都具有一定的相似性，即从N端到C端分别为催化区、自主调节区和结合区。CaMKII的各亚型之间的主要区别是位于结合区内的一小段多变区，各亚型的不同异构体也是由于多变区的不同剪切形成的。CaMKII家族成员β、γ、δ亚型均具有多种异构体(分别为8种、13种、15种)，与之不同的是，CaMKIIα在小鼠、大鼠和人类中仅发现3种异构体，而在脑中仅存在两种，分别为CaMKIIα和CaMKIIαB。CaMKIIαB和CaMKIIα的区别在于CaMKIIαB比CaMKIIα在结合区的多变区增加了一段33bp的外显子，即多了11个氨基酸。GenBank中的序列号分别为小鼠CaMKIIα(BC031745)、大鼠CaMKIIα(NM_012920)、人CaMKIIα(BC040457)和人CaMKIIαB(NM_015981)(小鼠、大鼠的CaMKIIαB尚未上传至GenBank)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)亚型CaMKIIα3的cDNA序列，并提供克隆该序列及鉴定该序列是否表达的方法。使其一方面可以用于学习与记忆机制的研究，另一方面CaMKIIα3可作为老年痴呆症的新药物靶标，同时对于大脑疾病、学习记忆相关疾病及老年痴呆症等的基因治疗和药物开发提供新的途径。
本发明的技术方案如下编码钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型CaMKIIα3的基因，其cDNA核苷酸序列如SEQ No1所示，或者编码SEQ No2的氨基酸序列。
钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型蛋白，具有SEQ No2的氨基酸序列。
所述编码钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型CaMKIIα3的基因的克隆方法，包括以下步骤a)提取脑组织总RNA；b)反转录得到cDNA；c)PCR扩增。
其中PCR扩增使用以下一个或多个引物a)5’-AGCCTCACCTGCCTGCCCAGCGCCAGGATG-3’b)5’-GAGGCAGGACGGGGTGACTCCCTGGTCCGA-3’c)5’-TCAGAGAGCACCAACACCACCATCG-3’d)5’-GGATGTAGGCGATGCAGGCTGACTC-3’e)5’-AAGCACCCCTGGATCTCGCACC-3’f)5’-GCAGGCTGACTCGTCGCCCATC-3’含有上述编码钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型CaMKIIα3的基因序列的载体。
含有上述编码钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型CaMKIIα3的基因序列的感受态细胞。
含有上述编码钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型CaMKIIα3的基因及其表达的蛋白用于制备治疗老年痴呆症的药物。
具体方法如下从猴脑组织中提取总RNA，猴脑中CaMKIIα和CaMKIIαB的cDNA序列，GenBank中核酸序列Blast结果显示其和小鼠的CaMKIIα同源性为94％，和大鼠的CaMKIIα同源性为94％，和人的CaMKIIα、CaMKIIαB同源性为98％。而翻译成的氨基酸序列也是完全一致的。该结果进一步证明了CaMKIIα在进化上的高度保守性，但同时也说明，同为高级哺乳动物灵长类的猴和人的CaMKIIα的一致性更高，进化上更相近。
本发明的CaMKIIα3作为一种新的CaMKIIα异构体，也具有和人的CaMKIIα的98％同源性，但相对于人的CaMKIIα缺失了两段共171bp的外显子，即缺失了57个氨基酸。CaMKIIα3和人的CaMKIIα和CaMKIIαB的编码氨基酸序列比对结果如下猴的CaMKIIα3和人的CaMKIIα和CaMKIIαB的编码氨基酸序列比对结果(MultipleSequence Alignment by CLUSTALW网址http//align.genomejp/)Human_CaMKIIα_BMATITCTRFTEEYQLFEELGKGAFSVVRRCVKVLAGQEYAAKIINTKKLSARDHQKLEREHuman_CaMKIIα_ MATITCTRFTEEYQLFEELGKGAFSVVRRCVKVLAGQEYAAKIINTKKLSARDHQKLEREMonkey_CaMKIIα_3 MATITCTRFTEEYQLFEELGKGAFSVVRRCVKVLAGQEYAAKIINTKKLSARDHQKLEREHuman_CaMKIIα_BARICRLLKHPNIVRLHDSISEEGHHYLIFDLVTGGELFEDIVAREYYSEADASHCIQQILHuman_CaMKIIα_ ARICRLLKHPNIVRLHDSISEEGHHYLIFDLVTGGELFEDIVAREYYSEADASHCIQQILMonkey_CaMKIIα_3 ARICRLLKHPNIVRLHDSISEEGHHYLIFDLVTGGELFEDIVAREYYSEADASHCIQQILHuman_CaMKIIα_BEAVLHCHQMGVVHRDLKPENLLLASKLKGAAVKLADFGLAIEVEGEQQAWFGFAGTPGYLHuman_CaMKIIα_ EAVLHCHQMGVVHRDLKPENLLLASKLKGAAVKLADFGLAIEVEGEQQAWFGFAGTPGYLMonkey_CaMKIIα_3 EAVLHCHQMGVVHRDLKPENLLLASKLKGAAVKLADFGLAIEVEGEQQAWFGFAGTPGYLHuman_CaMKIIα_BSPEVLRKDPYGKPVDLWACGVILYILLVGYPPFWDEDQHRLYQQIKAGAYDFPSPEWDTVHuman_CaMKIIα_ SPEVLRKDPYGKPVDLWACGVILYILLVGYPPFWDEDQHRLYKQIKAGAYDFPSPEWDTVMonkey_CaMKIIα_3 SPEVLRKDPYGKPVDLWACGVILYILLVGYPPFWDEDQHRLYQQIKAGAYDFPSPEWDTVHuman_CaMKIIα_BTPEAKDLINKMLTINPSKRITAAEALKHPWISHRSTVASCMHRQETVDCLKKFNARRKLKHuman_CaMKIIα_ TPEAKDLINKMLTINPSKRITAAEALKHPWISHRSTVASCMHRQETVDCLKKFNARRKLKMonkey_CaMKIIα_3 TPEAKDLINKMLTINPSKRITAAEALKHPWISHRSTVASCMHRQETVDCLKKFNARRKLKHuman_CaMKIIα_BGAILTTMLATRNFSGGKSGGNKKSDGVKKRKSSSSVQLMESSESTNTTIEDEDTKVRKQEHuman_CaMKIIα_ GAILTTMLATRNFSGGKSGGNKKSDGVK-----------ESSESTNTTIEDEDTKVRKQEMonkey_CaMKIIα_3 GAILTTMLATRNFSGGKSGGNKKSDGVK-----------ESSESTNTTIEDEDTKV----Human_CaMKIIα_BIIKVTEQLIEAISNGDFESYTKMCDPGMTAFEPEALGNLVEGLDFHRFYFENLWSRNSKPHuman_CaMKIIα_ IIKVTEQLIEAISNGDFESYTKMCDPGMTAFEPEALGNLVEGLDFHRFYFENLWSRNSKPMonkey_CaMKIIα_3 -----------------------------------------------------WSRNSKPHuman_CaMKIIα_BVHTTILNPHIHLMGDESACIAYIRITQYLDAGGIPRTAQSEETRVWHRRDGKWQIVHFHRHuman_CaMKIIα_ VHTTILNPHIHLMGDESACIAYIRITQYLDAGGIPRTAQSEETRVWHRRDGKWQIVHFHRMonkey_CaMKIIα_3 VHTTILNPHIHLMGDESACIAYIRITQYLDAGGIPRTAQSEETRVWHRRDGKWQIVHFHRHuman_CaMKIIα_BSGAPSVLPHHuman_CaMKIIα_ SGAPSVLPHMonkey_CaMKIIα_3 SGAPSVLPH
在本发明的过程中通过取大鼠和狗相同部位组织，提取RNA，设计特异性引物，用RT-PCR的方法进行比较，发现大鼠(Rattus norvegicus)和狗(Canis familiaris)前脑皮层组织中不表达CaMKIIα3，CaMKIIα3仅存在于猴脑中，见附图2。
该结果表明，CaMKIIα3的产生是一种进化上的表现，并推测人脑中也很有可能存在这样一种CaMKIIα3。对于在进化过程中神经系统的进化，高等动物相对于低等动物学习和记忆能力明显增强这一现象，其中存在的机制，一直是神经科学家们研究的焦点，也是一个难点。到现在为止，对于学习和记忆的研究大多还都局限在老鼠上，但是这些研究的最终目的都是为了解开人脑学习和记忆之迷，及寻找治疗神经性疾病的方法。因此，本发明作为“记忆分子”CaMKIIα的一种仅在猴脑中存在的异构体，对于在神经科学领域的学习和记忆机制的研究将有极大的应用价值，并且对于老年痴呆这种神经退行性疾病在人类中多发病，而在小鼠、大鼠中一般不发病这一现象，本发明也有一定的提示作用。
图1为克隆CaMKIIαcDNA为模板PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳图谱，条带1为有CaMKIIα3插入子的克隆，条带2为有CaMKIIα或CaMKIIαB插入子的克隆，条带3为自连接的阴性克隆。
图2为大鼠、狗和猴前脑皮层cDNA为模版的PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳图谱，条带1、2、3分别为大鼠、狗和猴的PCR鉴定结果。
具体实施例方式
实施例1猴脑中总RNA提取1.组织样品的分离在云南版纳灵长类实验动物中心，由专人取成年猕猴的大脑，并将各脑区分离，迅速投入液氮中，冷冻后保存于实验室-70℃冰箱，准备提取组织总RNA。
2.猴脑前脑皮层总RNA提取1)RNA提取前的准备工作玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍，180℃烘烤4小时。
瓷质研钵用自来水反复冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3遍，180℃烘烤4小时。
塑料匀浆头先用自来水反复冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3遍，烘干，再用0.1％DEPC水处理过夜，第二天高压蒸汽灭菌使DEPC灭活，烘干备用。
2)总RNA提取A.匀浆取60～100mg冻存组织在盛有液氮的研钵中，迅速磨成粉末，倒入已加入1mlTrizol(Invitrogen)的EP管中，再用匀浆器打散。匀浆后，4℃12000g离心10分钟。取均一的匀浆液于另一干净的EP管中。
B.分层匀浆液室温静置5分钟，加0.2ml氯仿，盖紧EP管盖，剧烈振荡15秒，再室温静置2～3分钟，4℃12000g离心15分钟，然后小心吸取上清约600μl至另一干净的EP管。
C.RNA沉淀加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10分钟，4℃12000g离心10分钟，可见胶状沉淀，小心弃上清。
D.RNA清洗加1ml75％乙醇，振荡混匀，4℃7500g离心5分钟。
F.重溶RNA小心弃上清，并用枪头吸掉多余上清。空气中干燥5～10分钟。加入20～30μlDEPC处理水重溶。RNA长期贮存于-70℃冰箱。
3)RNA鉴定通过分光光度计测定RNA含量并且用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量。
实施例2 CaMKIIα3cDNA克隆和鉴定1)PCR引物的设计和合成根据GenBank中发表的小鼠CaMKIIα(BC031745)、大鼠CaMKIIα(NM_012920)、人CaMKIIα(BC040457)和人CaMKIIαB(NM_015981)的序列的同源性，运用Primer Premier5.0软件选择性的在CaMKIIα起始密码子ATG和终止密码子TGA附近设计引物对S1、A1，以克隆出全长开放阅读框(CDS)。同时在多变区设计可以在挑选单克隆时鉴定CaMKIIα3的引物对S2、A2。并且跨多变区设计可以鉴定不同物种中CaMKIIα种类的引物对S3、A3。引物序列见下表
2)反转录反应(Reverse Transcription)按Invitrogen M-MLV Reverse Transcription Kit进行反应，反应液组成及反应条件组织总RNA 5μg，Oligo(dT)15(500μg/ml)1μl，dNTP(10mM)1μl，加DEPC处理水补足至12μl，65℃5分钟，迅速冰浴，轻轻离心，收集。在加入5×First-Strand Buffer 4μl，DTT(0.1M)2μl，RNaseOUTTMRecombinant Ribonuclease Inhibitor(40unit/μl)1μl，轻轻混匀，37℃2分钟，加入M-MLVRTaa1μl，枪头轻轻吹打混匀，37℃50分钟，最后70℃15分钟灭活。
3)PCR反应猴脑中CaMKIIαcDNA的克隆以反转录反应所得的cDNA为模板，引物对S1、A1，高保真DNA聚合酶Pyrobest(Takara)，反应程序为94℃5分钟，然后94℃25秒，72℃3分钟，循环5次，再94℃25秒，67℃3分钟，循环20次，最后67℃7分钟。PCR反应结束后取少量反应液进行琼脂糖凝胶电泳，若有1500bp大小目标条带，则进行后续的PCR产物尾部加A反应，以便进行T载体克隆，即在原反应溶液中加入微量DNA聚合酶LA taq(Takara)，72℃反应30分钟。
4)克隆和鉴定PCR反应产物跑胶纯化回收，与pMD18-T(Takara)相连接，连接产物转化感受态DH5α。挑单克隆进行菌落PCR鉴定，用引物对S2、A2，DNA聚合酶Ex taq(Takara)，反应程序为94℃5分钟，然后94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，循环30次，最后72℃10分钟。跑1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，其中有CaMKIIα或CaMKIIαB插入子的克隆，应PCR得到306bp条带，而有CaMKIIα3插入子的应PCR得到135bp条带，见附图一(1为有CaMKIIα3插入子的克隆，2为有CaMKIIα或CaMKIIαB插入子的克隆，3为自连接的阴性克隆)，选取正确克隆进行测序(博亚生物技术有限公司)。经测序得到的CaMKIIα3cDNA序列和编码氨基酸序列如下(1)猴脑中一种新的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)亚型CaMKIIα3的cDNA核苷酸序列1 ATGGCCACCA TCACCTGCAC CCGCTTCACG GAAGAGTACC AGCTCTTCGA GGAATTGGGC61 AAGGGAGCCT TCTCGGTGGT GCGAAGGTGT GTGAAGGTGC TGGCCGGCCA GGAGTATGCT121 GCCAAGATCA TCAACACCAA GAAGCTGTCA GCCAGAGACC ATCAGAAGCT GGAGCGTGAA181 GCCCGCATCT GCCGCCTGCT GAAGCACCCC AACATTGTCC GACTCCATGA CAGCATCTCA241 GAGGAGGGAC ACCACTACCT GATCTTCGAC CTGGTCACTG GTGGGGAACT GTTTGAAGAT301 ATCGTGGCCC GGGAGTATTA CAGTGAGGCG GATGCCAGTC ACTGTATCCA GCAGATCCTG361 GAGGCTGTGC TGCACTGCCA CCAGATGGGG GTGGTGCACC GGGACCTGAA GCCTGAGAAT421 CTGTTGCTGG CCTCCAAGCT CAAGGGTGCC GCAGTGAAGC TGGCAGACTT TGGCCTGGCC481 ATAGAGGTGG AGGGGGAGCA GCAGGCATGG TTTGGGTTTG CAGGGACTCC TGGATACCTC
541 TCCCCAGAAG TGCTGCGGAA GGACCCATAC GGGAAGCCTG TGGACCTGTG GGCTTGTGGG601 GTCATCCTGT ACATCCTGCT GGTTGGGTAC CCCCCATTCT GGGATGAGGA CCAGCACCGC661 CTGTACCAGC AGATCAAAGC CGGCGCCTAT GATTTCCCAT CACCAGAATG GGACACCGTC721 ACCCCGGAAG CCAAGGATCT GATCAATAAG ATGCTGACCA TTAACCCATC CAAACGCATC781 ACAGCTGCTG AAGCCCTTAA GCACCCCTGG ATCTCGCACC GCTCCACCGT GGCATCCTGC841 ATGCACAGAC AGGAGACCGT GGACTGCCTG AAGAAGTTCA ATGCCAGGAG GAAACTGAAG901 GGAGCCATTC TCACCACGAT GCTGGCCACC AGGAACTTCT CCGGAGGGAA GAGTGGGGGA961 AACAAGAAGA GCGATGGTGT GAAGGAATCC TCAGAGAGCA CCAATACCAC CATCGAGGAT1021 GAAGACACCA AAGTGTGGTC CCGGAACAGC AAGCCCGTGC ACACCACCAT CCTGAATCCC1081 CACATCCACC TGATGGGCGA CGAGTCAGCC TGCATCGCCT ACATCCGCAT CACGCAGTAC1141 CTGGACGCCG GCGGCATCCC ACGCACCGCC CAGTCGGAGG AGACCCGTGT CTGGCACCGC1201 CGGGACGGCA AATGGCAGAT CGTCCACTTC CACAGATCTG GGGCACCCTC CGTCCTGCCC1261 CACTGA(2)猴脑中一种新的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)亚型CaMKIIα3，编码有421个氨基酸的蛋白质，分子量47519道尔顿，等电点pI为8.02，其编码氨基酸序列1 MATITCTRFT EEYQLFEELG KGAFSVVRRC VKVLAGQEYA AKIINTKKLS ARDHQKLERE61 ARICRLLKHP NIVRLHDSIS EEGHHYLIFD LVTGGELFED IVAREYYSEA DASHCIQQIL121 EAVLHCHQMG VVHRDLKPEN LLLASKLKGA AVKLADFGLA IEVEGEQQAW FGFAGTPGYL181 SPEVLRKDPY GKPVDLWACG VILYILLVGY PPFWDEDQHR LYQQIKAGAY DFPSPEWDTV241 TPEAKDLINK MLTINPSKRI TAAEALKHPW ISHRSTVASC MHRQETVDCL KKFNARRKLK301 GAILTTMLAT RNFSGGKSGG NKKSDGVKES SESTNTTIED EDTKVWSRNS KPVHTTILNP361 HIHLMGDESA CIAYIRITQY LDAGGIPRTA QSEETRVWHR RDGKWQIVHF HRSGAPSVLP421 H实施例3不同物种中CaMKIIα3表达情况分析用前面所述方法提取大鼠、狗前脑皮层总RNA，反转录出相应的cDNA。分别以大鼠、狗和猴前脑皮层cDNA为模版，引物对S1、A1，高保真DNA聚合酶Pyrobest(Takara)进行PCR反应(反应程序同上)。再以各反应产物的10倍稀释液为模版，引物对S3、A3，DNA聚合酶Ex taq(Takara)，反应程序为94℃5分钟，然后94℃25秒，60℃30秒，72℃30秒，35个循环，最后72℃10分钟。跑2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。其中PCR得到的条带大小应分别是CaMKIIαB519bp，CaMKIIα486bp和CaMKIIα3为315bp。结果见附图二(1、2、3分别为大鼠、狗和猴的PCR鉴定结果)。从结果可以看出仅猴前脑皮层中PCR得到315bp的条带(箭头标出)，而大鼠和狗中仅能得到486bp的主带，说明仅在猴脑中存在CaMKIIα3。同时猴前脑皮层中PCR还得到较亮的大于519bp的CaMKIIαB与CaMKIIα异二聚体条带(*标出)，说明CaMKIIαB在猴脑皮层中的表达量相对大鼠和狗有明显增加。
序列表<110>华东师范大学<120>CaMKIIα新亚型及基因序列和应用<160>2<210>1<211>1266<212>DNA<213>猴<400>1ATGGCCACCA TCACCTGCAC CCGCTTCACG GAAGAGTACC AGCTCTTCGA GGAATTGGGC60AAGGGAGCCT TCTCGGTGGT GCGAAGGTGT GTGAAGGTGC TGGCCGGCCA GGAGTATGCT120GCCAAGATCA TCAACACCAA GAAGCTGTCA GCCAGAGACC ATCAGAAGCT GGAGCGTGAA180GCCCGCATCT GCCGCCTGCT GAAGCACCCC AACATTGTCC GACTCCATGA CAGCATCTCA240GAGGAGGGAC ACCACTACCT GATCTTCGAC CTGGTCACTG GTGGGGAACT GTTTGAAGAT300ATCGTGGCCC GGGAGTATTA CAGTGAGGCG GATGCCAGTC ACTGTATCCA GCAGATCCTG360GAGGCTGTGC TGCACTGCCA CCAGATGGGG GTGGTGCACC GGGACCTGAA GCCTGAGAAT420CTGTTGCTGG CCTCCAAGCT CAAGGGTGCC GCAGTGAAGC TGGCAGACTT TGGCCTGGCC480ATAGAGGTGG AGGGGGAGCA GCAGGCATGG TTTGGGTTTG CAGGGACTCC TGGATACCTC540TCCCCAGAAG TGCTGCGGAA GGACCCATAC GGGAAGCCTG TGGACCTGTG GGCTTGTGGG600GTCATCCTGT ACATCCTGCT GGTTGGGTAC CCCCCATTCT GGGATGAGGA CCAGCACCGC660CTGTACCAGC AGATCAAAGC CGGCGCCTAT GATTTCCCAT CACCAGAATG GGACACCGTC720ACCCCGGAAG CCAAGGATCT GATCAATAAG ATGCTGACCA TTAACCCATC CAAACGCATC780ACAGCTGCTG AAGCCCTTAA GCACCCCTGG ATCTCGCACC GCTCCACCGT GGCATCCTGC840ATGCACAGAC AGGAGACCGT GGACTGCCTG AAGAAGTTCA ATGCCAGGAG GAAACTGAAG900GGAGCCATTC TCACCACGAT GCTGGCCACC AGGAACTTCT CCGGAGGGAA GAGTGGGGGA960AACAAGAAGA GCGATGGTGT GAAGGAATCC TCAGAGAGCA CCAATACCAC CATCGAGGAT1020GAAGACACCA AAGTGTGGTC CCGGAACAGC AAGCCCGTGC ACACCACCAT CCTGAATCCC1080CACATCCACC TGATGGGCGA CGAGTCAGCC TGCATCGCCT ACATCCGCAT CACGCAGTAC1140CTGGACGCCG GCGGCATCCC ACGCACCGCC CAGTCGGAGG AGACCCGTGT CTGGCACCGC1200CGGGACGGCA AATGGCAGAT CGTCCACTTC CACAGATCTG GGGCACCCTC CGTCCTGCCC1260CACTGA 1266
<210>2<211>421<212>PRT<213>猴<400>2Met Ala Thr Ile Thr Cys Thr Arg Phe Thr Glu Glu Tyr Gln Leu Phe Glu Glu Leu Gly 20Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val Lys Val Leu Ala Gly Gln Glu Tyr Ala 40Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu 60Ala Arg Ile Cys Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile Ser 80Glu Glu Gly His His Tyr Leu Ile Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly Glu Leu Phe Glu Asp 100Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp Ala Ser His Cys Ile Gln Gln Ile Leu 120Glu Ala Val Leu His Cys His Gln Met Gly Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn 140Leu Leu Leu Ala Ser Lys Leu Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala 160Ile Glu Val Glu Gly Glu Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly Thr Pro Gly Tyr Leu 180Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly Lys Pro Val Asp Leu Trp Ala Cys Gly 200Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Val Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Arg 220Leu Tyr Gln Gln Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr Val 240Thr Pro Glu Ala Lys Asp Leu Ile Asn Lys Met Leu Thr Ile Asn Pro Ser Lys Arg Ile 260Thr Ala Ala Glu Ala Leu Lys His Pro Trp Ile Ser His Arg Ser Thr Val Ala Ser Cys 280Met His Arg Gln Glu Thr Val Asp Cys Leu Lys Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys 300Gly Ala Ile Leu Thr Thr Met Leu Ala Thr Arg Asn Phe Ser Gly Gly Lys Ser Gly Gly 320Asn Lys Lys Ser Asp Gly Val Lys Glu Ser Ser Glu Ser Thr Asn Thr Thr Ile Glu Asp 340Glu Asp Thr Lys Val Trp Ser Arg Asn Ser Lys Pro Val His Thr Thr Ile Leu Asn Pro 360His Ile His Leu Met Gly Asp Glu Ser Ala Cys Ile Ala Tyr Ile Arg Ile Thr Gln Tyr 380Leu Asp Ala Gly Gly Ile Pro Arg Thr Ala Gln Ser Glu Glu Thr Arg Val Trp His Arg 400Arg Asp Gly Lys Trp Gln Ile Val His Phe His Arg Ser Gly Ala Pro Ser Val Leu Pro 420His 42权利要求
1.编码钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型CaMKIIα3的基因，其特征在于，其cDNA核苷酸序列如SEQ No1所示，或者编码SEQ No2的氨基酸序列。
2.钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型蛋白，其特征在于，具有SEQNo2的氨基酸序列。
3.权利要求1所述基因的克隆方法，包括以下步骤a)提取脑组织总RNA；b)反转录得到cDNA；c)PCR扩增。
4.权利要求3的克隆方法，其特征在于，使用以下一个或多个引物a)5’-AGCCTCACCTGCCTGCCCAGCGCCAGGATG-3’b)5’-GAGGCAGGACGGGGTGACTCCCTGGTCCGA-3’c)5’-TCAGAGAGCACCAACACCACCATCG-3’d)5’-GGATGTAGGCGATGCAGGCTGACTC-3’e)5’-AAGCACCCCTGGATCTCGCACC-3’f)5’-GCAGGCTGACTCGTCGCCCATC-3’。
5.含有权利要求1所述基因序列的载体。
6.含有权利要求1所述基因序列的感受态细胞。
7.权利要求1的基因在制备治疗老年痴呆症药物中的应用。
8.权利要求2的蛋白在制备治疗老年痴呆症药物中的应用。
全文摘要
CaMKIIα新亚型及基因序列和应用，从猴脑皮层组织克隆出的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶IIalpha(CaMKIIα)新的异构体CaMKIIα3，该异构体cDNA编码框全长1266bp，编码有421个氨基酸的蛋白质，分子量47519道尔顿，等电点pI为8.02。CaMKIIα在神经科学学习与记忆机制研究中起着重要作用，被认为是一种“记忆分子”。CaMKIIα的表达量下降和老年痴呆症有关。CaMKIIα3在大鼠和狗前脑皮层中没有发现；作为新的CaMKIIα亚型的异构体，可参与高级哺乳动物的高级神经认知，作为学习记忆相关疾病及老年痴呆症的药物靶标，并为基因治疗和药物开发等提供新的研究方向。
文档编号A61P25/28GK1884550SQ20061002691
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月26日 优先权日2006年5月26日
发明者王露, 胡应和 申请人:华东师范大学