专利名称：丙型肝炎病毒基因(亚)型芯片诊断方法
技术领域：
本发明属免疫学检测领域，具体地是一种应用基因芯片技术对丙型肝炎病毒基因(亚)型进行分型地检测方法。
背景技术：
丙型病毒性肝炎是一种危害极大、流行范围很广大的流行病。目前，全世界的丙型肝炎患者和丙型肝炎病毒携带者的人数已达一亿七千多万，而且还有继续上升的趋势。据报道，丙型肝炎携带者有20％-50％的比例将会导致肝硬化，其中一部分将最终发展为肝癌。
丙型肝炎是一种高变异的正性单链RNA黄病毒，约有9.6kb左右。其基因结构由5’-NCR-C-E1-E2-NS 1-NS2-NS 3-NS4-NS 5-N-CR-3’组成。根据其同源性，丙型肝炎可分为不同的基因型，而每个基因型又可分为不同亚型。目前丙型肝炎的分型法均采用Simmonds分类法。如果以同源性在70％左右，丙型肝炎至少可分为6个基因型，1-6，而所属亚型即在每个基因型后加一个英文小写字母。HCV亚型已超过50个，但最常见的为1a、1b、2a、2b、3a、6a等亚型。许多研究表明，HCV基因型对干扰素治疗的敏感度不一，特别是1b型与其他基因型比较，对干扰素(IFN)反应率最差。
目前，广泛用于临床的HC诊断方法仍是ELISA法。由于其原理是抗原抗体的免疫反应，所以它仅能检测HCV活跃后产生释放如血清中的抗原情况，却不能检测HCV的有无，更不能区分HCV的基因型或基因亚型。
发明内容
本文发明的目的旨在提供一种高特异性、高灵敏度，易于推广使用的基因芯片技术对丙型肝炎及其基因(亚)型进行定型的方法。
本发明的另一个目的是设计一种可以检测丙型肝炎病毒亚型的检测芯片。
本发明的另一个目的在于提出一种生产这种检测芯片的方法。
本发明的另一个目的在于提供了一种利用所述的基因芯片进行HCV检测的方法。
本发明的目的是以下述方法实现的一种丙型肝炎病毒亚型检测方法，应用碱基互补配对的核酸杂交原理，将经过处理的特异性探针固定在修饰过的玻片上，制成HCV分型芯片；然后对HCV阳性血清进行抽提、逆转录、PCR、标记等一系列反应；最后将扩增产物与芯片杂交，根据其在不同探针上的荧光信号判断HCV的基因(亚)型。
其检测系统由多聚酶链反应扩增系统和扩增产物芯片杂交分析系统组成。
图一 不同的循环次数对杂交的影响。其中，A为25个循环的杂交图谱；B为35个循环的杂交图谱。
图二 PCR反应前试剂用UDG酶处理的反应对照图。其中，A图为PCR反应前试剂未用UDG酶处理，杂交后出现了微弱的阳参信号，即产生了假阳性。B图为PCR反应前试剂经过UDG处理后再进行PCR反应，得到的是完全阴性的结果。
图三 不同洗脱温度将得到不同的洗脱效果。A图为40℃洗脱的结果；B图为常温洗脱的结果。
图四 55份血清分型诊断的结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例1 血清抽提取100ul被检血清，加入裂解液200ul，用振荡器充分混匀，置冰上10分钟；加入(酸性)酚∶氯仿(1∶1)300ul，用振荡器充分混匀至无颗粒状态；13000rpm离心10分钟；取出上清200-230ul，加入等体积的预冷异丙醇(-20℃)、1ul tRNA，混匀，13000rpm，0℃离心20分钟；轻轻将液体全部倒掉，在滤纸上沾干残留部分；加入500ul的75％预冷的酒精(-20℃)，颠倒混匀(缓慢)，13000rpm离心5分钟；轻轻倒掉液体，在滤纸上沾干残留部分，室温晾干；用20ul去离子水溶解。实施例2 反转录反应取RT-Mix(13ul/人份)，加入模板(6.5ul/人份)，70℃水浴15分钟，之后立即置于并冰上1分钟；然后加入逆转录酶(0.5ul/人份)，混匀，42℃水浴30分钟，进行反转录反应；75℃灭活15分钟。实施例3 PCR扩增反应取PCR-MIX(20ul/人份)，加入反转录产物(5ul/人份)，进行试剂处理和PCR扩增。试剂处理37℃ 10分钟PCR程序如下 94℃ 5分钟 取标记-MIX(23ul/人份)，进行试剂处理；试剂处理程序37℃ 10分钟94℃ 5分钟加入第一次PCR产物(2ul/人份)，进行标记PCR扩增，标记PCR程序同上。
实施例4 杂交检测反应在各管中分别加入2ul tRNA和2ul鱼精DNA，NaAc2.5ul和无水乙醇50ul；混匀后于-20℃放置30分钟；3000rpm离心15分钟；弃上清，在沉淀中加入300ul预冷的75％酒精(4℃)；13000rpm离心10分钟；弃上清，自然晾干。
以7.5ul去离子水溶解沉淀，加入7.5ul杂交液，混匀；94℃变性3分钟，立即置于冰上；把15ul混合液全部加在点样区，盖上盖玻片，放进杂交舱；把杂交舱置于垫有湿巾纸的铝盒内，48℃杂交30分钟。
用40℃预热的0.1×SSC溶液冲掉盖玻片，使其自然脱落；放入40℃预热的0.2％×SDS+2×SSC中洗25分钟；取出，再放入40℃预热的2×SSC中洗10分钟；避光晾干。
实施例5 扫描、分析结果结果A、不同的循环次数对杂交的影响标记扩增反应分别进行了25个循环和35个循环，杂交结果图一。从扫描所得的荧光值看来，35个循环后所得产物的杂交信号明显强于25个循环的产物。
B、对PCR污染的防治用UDG酶处理PCR试剂，能有效控制PCR反应的污染。PCR反应前试剂未用UDG酶处理，杂交后会出现微弱的阳参信号。若在反应前将试剂经过UDG处理，再进行PCR反应，将得到完全阴性的结果。
C、不同洗脱温度得洗脱效果对同一阳性血清(1b亚型)杂交后的片子进行40℃和室温(约20℃)洗脱，扫描结果见图三。40℃洗脱，只出现1b亚型的特异性探针504；而室温洗脱则出现了很多非特异性的条带，如503、505、506。可见高温洗脱对于提高杂交的特异性是又显著作用的。
实施例6 分型芯片诊断结果共对55份血清进行了抽提、逆转录、扩增、标记、杂交等反应，根据扫描结果，得到结果如图4所示。
权利要求
1.一种新的丙型肝炎分型基因芯片，其特征在于所述的分型基因芯片由检测芯片，反转录试剂，PCR混合物，标记混合物，杂交试剂，洗涤浓缩液，反转录酶，Taq酶，阳性对照和说明书组成。
2.如权利要求1所述的定量分型基因芯片，其特征在于可在体外检测人血清中丙型肝炎病毒的亚型，从而可以应用于丙型肝炎的诊断。
3.如权利要求1所述的分型基因芯片，其特征在于以标记PCR为基础的亚型分类方法。对样品血清首先进行血清抽提，从而抽提出HCV的DNA，再将抽提产物和标记一起加入PCR反应体系中，让它们通过PCR同时扩增，扩增后产物在芯片上杂交，杂交后扫描，通过荧光信号值的处理进行分型分析。
4.一种权利要求1中提到的检测芯片，其特征在于(1)所述的作为检测芯片载体的是玻片；(2)玻片上点有HCV各亚型特征基因片断、空白参照样品。
全文摘要
本发明涉及一种新的丙型肝炎病毒(HCV)分型方法，其分型方法是建立在核酸杂交基础上的，由HCV的5′－UTR和C区两个区域设计一些特异性探针，经过修饰固定在载玻片上，制成HCV的基因(亚)型检测芯片；对HCV阳性血清抽提产物进行逆转录、扩增、标记，将得到的核酸在适当的条件下与HCV基因(亚)型分型基因芯片杂交、扫描，根据得到得信号即可判断出所检测的HCV的基因(亚)型种类。用该方法可快捷地对丙型肝炎亚型作出鉴定，便于丙型肝炎的临床诊断和治疗。
文档编号C12Q1/68GK1405324SQ0112643
公开日2003年3月26日 申请日期2001年8月9日 优先权日2001年8月9日
发明者吴海, 孙晓丰, 陈秋雯, 华兵, 忻定芳 申请人:上海博华基因芯片技术有限公司