一种rs12979860基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体地指一种基于rs12979860位点基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒。
背景技术：
：丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播。现有研究中表明人类IL-28B基因的rs12979860位点多态性与HCV的自发清除、抗病毒治疗的疗效具有相关性。目前，rs12979860位点基因多态性的鉴别方法有多种，主要采用基因测序、基因芯片、高分辨率溶解曲线(HRM)和酶切等方法，但多数操作繁杂、耗时较长、所需仪器设备昂贵、特异性较差，难以在普通医院开展。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种IL28B基因rs12979860位点基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒，该试剂盒具有高灵敏度、高特异性、操作简便、耗时短等特点，可高效地监测rs12979860的C和T等位基因。为实现上述目的，本发明所设计的rs12979860基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒，包括DNA提取液和双色荧光PCR反应液；所述双色荧光PCR反应液包含以下组分：(1)基于rs12979860位点的引物探针组正向引物F，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；反向引物R，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；C荧光探针S1，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；T荧光探针S2，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；(2)PCR扩增体系PCR10×buffer、25mM的MgCl2、dNTPs含dUTP、双组分热启动DNA聚合酶、50×ROXReferenceDye、RNase-FreeddH2O；所述PCR10×buffer内含100mMpH8.8的Tris-HCl、500mM的KCl、0.8％v/v的Nonidet；所述PCR10×buffer不含有Mg2+；所述双组分热启动DNA聚合酶为化学修饰的HotStarTaqDNA聚合酶和抗体修饰的AntiTaqDNA聚合酶。优选地，上述试剂盒中各个引物及探针在扩增体系中的浓度如下：优选地，上述试剂盒的荧光定量PCR扩增条件为95℃5min预热，95℃3s、60℃30s、25个循环，60℃开始收集荧光信号。优选地，上述试剂盒中C荧光探针S1为MGB探针，其5'荧光为FAM；所述T荧光探针S2为MGB探针，其5'荧光为VIC。本发明的有益效果：通过重新设计了引物和TaqMan-MGB探针，优化反应体系，双组分热启动DNA聚合酶构成酶活自动调节系统、ROXReferenceDye可消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，从而实现准确、扩增效率高，灵敏度高、特异性好、重复性好、操作简便且检测用时更短，使该技术能够实现临床上的应用与推广。附图说明图1为DNA测序法检测的IL28B基因rs12979860位点的测序结果图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供了一种rs12979860位点基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒一、试剂盒组成与配制1)引物及探针组基于rs12979860位点的引物探针组正向引物F，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；5'CGGTCGTGCCTGTCGTGT3'；反向引物R，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；5'AGCGCGGAGTGCAATTCA3'；C荧光探针S1，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；5'FAM-ACCCTGGTTCGCGCC-NFQ3'-MGB，FAM探针；T荧光探针S2，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；5'VIC-TGGTTCACGCCTTC-NFQ3'-MGB，VIC探针；上述引物及探针均委托上海生工生物人工合成。2)DNA提取液DNA提取液可以采用市售DNA提取试剂盒，也可以自行配制。本实施例中DNA提取液配方：(1)3％明胶；(2)配制200mmol/LNaCl，100mmol/LTris-HCl；(3)10％SDS3mg/ml蛋白酶K(临用前加入)；(4)pH7.8饱和酚；(5)无水乙醇；(6)70％乙醇；(7)RNase-FreeddH2O。3)双色荧光PCR的反应体系如下：试剂终浓度或单位体积中含量PCR10×buffer5μlMgCl24mmol/LdNTP(含dUTP)0.48mmol/LTaqDNA聚合酶0.5U正向引物F1.5μl反向引物R1.5μlC荧光探针S11.0μlT荧光探针S21.0μlDNA模板5μlddH2O加至50μl总反应体积50μl使用上述试剂盒时，双色荧光PCR的反应程序为：95℃5min预热，95℃3s、60℃30s、25个循环，60℃开始收集荧光信号。试验例1DNA测序验证1、将实施例1中的双色荧光PCR试剂盒，针对50例丙肝患者的全血样本DNA进行双色荧光PCR，结果见表1。将上述稀释品利用双色荧光PCR的反应体系扩增，扩增条件为95℃5min预热，95℃3s、60℃30s、25个循环，60℃开始收集荧光信号。表1rs12979860位点SNP类型测试结果比较2、设计测序引物对50份样本DNA的rs12979860位点的3种基因型进行测序，与上述试剂盒检测结果一致。图1为DNA测序法检测的rs12979860位点的C/C、C/T和T/T型的三种基因型。SEQUENCELISTING<110>武汉大学<120>一种rs12979860基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒<130>2016<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1cggtcgtgcctgtcgtgt18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2agcgcggagtgcaattca18<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>3accctggttcgcgcc15<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>4tggttcacgccttc14当前第1页1 2 3