专利名称：：用于癌症预后和病理分期的试剂和方法用于癌症预后和病理分期的试剂和方法本申请要求2006年2月16日提交的美国临时申请系列号NO.60/774,563的优先权，将其通过引用并入本文。
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：1.发明领域本发明涉及用于评估个体中结肠直肠癌症发展(progression)的试剂和方法。更具体地，本发明提供了用于测定或诊断癌症的发展或病理分期(pathologicalstaging)以更精确地修整(tailor)对个体的治疗的所述试剂和方法。本发明还涉及用于监测和分析生物样品的EGFR途径的生物标记物的任一种或信息性组合的定量表达和活化的免疫试剂和方法，所述生物标记物包括EGFR、PTEN、pHERl、pAKT、pERK、pMEK和Ki67。2.
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：癌症治疗的基本目标是选择性地杀死或抑制恶性细胞的不受控制的生长而不有害地影响正常细胞。传统的化学治疗药物是高度细胞毒性的试剂，其优选的对恶性细胞具有比正常细胞更大的亲和性，或至少根据恶性细胞的高细胞生长速度和代谢活性优先地影响恶性细胞。然而，证明这些试剂不是"魔术子弹"，并常常损害正常细胞以及癌细胞；相反地，某些癌症产生出正常细胞不会产生的对所述化学治疗剂的抗性。可以靶向恶性细胞并不伤害正常细胞的癌症治疗被称为靶向治疗，是癌症化学治疗的新浪潮。这种新的方法与治疗实体肿瘤癌症是特別相关的，实体肿瘤癌症保持了需要具有较少副作用的灵活和应答性(responsive)治疗的慢性病症，它们的发展需要被研究。一般地，靶向癌症治疗试图通过干扰特异于癌发生的分子或细胞内途径来阻断癌细胞的生长和散布，因而不伤害非癌细胞。这些试剂的作用与传统的化学治疗剂或化学预防剂截然不同(incontradistinction)，传统的化学治疗剂或化学预防剂用于产生癌细胞或前癌细胞的生长延滞、末端分化和细胞死亡，但也能阻断正常细胞的发育。然而，难以开发用于靶向治疗的鲁棒(robust)诊断的候选生物标记物，这部分是由于正常细胞和癌细胞表达的受体和配体的多样性，并得到来自受体信号转导的可变的结果。几种信号转导途径已显示为了解和治疗肿瘤发生的重要标靶；这些包括生长因子信号转导途径。所述生长因子途径调节响应于细胞内和环境信号(cue)的细胞生长和新陈代谢。这些信号转导途径在癌症中通常被改变或异常调节，导致不受控生长的表型和周围组织的侵入。在癌症诊断和治疗中的细胞生长的关键决定因素和活性研究的目标是表皮生长因子(EGF)和它的受体(EGFR)。EGF是活化蛋白质受体酪氨酸激酶(RTK)活性来启动信号转导级联，引起细胞生长、增殖和分化发生改变的生长因子。已知EGF和它的下游靶物(在图1中说明)，包括ras/raf、mek和erk涉及不同癌症的发病和发展。这种途径和它的信号转导分子提供了治疗介入的吸引人的目标，这样的方法正在开发中(Stadler,2005,Cancer,104:2323-33;Normanno,等，2006，Gene,366:2-16》把向EGF和它的受体的试剂包括bevacizumab、PTK787、SU011248和BAY43-9006。也已经显示了BAY43-卯06抑制EGF途径中的下游目标，包括raf、mek和erk(Stadler,2005Cancer,Id.)。这种受体系统还涉及许多人实体肿瘤，包括肺、乳腺、前列腺、结肠、卵巢、头和颈的发生和发展。HER1/EGFR是四种受体的家族的成员{EGFR(也称为HER1或ErbBl)、ErbB2(HER2/neu)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)}。受体存在于细胞质膜中，并包括外部的配体结合域、跨膜域和内部酪氨酸激酶域。配体的结合触发受体二聚作用和内部受体域的自动磷酸化。这启动了细胞反应的级联，其影响细胞分裂和细胞生长的许多其它方面。EGF受体的活性增高，无论是由提高的配体浓度、受体数量或由受体突变引起的，都可以引起提高的细胞增殖。现在有明显的证据显示HER1/EGFR系统可以介导多种实体肿瘤的建立和发展。虽然一些研究已经检查了EGF途径在癌症的控制和治疗中的作用，关于在肿瘤发展和转移期间这个途径中的改变了解很少。EGFR途径中下游效应物的微妙改变可以根据特别是肿瘤类型、阶段(stage)和单独的组成来提供治疗介入的独特和灵活的靶点。这种改变可能对恶性肿瘤的诊断和治疗具有显著的影响。传统的治疗癌症方式已经根据来自大规模试验的结果来开发，并且依靠各种各样的患者和肿瘤的预示性结果。修整对单独的患者、肿瘤和病理分期(示于图2)的治疗的能力可以提供具有较少副作用的、对恶性肿瘤的更有效的治疗。此外，监测癌症治疗的发展并因而调整治疗的能力将允许响应于先前使用来自大批患者的数据开发的治疗方式对个体差异的更快速的反应。本领域需要开发诊断性生物标记物以容许在癌症治疗之前或期间筛选和快速检测各种细胞内信号转导分子中的改变，从而快速地诊断癌症阶段并监测针对EGFR途径的治疗的效果。还需要针对EGFR途径的抑制物的改善的鉴定方法。
发明内容本发明提供了在患有癌症的个体中评估肿瘤发展的试剂和方法，特别是其中所述方法用于确定肿瘤阶段和评估抗癌治疗的效力。本发明还提供了为患者提供个体化的抗癌治疗和对治疗的反应的方法，其中根据使用本发明的方法确定的肿瘤类型和阶段将特定的治疗施用于个体患者，根据患者对所述治疗的个体反应维持或改变治疗。在第一个方面，本发明提供了试剂，特别是免疫学试剂，以及评估个体中肿瘤发展、特别是结肠直肠癌症发展的方法。在这个方面，分析来自患者的含有组织或肿瘤细胞的样品来检测一种或多种生物标记物的表达、磷酸化，或表达和磷酸化两者的模式(pattern)。在具体的实施方式中，所述生物标记物是EGF代谢途径的成员，包括但不限于EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67。在这些实施方式中，评估肿瘤发展，其中一种或多种(特别是多种)这些生物标记物的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者的模式基本上类似于来自具有所述肿瘤的发展确定阶段的组织或细胞样品的一种或多种(特别是多种)这些生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式。在可选择的实施方式中，本发明提供了试剂，特别是免疫学试剂，以及评估个体中肿瘤发展、特别是结肠直肠癌症发展的方法。在这个方面，分析来自患者的含有组织或肿瘤细胞的样品来检测一种或多种生物标记物的表达、磷酸化，或表达和磷酸化两者的模式。在具体的实施方式中，所述生物标记物是EGF代谢途径的成员，包括但不限于EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67。在这些实施方式中，评估肿瘤发展，其中一种或多种(特别是多种)这些生物标记物的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者的模式不同于来自包含正常细胞而不是肿瘤细胞的非肿瘤组织或细胞样品的一种或多种(特别是多种)这些生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式。本发明的试剂和方法的优选的用途是用于评估结肠直肠癌的临床阶段，其中包含所述表达、磷酸化、或表达和磷酸化的模式的生物标记物包括EGFR、PTEN、pMEK、Ki67和pHERl。还落入本发明的这些方面的范围内的是测量编码EGFR的基因组DNA的基因扩增的其它步骤。在某些实施方式中，这些分析检测基因组的编码EGFR的DNA中平衡的二体性(balanceddisomy)。在这些方面中，组织样品优选地是小的腺瘤或腺瘤性息肉。具体地，在这些实施方式中，本发明提供了表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者的模式，其中相比非肿瘤组织或细胞样品中这些生物标记物的表达、磷酸化、.或表达或磷酸化两者的水平，EGFR的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者被提高；PTEN的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者被提高；pMEK的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者被降低。在其它实施方式中，所述肿瘤是腺癌。具体地，在这些实施方式中，本发明提供了表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者的模式，其中相比小的腺瘤组织或细胞样品中这些生物标记物的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者的水平，PTEN的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者被降低；pMEK的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者被提高。这些实施方式可包括处于它们的范围内的测量编码EGFR的基因组DNA的基因扩增的其它步骤。在某些实施方式中，这些分析检测基因组的编码EGFR的DNA中平衡的二体性和平衡的三体性(trisomy)。在更进一步的实施方式中，来自患者的组织样品是恶性样品，而本发明提供了表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者的模式，其中相比小的腺瘤组织或细胞样品中这些生物标记物的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者的水平，PTEN的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者被降低，以及pMEK的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者被提高。这些实施方式可包括处于它们的范围内的测量编码EGFR的基因组DNA的基因扩增的其它步骤。在某些实施方式中，这些分析检测基因组的编码EGFR的DNA中平衡的二体性和平衡的多体性(polysomy)。在优选的实施方式中，包含在本发明的方法中检测到的模式的、所述生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的这些模式通过免疫组织化学或原位杂交来检测。在优选的实施方式中，所述方法包括在使用标记的特异性结合试剂(优选免疫学试剂)染色之后利用组织切片的计算机辅助图像分析来有利进行的分析。在本发明的方法的实施中提供了用于鉴定对一种或组合的特定化学治疗剂有反应的、带有肿瘤，特别是结肠直肠癌症肿瘤的个体的方法。在这些实施方式中，本发明的方法用于检测一个或多个生物标记物的表达、磷酸化、或表达或磷酸化两者的模式。在某些实施方式中，所述肿瘤是结肠直肠癌症，而所述生物标记物包括但不限于EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67。在本发明的方法的有利实施方式中，表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式鉴定出对一个或组合的化学治疗剂是应答性的肿瘤。在具体的实施方式中，本发明的方法对于鉴定对化学治疗剂是应答性的肿瘤样品是有用的，所述化学治疗剂包括但不限于EGFR抗体或激酶抑制物，或EGFR抗体和激酶抑制物两者。在其它的方面，本发明提供了用于实施本发明的方法的试剂盒。在有用的实施方式中，所述试剂盒包括至少两种试剂，优选特异结合试剂和更优选免疫学试剂，用于检测在人肿瘤样品中关于肿瘤发展或化学治疗剂应答性为信息性的生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者。在某些实施方式中，所述至少两种试剂对于检测生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者是有用的，所述生物标记物包括但不限于EGFR、pEGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67。在某些实施方式中，所述至少两种生物标记物是PTEN和pMEK。在某些实施方式中，所述试剂盒包括用于检测至少三种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的试剂，所述生物标记物优选地包括^f旦不限于EGFR、pEGFR、PTEN、pMEK、pERK或Ki67。在某些实施方式中，所述至少三种生物标记物是EGFR、PTEN和pMEK。在可选择的实施方式中，所述试剂盒包括用于检测EGFR、pEGFR、PTEN、pMEK、pERK或Ki67的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的试剂。本发明的试剂盒的某些实施方式还包括用于检测编码EGFR的基因组DNA的基因扩增的试剂。本发明的所述试剂盒的每个实施方式有利地还包括在实施本发明的方法中使用所述试剂盒的说明。根据以下某些优选的实施方式的更详细的说明和权利要求，本发明的特别优选的实施方式将变得明显。本专利或申请文件含有至少一幅以彩色制作的图。带有彩色图的本申请或专利申请出版物的拷贝将在请求和支付了必要的费用时由官方提供。图1是EGFR途径的示意图。图2是结肠直肠的结肠发展的示意图。图3是CHTN结肠直肠癌症发展的苏木色素和曙红(H&E)染色的代表的显微照片。图3A是最大尺寸《cm的腺瘤的代表性H&E染色。图3B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的代表性H&E染色。图3C是原发性浸润性(primaryinvasive)病理阶段T1或T2的肺瘤样品的代表性.H&E染色。图3D是原发性浸润性病理阶段T3或T4的肿瘤样品的代表性H&E染色。图3E是向淋巴结转移性的结肠直肠腺癌的代表性H&E染色。图3F是向远端位点(distantsite)转移性的结肠直肠腺癌的代表性H&E染色。图4呈现了从合作人组织网络(CooperativeHumanTissueNetwork,CHTN)获得的结肠直肠发展组织微阵列(TMA;CHTN2003CRCProg)的图。图5呈现了组织化学组织评定的结果；呈现了通过IHC分析的结肠直肠组织样品中ptyr表达，表示为平均的阳性百分比。图6是结肠直肠癌症发展的代表性EGFR表达水平的显微照片。图6A是最大尺寸〈2cm的腺瘤的EGFR染色的代表性图像(C10);样品具有100%百分比阳性细胞质/膜染色的3+的分值。图6B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的EGFR染色的代表性图像(F5);样品具有100%百分比阳性细胞质/膜染色妁3+的分值。图6C是原发性浸润性病理分期Tl或T2的肿瘤样品的EGFR染色的代表性图像(E4);样品具有100%百分比阳性细胞质/膜染色的3+的分值。图6D是原发性浸润性病理分期T3或T4的肿瘤样品的EGFR染色的代表性图像(H10);样品具有卯°/。百分比阳性细胞质/膜染色的3+的分值。图6E是向淋巴结转移性的结肠直肠腺癌的EGFR染色的代表性图像(J20);样品具有85%百分比阳性细胞质/膜染色的2+的分值。图6F是向远端位点转移性的结肠直肠腺癌的EGFR染色的代表性图像(B13);样品具有1%百分比阳性膜染色的1+的分值。图7是结肠直肠癌症发展的代表性PTEN表达水平的显微照片。图7A是最大尺寸〈2cm的腺瘤的PTEN染色的代表性图像(C4);样品具有80%百分比阳性细胞质染色的3+的分值。图7B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的PTEN染色的代表性图像(F3);样品具有75。/。百分比阳性细胞质染色的l+的分值。图7C是原发性浸润性病理分期Tl或T2的肿瘤样品的PTEN染色的代表性图像(E2);样品具有80%百分比阳性细胞质染色的2+的分值。图7D是原发性浸润性病理分期T3或T4的肿瘤样品的PTEN染色的代表性图像(H4);样品具有40%百分比阳性细胞质染色的l+的分值。图7E是向淋巴结转移性的结肠直肠腺癌的PTEN染色的代表性图像(J18);样品是阴性的。图7F是向远端位点转移性的结肠直肠腺癌的PTEN染色的代表性图像(B7);样品是阴性的。图8是结肠直肠癌症发展的代表性pMEK表达水平的显微照片。图8A是最大尺寸〈cm的腺瘤的pMEK染色的代表性图像(CM);样品具有10%百分比阳性细胞质染色的l+的分值。图8B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的pMEK染色的代表性图像(F3);样品具有70%百分比阳性细胞质染色的l+的分值。图8C是原发性浸润性病理分期Tl或T2的肿瘤样品的pMEK染色的代表性图像(E2);样品具有80%百分比阳性细胞质染色的1+和10%百分比阳性核染色的l+的分值。图8D是原发性浸润性病理分期T3或T4的肿瘤样品的pMEK染色的代表性图像(H4);样品具有100%百分比阳性细胞质染色的2+和5%百分比阳性核染色的2+的分值。图8E是向淋巴结转移性的结肠直肠腺癌的pMEK染色的代表性图像(J18);样品是具有100%百分比阳性细胞质染色的3+的分值。图8F是向远端位点转移性的结肠直肠腺癌的pMEK染色的代表性图像(B7);样品具有100%百分比阳性细胞质染色的2+和15%百分比阳性核染色的3+的分值。图9是结肠直肠癌症发展的代表性Ki67表达水平的显微照片。图9A是最大尺寸〈2cm的腺瘤的Ki67染色的代表性图像(C4);样品具有10%百分比阳性核染色的2+的分值。图9B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的Ki67染色的代表性图^f象(F3);样品具有25%百分比阳性核染色的2+的分值。图9C是原发性浸润性病理分期Tl或T2的肿瘤样品的Ki67染色的代表性图像(E2);样品具有85%百分比阳性核染色的2+的分值。图9D是原发性浸润性病理分期T3或T4的肿瘤样品的Ki67染色的代表性图像(H4);样品是具有40%百分比阳性的2+和15%百分比阳性核染色的3+的分值。图9E是向淋巴结转移性的结肠直肠腺癌的Ki67染色的代表性图像(J10);样品具有45%百分比阳性核染色的3+的分值。图9F是向远端位点转移性的结肠直肠腺癌的Ki67染色的代表性图像(B7);样品具有70%百分比阳性细胞质染色的2+的分值。图IO是来自单个个体病例(男性，71岁)的结肠直肠癌症发展的生物标记物表达水平的代表性显微照片。图10A是最大尺寸〈2cm的腺瘤；最大尺寸〉2cm的腺瘤、原发性浸润性病理分期T3或T4的肿瘤；向淋巴结转移性的结肠直肠腺癌的代表性免疫组织化学(IHC)图像。使用了对EGFR、pHERl、PTEN、pAKT、pMEK和Ki67反应性的抗体。图10B显示了图形形式的结果，都使用了计算机辅助图像分析(A)和病理分值(B)的结果。图11显示在结肠直肠癌症发展期间EGFR表达途径中生物标记物评定的概述，如使用图像分析测定的。结果显示为平均分值中的％改变。图12是使用用于表皮生长因子受体(五G^i，红色)；染色体7(CEP7，绿色)的探针在原位杂交分析中的双色荧光的显微照片。图12A显示了平衡的二体性；图12B显示了平衡的三体性，图12C显示了平衡的多体性，图12D显示了基因扩增。图13是结肠直肠癌症发展中EGFRFISH基因检测的显微照片。图13A是最大尺寸〈2cm的腺瘤的代表性EGFRFISH基因检测，其是平衡的二体性。图13B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的代表性EGFRFISH基因检测，其是平衡的二体性。图13C是原发性浸润性病理分期Tl或T2的肿瘤样品的代表性EGFRFISH基因检测，其是平衡的二体性。图13D是原发性浸润性病理分期T3或T4的肺瘤样品的代表性EGFRFISH基因检测，其是平衡的多体性。图13E是向淋巴结转移性的结肠直肠腺癌的代表性EGFRFISH基因检测，其是平衡的多体性。图13F是向远端位点转移性的结肠直肠腺癌的代表性EGFRFISH基因检测，其显示了基因扩增二体性。图14是结肠直肠癌症中EGFR表达水平的显微照片。图14A显示了20X扫描通道(scanpass)的两个区域(区域1和区域2);图14B显示了两个区域的EGFR组合分值(ARIOL)的结果。图15是结肠直肠癌症中HER2表达水平的显微照片。图15A显示了20X扫描通道的两个区域(区域1和区域2);图15B显示了两个区域的HER2组合分值(ARIOL)的结果。图16是结肠直肠癌症中pAKT表达水平的显微照片。图16A显示了20X扫描通道的两个区域(区域1和区域2);图16B显示了两个区域的pAKT组合分值(ARIOL)的结果。图17是结肠直肠癌症中Ki67表达水平的显孩i吸片。图17A显示了20X扫描通道的两个区域(区域1和区域2);图17B显示了两个区域的Ki67組合分值(ARIOL)的结果。图18是结肠直肠癌症中存活蛋白(Survivin)表达水平的显微照片。图18A显示了20X扫描通道的两个区域(区域1和区域2);图18B显示了两个区域的存活蛋白组合分值(ARIOL)的结果。图19是结肠直肠癌症中VEGF表达水平的显微照片。图19A显示了20X扫描通道的两个区域(区域1和区域2);图19B显示了两个区域的VEGF组合分值(ARIOL)的结果。图20显示了银原位杂交的示意图。优选实施方式的详细说明本发明提供了用于评估个体(包括癌症患者)中结肠直肠癌症发展的方法。此外，本发明提供了用于评估结肠直肠癌症发展的预示性生物标记物。此外，此外，本发明提供了用于评估结肠直肠癌症发展的试剂盒。与在外科手术后进行化学治疗药物治疗作为外科手术的辅助(adjunct)的传统抗癌方法相比，新佐剂(或原始(primary))化疗包括施用药物作为某些癌症患者中的初始治疗。这种方法的一个益处是，由于化疗的肿瘤收缩效应，对于超过3cm的原发肿瘤，它允许对大部分患者的保守性外科操作(与例如乳腺癌患者中的根治性乳房切除术相对)的稍后的或伴随的使用。另一个优点是对于许多癌症，在所有患者的大约三分之二中实现了部分的或完全的应答。最后，因为在两到三个周期的化学治疗处理之后大部分患者是应答性的，因此有可能监测所采用的化学治疗方案的体内效力，来鉴定肿瘤对化学治疗处理是非应答性的患者。非应答性肿瘤的及时鉴定容许临床医师来限制癌症患者暴露于不必要的治疗副作用并开始选择性的治疗。不幸地，本领域中当前的方法(包括组织学检查)不足以用于这种及时和精确的鉴定的最佳应用。本发明提供了用于开发更为信息性和有效的治疗方案的方法，所述治疗方案施用于癌症患者时，有效结果(即，减少或消除肿瘤)的可能性提高。癌症诊断，疾病的初步诊断和随后疾病过程的监测(在治疗之前、期间或之后)通常通过从患者取出的细胞或组织样品的组织学检查来确认。临床病理学家需要能够精确地确定这些样品是良性还是恶性的，以及区分视为恶性的肿瘤样品的侵略性，因为这些测定通常形成了选择患者治疗的适合过程的基础。类似地，病理学家需要能够检测癌症已生长或已进入緩解的程度，特别组织学检查通常需要(entail)组织染色操作，其允许样品的形态特征在光学显微镜下容易地观察。病理学家在检查染色的样品之后，一般进行肿瘤样品是否是恶性的定性测定。然而，仅仅通过样品的组织学检查来确定肿瘤的侵略性是困难的，因为肿瘤的侵略性通常是肿瘤内细胞的生物化学的结果，例如蛋白质表达或抑制和蛋白质磷酸化，其可能或可能不由样品的形态反映。因而，重要的是能够评估肿瘤样品内细胞的生物化学。此外，希望的是能够观察和定量肿瘤相关基因或蛋白质的基因表达和蛋白质磷酸化，或更特别的是肿瘤相关信号转导途径的细胞成分。癌症治疗可以基于胂瘤的分子分布而不仅仅是它们的组织学或疾病的位点。阐明肺瘤组织中靶向治疗的生物学效果并将这些效果与临床应答相关联有助于鉴定肿瘤中起作用的优势生长和存活途径，从而确定了可能的应答物的模式，并反之提供了用于设计策略以克服抗性的理论。例如，生长因子受体的成功的诊断性靶向必须通过所述治疗不靶向的其它受体来确定肿瘤生长或存活是否受到靶向的受体或受体家族的驱动，以及下游的信号转导是否表明涉及另一种致癌途径。此外，当暗示了超过一种信号转导途径时，那些信号转导途径的成员可以用作诊断目标以确定双抑制物治疗是否将是或者是有效的。为了使化疗有效，药物应当破坏肿瘤细胞并且不伤害正常的体细胞，特别是可邻近或接近肿瘤的那些正常细胞。特别地，通过使用影响主要在癌症细胞中而不在正常细胞中发生的细胞活性的药物，可以实现这一点。本领域已知的自动化的(计算机辅助的)图象分析系统可以增强肿瘤样品的视觉检查。在代表性实施方式中，将细胞或组织样品暴露于对特定的生物标记物是特异性的可检测标记的试剂，然后通过计算机处理细胞的放大的图像，计算机从电荷耦合器件(CCD)或照相机例如电视摄像机接收图像。这种系统可以用于，例如，才企测和测量样品中EGFR、ptyr、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或KI67、或任何其它诊断生物标记物的表达和活性水平。因而，本发明的方法提供了更精确的癌症诊断和组织学鉴定的癌细胞中更好的基因表达特征，最特别的是关于肿瘤标记物基因或已知在特定癌症类型和亚型(例如具有不同程度的恶性肿瘤)中表达的基因的表达。这种信息允许施用更为信息性和有效的治疗方案，因为可将对某些肿瘤类型或亚型具有临床效力的药物施用于其细胞被这样鉴定出的患者。常规抗癌治疗的另一个缺点是特定化学治疗剂在治疗个体人患者中的特定癌症方面的效力是不可预测的。鉴于这种不可预测性，本领域不能够在开始治疗之前确定一种或多种选定的试剂是否将在个体患者中作为抗肿瘤试剂是活性的、或提供精确的预后或治疗过程。这是特别重要的，因为特定的临床癌症可能为临床医师提供了治疗方案的选择，而无评估哪种方案对于特定个体将是最有效的任何目前的方法。本发明的方法的优势是它们能够更好地评估提出的治疗试剂(或试剂的组合)在个体患者中预期的效力。所要求保护的方法对于其它原因也是有益的，所述原因是它们在化学治疗方案效力的评估中是有时间和成本效率的，并且对癌症患者是最d、外伤性的。使用本发明的方法来检测和定量多肽的表达和磷酸化的模式。更具体地，使用本发明的方法来检测和定量作为肿瘤相关信号转导途径的细胞成分的多肽的表达和磷酸化模式。例如，可以使用特异于所述多肽的生物检测试剂(包括但不限于抗体)来检测多肽的表达和磷酸化的模式。作为选择，生物检测试剂可以是核酸探针。如本文公开的发明性方法所使用的，将核酸探针定义为一种或多种核酸片段的集合，所述核酸片段与样品的杂交可以被检测。探针可以是未标记的或标记的，从而其与靶物或样品的结合可以被检测。探针产生自来自基因组的一个或多个特定(预选的)部分的核酸来源，例如一个或多个克隆、分离的完整染色体或染色体片段、或聚合酶链式反应(PCR)扩增产物的集合。核酸探针也可以是固定在固体表面(例如，硝化纤维、玻璃、石英、蒸汽沉积二氧化硅(flimedsilica)载玻片)上的分离的核酸，如在阵列中。探针可以是例如WO96/17958中描述的核酸的阵列的成员。能够产生高密度阵列的技术也可以用于这个目的(参见，例如，Fodor,1991,5We"ceX:767-773;Johnston,1998,Cwk肠/.旦R171-R174;Schummer,1997,脂ec—腦21:1087-1092;Kern,1997,5Zofec/7w々wey21:120-124;U.S.Pat.No.5,143,854)。技术人员将认识到，可将特定探针的确切序列修饰到一定程度来产生"基本上相同的"、但保持了与衍生它们的探针的相同靶物或样品的特异性结合(即，特异性杂交)能力的探针。术语"核酸"是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。该术语包括核酸，例如，寡核芬酸，含有天然核苷酸的已知类似物，所述类似物对于期望的目的具有与参考核酸相似或改进的结合性质。该术语还包括核酸，所述核酸以类似于天然存在的核苷酸的方式、或以对于期望的目的改进的速率被代谢。该术语还包括具有合成的骨架的核酸样结构。通过参考例如涉及结肠癌细胞的筛选的美国专利6,326,148，技术人员将知道如何使用核酸探针用于筛选样品中的癌细胞。可使用针对直接检测的生物标记物(包括但不限于EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、p、pERK或Ki67)的合适的初级抗体，或使用适当的二级抗体(例如当使用小鼠初级抗体时为兔抗小鼠IgG)和/或第三抗生物素蛋白(或抗生蛋白链菌素(Strepavidin))生物素复合物("ABC")通过图像分析来定量与癌症相关的多肽。如本文例示的在本发明方法的实施中有用的试剂的实例包括免疫学试剂。"免疫学试剂，，是指抗体，特别包括多克隆抗血清和单克隆抗体。可通过用于合成抗体的本领域已知的任何方法(包括化学合成或重组表达技术，或优选使用常规的免疫学方法)来产生本发明的抗体。如本文使用的，术语"抗体"包括但不限于天然存在的和非天然存在的抗体。如本文使用的，术语"抗体"意图广泛地涉及任何免疫学结合试剂，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。一般地，IgG和/或IgM是优选的，因为它们是生理学情况中最常见的抗体，并且因为它们是在实验室环境中最容易制造的。更具体地，术语"抗体"包括多克隆和单克隆抗体，以及它们的抗原结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2片段。此外，术语"抗体"包括嵌合抗体和完全合成的抗体，包括遗传工程化的抗体，和它们的片段。多克隆和单克隆抗体可以是"纯化的"，其是指所述多克隆和单克隆抗体不含任何其它的抗体。制备多克隆和单克隆抗体的方法是本领域公知的(参见，例如，Sambrook等，1989，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,SecondEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.;andHurrell(Ed,),MONOCLONALHYBRIDOMAANTIBOD正S:TECHNIQUESANDAPPLICATIONS,CRCPress,Inc.,BocaRaton，Fla.,通过引用将其并入本文)。对本领域普通技术人员显而易见的是，多克隆抗体可以产生自各种温血动物，例如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠和大鼠。可以通过使用佐剂例如弗氏佐剂(完全的和不完全的)、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔戚血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin)、二硝基酚和潜在有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和短'J、棒杆菌(corynebacteriumparvum)来增加抗原性表位的免疫原性。这些佐剂也是本领域公知的。例如在Tijssen(1987，PRACTICEANDTHEORYOFENZYMEIMMUNOASSAYS,3rdEd.，Elsevier:NewYork)中公开了关于佐剂和免疫分析的各个方面的信息。涉及制备多克隆抗血清的方法的其它有用的参考文件包括Microbiology(1969，HoeberMedicalDivision,HarperandRow);Landsteiner(1962,SPECIFICITYOFSEROLOGICALREACTIONS,DoverPublications:NewYork),和Williams等(1967，METHODSINIMMUNOLOGYANDIMMUNOCHEMISTRY，Vol.1,AcademicPress:NewYork)。在多克隆抗体的生产中使用的免疫原组合物的数量根据免疫原的性质以及用于免疫的动物而改变。可使用多种的途径施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可以通过在免疫后各个点采样免疫的动物的血液来监测多克隆抗体的产生。也可以给予第二次强化剂(booster)注射。重复强化和滴定的过程直到实现适合的滴度。当获得期望水平的免疫原性时，可将免疫的动物放血，分离血清并保存。可以直接使用从使用标准方法免疫的动物产生的血清，或者可以使用标准方法例如血浆分离术(plasmaphoresis)或用IgG-特异性吸附剂如固定的蛋白质A的吸附层析来从血清中分离IgG级分。可根据已知的方法通过裂解和收集期望片段来从相应的抗体产生抗体片段，例如F(ab')2和Fab片段(参见，例如Andrew等，1992，"FragmentationofImmunoglobulins"inCURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,Unit2.8，GreenePublishingAssoc.andJohnWiley&Sons)。作为选择，可以根据公知的技术，例如通过引用并入本文的在美国专利No.4，196，265中例示的那些来制备针对本发明的抗原性肽的单克隆抗体。通过公知的技术来产生针对本发明的抗原性肽产生单克隆抗体的杂交瘤。通常，本方法包括永生细胞系与产生期望抗体的B-淋巴细胞融合。永生细胞系通常是转化了的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。啮齿动物例如小鼠和大鼠是优选的动物，然而，使用兔或羊细胞也是可能的。小鼠是优选的，BALB/c小鼠是最优选的，因为它是最常使用的并且一般得到更高百分比的稳定的融合物。般地，如果采用的是人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(PBL)，或使用来自非人哺乳动物来源的脾脏或淋巴结细胞。用重复剂量的纯化抗原注射宿主动物，允许动物产生期望的生产抗体的细胞，然后收获细胞用于与永生细胞系融合。最经常地，永生细胞系是大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系，为了方便性和可用性的问题来采用它们。融合的技术也是本领域公知的，一般地包括将细胞与融合试剂，例如聚乙二醇混合。一般地，选择具有生产抗体的潜力的下述免疫体细胞，特别是B-淋巴细胞(B-细胞)，用于mAb生产规程。这些细胞可以从活检脾脏、扁桃体或淋巴结、或从外周血样品获得。脾脏细胞和外周血细胞是优选的，前者是因为它们是处于分裂浆母细胞阶段(dividingplasmablaststage)的生产抗体的细胞的丰富来源，后者是因为外周血是容易获得的。通常，将一栏(apanelof)动物免疫，将具有最高抗体效价的动物的脾脏取出，通过用注射器将脾脏均质化来获得脾淋巴细胞。通常，来自免疫的小鼠的脾脏含有大约五千万到两亿淋巴细胞。适用于生产杂交瘤的融合步骤的骨髓瘤细胞系优选是非抗体生产性的、具有高融合效率、和酶缺陷的，所述酶缺陷使得它们不能在某些选择培养基中生长，所述选择培养基仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)的生长。可以使用许多骨髓瘤细胞中的任一种，如本领域技术人员已知的。可得到的鼠骨髓瘤系，例如来自美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209，USA的那些，可用于杂交。例如，当免疫的动物是小鼠时，人们可以^f吏用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NSl/l.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC画ll、MPCll-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul;对于大鼠，人们可以4吏用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210;U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6在人细胞融合方面都是有用的。一种优选的鼠骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-l-Ag4-l),其是可通过请求细胞系保藏号GM3573从NIGMS人遗传突变细胞保藏中心容易地获得的。可以使用的另一种小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮杂乌嘌呤抗性小鼠的鼠骨髓瘤SP2/0非产病毒(non-producer)细胞系。产生生产抗体的脾脏或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的方法通常包括在促进细胞膜融合的一种或多种试剂(化学的或电学的)存在下以2:1比例混合体细胞和骨髓瘤细胞，而该比例可分别从约20:1变化到约1:1。已经描述了使用仙台病毒的融合方法(Kohler等，1975，Atowre256:495;Kohler等，1976,五wr./mmw"o/.6:511;Kohler等，1976,//mwwwo/.6:292)，p乂及Gefter等(1977,5bwa"cCe〃3:231-236)使用聚乙二醇(PEG)，例如37%(v/v)PEG的那些方法。使用电学上诱导的融合方法也是适当的(Goding，1986)。融合操作通常以低频率(约1x10-6到1x10,产生活的杂合体。然而，这不构成难题，因为通过在选择培养基中培养可将活的融合的杂合体与亲本未融合的细胞(特别是将正常地继续无限分裂的未融合的骨髓瘤细胞)区分。选择培养基一般是含有试剂的培养基，所述试剂阻断组织培养基中核苷酸的从头合成。例示的和优选的试剂是氨基蝶呤(aminopterin)、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸(azaserine)。氨蝶呤和氨曱蝶呤阻断噪呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断。票呤合成。当使用氨蝶呤或氨曱蝶呤时，培养基可以补充以次黄。票呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，培养基补充以次黄嘌呤。优选的选择培养基是HAT。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶(例如，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT))中是缺陷的，因而它们不能存活。B细胞可以操作这个途径，但是它们在培养中具有有限的生命期跨度(lifespan),—般在约两周内死亡。因此，可以在选择培养基中存活的唯一的细胞是从骨髓瘤和B细胞形成的那些杂合体。在这些条件下培养融合产物提供了杂交瘤的群体，从中选择特定的杂交瘤。一般地，通过微量滴定板中的单克隆稀释来培养细胞，随后测试单个克隆上清液(在约两到三周后)的期望的反应性来进行杂交瘤的选择。使用标准的免疫测定，例如Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射性免疫测定)等等，选择分泌期望的抗体的杂交瘤。使用标准的蛋白纯化技术(例如Tijssen,1985，/d)从培养基回收抗体。所述分析应该是每文感的、简单的和快速的，例如放射免疫分析、酶免疫测定、细胞毒性分析、噬菌斑分析(plaqueassay)、点免疫结合分析，等等。然后将选定的杂交瘤连续稀释，并克隆成单独的产生抗体的细胞系，然后可将所述克隆无限增殖以提供mAbs。可将细胞系以至少两种方式用于mAb生产。可将杂交瘤的样品注射(通常到腹膜腔中)到组织相容的动物的类型中，所述动物用于提供原始融合的体细胞和骨髓瘤细胞。注射的动物发展了肿瘤，所述肿瘤分泌由融合细胞杂合体产生的特异的单克隆抗体。然后可使动物的体液(例如血清或腹水)流出以提供高浓度的mAbs。也可将单独的细胞系体外培养，其中将mAbs天然地分泌到培养基中，从培养基中可以以高浓度容易地获得它们。如果需要，可使用过滤、离心和各种层析方法例如HPLC或亲和层析将通过任一种方法产生的mAbs进一步纯化。可用许多参考文献来提供应用上述技术中的指导，包括Kohler等(1980,HYBRIDOMATECHNIQUES,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork);Tijssen(1985,Id.);Campbell(1984，MONOCLONALANTIBODYTECHNOLOGY,Elsevier:Amsterdam);Hurrell(1982，Id.)。也可以使用公知的噬菌体文库系统来产生单克隆抗体。参见，例如，Huse等(1989,Science246:1275);Ward等(1989，Nature341:544)。可以根据已知的方法通过裂解和收集期望片段来从相应的抗体产生抗体片段，例如F(ab')2和Fab片段(参见，例如，Andrew等，1992，"FragmentationofImmunoglobulins"inCURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,Unit2.8,GreenePublishingAssoc.andJohnWiley&Sons)。可以例如，以通过公知方法与固相支持物结合的固定化形式使用如此产生的抗体，无论是多克隆的或单克隆的。也可以j吏用未标记的或通过标准方法标记的抗体，作为免疫分析和免疫特异性结合分析的基础。可以使用的免疫分析包括但不限于竟争性和非竟争性分析系统，其使用的技术例如Western印迹、放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附测定)、"夹心"免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体结合分析(complement-fixationassay)、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白质A免疫分析，略举数例。这些分析是常规的和本领域公知的(参见，例如Ausubel等，eds，1994,Id.)。特别地，本发明的抗体也可以与为免疫组织化学(IHC)研究制备的新鲜冷冻的和/或福尔马林固定的、石蜡包埋的组织块(tissueblock)—起使用。通过将抗体与可检测物质偶连可以使检测便利化。可检测物质的实例包括各种酶、辅基(prostheticgroup)、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性物质、利用各种正电子发射断层照相术的正电子发射金属、和非放射性的顺磁性金属离子。可以使用本领域已知的技术通过中间物(例如，本领域已知的接头)将可检测物质直接或间接地偶联或缀合到抗体(或其片段)。对于可以缀合于抗体用作根据本发明的诊断剂的金属离子，参见，例如美国专利No.4,741,900。使用的特定标记将取决于免疫测定的种类。可以使用的标记物的实例包括但不限于，放射性标记例如&、14C、32P、125I、'311、"'In或"Tc;荧光标记物例如荧光素和其衍生物，罗丹明和其衍生物，丹磺酰和伞形酮；化学发光剂例如荧光素酶和2,3-二氢-邻苯二曱酰吖嗪二酮(2,3-dihydro-phthalazinediones);以及酶，例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和乙酰胆i烕酯酶。可以通过已知的方法用这些标记物来标记抗体。例如，可以使用偶联剂，例如醛、碳二亚胺、双马来酰亚胺(dimaleimide)、亚胺酯(imidates)、琥珀酰亚胺、双重氮化联苯胺(bisdiazotizedbenzadine)等等，来标记带有荧光、化学发光或酶标记物的抗体。涉及的一般方法是本领域公知的，并且例如在IMMUNOASSAY:APRACTICALGUIDE(1987,Chan(Ed.),AcademicPress,Inc.:Orlando，FL)中描述。此外，预测性多肽的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式可以与非肿瘤组织或细胞样品相比较。非肿瘤组织或细胞样品可以从来自相同个体的非肿瘤组织或细胞样品获得，或作为选择从来自不同个体的非肿瘤组织或细胞样品获得。如果与非肿瘤组织或细胞样品相比检测到更少的多肽，则将多肽的检测模式称为在哺乳动物肿瘤、组织或细胞样品中是降低的。如果与非肿瘤组织或细胞样品相比检测到更多的多肽，则将多肽的检测模式称为在哺乳动物肿瘤、组织或细胞样品中是"提高"的。如果与非肿瘤组织或细胞样品相比检测到相同的或大致相同的多肽，则将多肽的检测模式称为在哺乳动物肿瘤、组织或细胞样品中是"正常，，的。在实施本发明的方法中，可以通过人，例如解剖病理实验室中的组织技术人员(histotechnician)来进行染色操作。作为选择，可以使用自动化系统，例如VentanaMedicalSystems'Benchmark⑧系列的自动化染色仪来进行染色操作。在任一种情况中，根据本领域公知的标准技术和规程来进行本发明的方法使用的染色步骤。"细胞或组织样品，，是指生物样品，其包括细胞，最优选肿瘤细胞，其为从身体样品分离的，所述身体样品例如但不限于涂片、痰、活检物、分泌物、脑脊液、胆汁、血液、淋巴液、尿液和粪、或从器官移出的组织，所述器官例如乳腺、肺、肠、皮肤、宫颈、前列腺和胃。例如，组织样品可包含功能上相关的细胞或邻近细胞的区域。可以通过测量染色的抗原的平均光密度来定量目标蛋白质的量。附随地，可以容易地计算染色的总组织区域的比例或百分比，例如，在第二图像中对照水平(例如抗体阈值水平)之上的染色的面积。在含有生物标记物的核的可视化之后，将来自治疗后患者的组织中这些细胞的百分比或量与未治疗的组织中这些细胞的百分比或数量相比较。就本发明而言，将"测定"多肽的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式广义地理解为仅指通过直接检查或间接地从例如承包诊断服务(contractdiagnosticservice)来获得关于这样的多肽的表达水平信息。作为选择，可以使用荧光方法来测定目标蛋白质的量。例如，量子点(Qdots)在包括免疫组织化学、流式细胞术和基于平板的分析的发展的应用列表中是越来越有用的，因而可以与本发明一起使用。Qdot納米晶体具有独特的光学性质，包括极其明亮的信号用于敏感性和定量，高的光稳定性用于成像和分析。需要单一的激发源，缀合物的增长的范围使得它们在广泛的基于细胞的应用中是有用的。QdotBioconjugates(量子点生物缀合物)的特征在于与可用的最明亮的传统染料可比较的量子产量。另外，与传统的染料相比，这些基于量子点的荧光基团吸收10-1000倍的光线。来自基础Qdot量子点的发射是狭窄和对称的，这意味着与其它颜色的重叠最小化，产生对邻近检测通道的最小的渗透(bleedthrough)和衰减的串4尤(crosstalk)，虽然有(inspiteof)可以同时使用许多颜色的事实。标准荧光显微镜是用于检测QdotBioconjugates的便宜的工具。由于Qdot缀合物是实际上光稳定的，可以使用显微镜花费时间来找到感兴趣的区域并充分地集中于样品。Qdot缀合物在任何需要明亮的光稳定的发射时是有用的，并且在仅可用一个激发源/过滤器和需要颜色中的最小串扰的多色应用中是特别有用的。例如，量子点已经用作抗生蛋白链菌素和IgG的缀合物来标记细胞表面标记物和核抗原，以及来染色微管和肌动蛋白(Wu等2003，NatureBiotech.,21，41-46)。例如，可以使用二级抗体进行QDOT荧光IHC，其中检测底物是缀合抗生蛋白《连菌素的Qdots(VentanaMedicalSystems,Inc.,Tucson,AZ)("Ventana")。通过首先在光谱成像照相机上捕获图像块来进行图像分析(CambridgeResearchInstruments,Wobum，MA)。可以用UV(汞)光源来进4亍5敫发。然后可以在VentanaResearchImagingApplication上分析图<象块。简要地，可以在应用中恢复(retrieve)图像块，可以提取数据并根据预计在605nm和655nm处发射的Qdots的像素强度来报告。作为实例，可以使用多光谱成像系统Nuance(CambridgeResearch&Instrumentation,Wobum,MA)来测量焚光。作为另一个实例，可以使用光谱成像系统SpectrViewTM(AppliedSpectralImaging,Vista,CA)来测量荧光。多光谱成像是一种技术，其中采集图像的每个像素的光谱学信息，并用光谱图像处理软件来分析所得的数据。例如，Nuance系统可以在电子地和连续地可选的不同波长采集一系列图像，然后以设计用于处理这些数据的分析程序来应用。即使染料的光镨高度重叠或将它们共定位时，或在样品中相同的点发生，只要光谱曲线是不同的，Nuance系统就能够同时获得来自多个染料的定量信息。当被更高能量的光激发时，许多生物材料是自身发荧光的，或发射更低能量的光。这种信号可以产生较低对比的图像和数据。没有多光谱成像能力的高灵敏度照相机仅提高自身荧光信号和荧光信号。多光谱成像可以不混合、或分离出来自组织的自身焚光，从而增加可实现的信噪比。对于抗体检测方法，"检测试剂，，是指可以用于检测抗体的试剂，包括初级或二级抗体。例如，检测试剂可以是焚光检测试剂、Qdots、产色检测试剂、或基于聚合物的检测系统。然而，本发明的方法和试剂盒不限于这些检测试剂，它们也不限于初级和二级抗体方案(例如，三级等的抗体是包含在本发明的方法中)。本发明还使用核酸探针作为间接检测表达的蛋白质生物标记物的手段。例如，可以使用探针设计领域的普通技术人员公知的标准的探针设计方法来构建EGFR生物标记物的探针。举例来说，通过引用并入本文的美国专利申请No.US20050137389A1"染色体特异性染色的方法和组合物"描述了设计无重复探针组合物的方法，所述组合物包含经设计以标记整个染色体的序列的异源混合物。可以根据以下公开的方法的任一种来设计基因特异性探针。为此，重要的是产生纯的、或同源的探针以将在感兴趣位点以外的位置处的杂交最小化(Henderson,1982，InternationalReviewofCytology76:1-46)。Manuelidis等(1984,Chromosoma91:28-38)公开了用于检测相应于重复DNA序列的家族成员的染色体上的多个基因座的单一种类DNA探针的构建。Wallace等(1981，NucleicAcidsResearch9:879-94)公开了合成的寡核香酸探针的构建，其具有用于检测相应于结构基因的单个基因座的混合的碱基序列。通过考虑所有可能的核苷酸序列来确定碱基序列的混合物，所述核苷酸序列编码结构基因相应的蛋白质中选定的氨基酸序列。01sen等(1980，Biochemistry19:2419-28)公开了通过连续杂交来分离标记的独特序列人X染色体DNA的方法首先，总基因组人DNA针对其自身，从而可以分离独特的序列DNA部分；第二，分离的独特序列人DNA部分针对小鼠DNA,从而同源的小鼠/人序列被除去；最后，不与小鼠同源的独特序列人DNA针对人/小鼠杂合体的总基因组DNA，所述杂合体的仅有的人染色体是染色体X，从而分离独特序列X染色体DNA的部分。可以在本发明的方法中的基因检测规程中使用标记的核酸探针。例如，荧光原位杂交("FISH")基因检测方法可以用于测定基因(例如EGFR基因)的基因状态。FISH基因检测可以用于测量编码例如EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排。FISH基因检测，其容许测量基因组DNA的扩增、缺失或重排，因而容许检测基因状态，例如，基因是否是平衡的二体性、平衡的三体性、或平衡的多体性。本发明还可使用包括银原位杂交的方法。使用这种技术，酶(例如辣根过氧化酶(HRP))催化银离子向金属银的还原；金属粒子沉积在与探针杂交的靶物的位点(Hoff等，2002，AmJClinPatho1.117:916-21.;参见图20)。例如，银原位杂交可以用于测量基因组DNA的扩增、缺失和重排。通过免疫组织化学根据本发明的方法来分析取自患者的癌症组织切片的EGF途径成员或其任何阳性治疗应答预示性组合的表达、磷酸化、或表达和磷酸化。在本发明的方法中，"表达"方面的改变可以指检测到生物标记物的细胞数目的改变，或作为选择，阳性细胞的数目可以是相同的，但是强度(或水平)可以被改变。术语表达可以用作替代术语，表示分子活化水平的水平变化。例如，可以通过使用组织微阵列来实现这些测量。组织微阵列有利地用于本发明的方法，其为在均一染色和计分条件下快速筛选多个组织样品的充分验证的方法。(Hoos等，2001，AmJPathol.158:1245-51)。染色阵列的计分可以使用标准的0到3+级人工地实现，或通过精确定量观察到的染色的自动化系统实现。这种分析的结果鉴定了最好地预测治疗后的患者结果的生物标记物。可以根据一小组配体、受体、信号转导蛋白质或其预测性组合的表达、磷酸化或两者来预测从0到100百分比的患者"应答可能性"。可分析来自癌症患者的其它样品，作为组织微阵列结果的替代或除组织微阵列结果之外。例如，来自乳腺癌患者的样品的分析可以确认来自组织阵列的结论，患者的应答是否与受体表达和/或下游信号转导的特定模式相关联。本发明部分地提供了用于进行本发明的方法的试剂盒。例如，所述方法提供了用于评估个体中结肠直肠癌症发展的试剂盒，包括至少两种试剂，优选抗体，其可以检测EGF途径中的多肽的表达、磷酸化或两者。例如，所述试剂盒可以含有与EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67结合的至少两种、三种或四种试剂。此外，所述试剂盒可以包括除了以上鉴定的试剂之外的其它成分，包括但不限于其它抗体。例如，临床医师或医师可以使用这样的试剂盒，来帮助选择用于特定患者的适当的治疗。说明性的目的而列出，并且不认为是限制本发明。实施例1在结肠直肠肿瘤发展中EGF途径中下游分子的免疫组织化学染色为了确定是否可鉴定与癌的病理分期相关的结肠直肠癌症的生物标记物分布(profile)，使用商业上可获得的组织阵列和来自个体病例的组织样品检查了结肠直肠癌症病例中与EGFR的表达相联系的生物标记物的表达水平。使用免疫组织化学("IHC")评定生物标记物。将VentanaMedicalSystems的鼠抗体克隆3C6用于通过免疫组织化学检测HER1/EGFR表达。3C6克隆与受体的细胞外域反应。研究的其它生物标记物是pHERl、PTEN、pAKT、pMEK、Ki67和pERK。还评估了pTYR作为活化的替代(surrogate)。如以下和表l中的描述，并根据指定的包装插页使用所有试剂。在FFPE单玻片切片中，和在多组织阵列中评估了探针和抗体在自动化IHC规程中检测蛋白质标记物的性能(参见表2)。在Ventana，sBenchMarkXT和/或Discovery⑧XT染色平台上进行所有IHC分析。表1.组织化学规程<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>对于单玻片切片，收获细胞并固定在10。/o中性緩沖液的福尔马林("NBF")中，然后石蜡包埋("FFPE，，)。将FFPE细胞在1500rpm离心IO分钟。除去上清'液，添力口3滴ShandoncytoblockCellBlockPreparationSystem("ShandonCytoblock")(ThermoElectronCorporation,Waltham,MA)的试剂1。将细月包在3000rpm离心2分钟。将三(3)滴ShandonCytoblock试剂2滴下到试管侧面以使试剂2流到细胞沉淀悬浮液之下。将样品温育10分钟，然后添加5ml70%乙醇(沉淀漂浮在乙醇的顶部)。最后，将样品在3000rpm旋转2分钟，然后转移到活检盒，并加工用于石蜡包埋。观察了苏木色素和曙红("H&E")染色来证实切片对于IHC和原位杂交(ISH)的适用性(图3)。H&E染色包括以下步骤在二曱苯、100%乙醇和950/0乙醇中脱蜡，然后浸入水中。载玻片浸入苏木色素中3分钟，在水中清洗，浸入蓝色试剂(bluingreagent)中1分钟，在水中清洗，浸入曙红中，最后添加盖玻片。免疫分析包括以下步骤抗原去屏蔽，以及在与相关的初级和二级抗体温育之后检测。作为阴性对照，BenchMarkXT⑧或DiscoveryXTDiluent(Ventana)与相关的玻片温育。使用DABMap、OmniMap(DiscoveryXT)或iViewTMDAB(BenchMarkXT⑧)检测试剂盒根据制造商的说明书来检测初级抗体。筒要地，iVIEWDAB检测试剂盒检测与石蜡包埋的或冷冻组织切片中的抗原结合的特异性小鼠IgG、IgM和兔IgG抗体。通过生物素缀合的二级抗体来定位特异性抗体。这个步骤之后是添加结合二级抗体上存在的生物素的抗生蛋白链菌素-酶缀合物。然后利用沉淀显色酶产物来显现复合物。在每个温育步骤的结束时，自动化玻片染色仪洗涤切片以除去未结合的材料，并施加液体盖玻片，其将水性试剂从玻片的蒸发最小化。使用光学显微镜来解释结果，并帮助病理过程的差异诊断，其可以或可以不与特定的抗原相关联。作为具体的实例，通过以下方式完成pMEK的检测。病理学家观察H&E来证实组织的肿瘤存在，以及细胞系与组织的细胞生存力。初级抗体pMEK从CellSignalingTechnology,Inc.("CST，，)(Danvers，MA)获得。对于pMEKIHC分析，在VentanaBenchmark⑧系列仪器上用CC1调节緩沖液在100。C进行细胞调节60分钟，其中CC1是高pH细胞调节溶液Tris/Borate(硼酸盐)/EDTA緩沖液，pH8(Ventana)。将载玻片与1/40稀释度的储备浓度的初级pMEK抗体(表l)在室温温育1小时。储备抗体浓度是指抗体商业上销售的浓度；此信息某些制造商是不提供的，并通过实验确定适当的稀释度。作为阴性对照，将根据制造商的说明书使用的Ventana抗体稀释齐寸，在相同的条件下与相关的载玻片温育。根据制造商的说明(VectorLaboratories,Burlingame,CA)使用VentanaiViewDAB检测试剂盒(除了通用的二级抗体之外，其被载体生物素化的抗兔IgG替代)来4全测pMEK抗体，在37。C应用32分钟。根据制造商的说明书和所使用的试剂盒(参见表l),使用抗生蛋白链菌素辣根过氧化酶缀合物(Ventana)，随后在二氨基联苯胺("DAB")和硫酸铜的存在下与过氧化氬反应来实现pMEK的酶学检测/定位。除了载体生物素化的二级兔抗体之外，缀合物和所有显色试剂也是iView检测试剂盒的成分，并在制造商建议时应用。结肠直肠发展组织孩么阵列(TMA;CHTN2003CRCProg)从合作人组织网络(CHTN)获得。阵列的细节示于图4，并在表2中概述。简要地，这种福尔马林固定的和石蜡包埋的("FFPE")结肠直肠癌症发展阵列是通过从供体收集样品而创建的。这种TMA代表有限数目的病例，其可以在差异基因表达中检测到强的趋势。未染色的组织切片为4微米厚，在带电的玻璃载片上提供。CHTN2003CRCprogTMA含有多至20例的非新生物结肠粘膜、14例的腺瘤性息肉、14例的原发性结肠直肠腺癌、7例的向区域淋巴结转移性的腺癌和7例向远端位点转移性的腺癌。每个病例用0.6mm核心采样三次。表2.CHTN结肠直肠发展阵列的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>人工计分由委员会证明的(board-certified)病理学家来进行。记录染色强度、反应性细胞的百分比和细胞位置。对于IHC的病理学家评估，染色强度的分值从0(阴性)到3+(最阳性的)。光学成象利用具有根据转变成数字分值的染色强度(表示为平均光密度，或平均OD)的图像量化的数字应用。对于每个样品捕获高分辨率图像，OD值是基于阳性染色的细胞的颜色范围的特定分级器(classifier)。用于分析的图像使用40x物镜捕获。在某些情况下，得到"组合的分值，，或乘法指数，其并入根据以下公式的阳性细胞的百分比和染色强度组合的分值=(%阳性)x(光密度分值)。使用ptyr活性作为活化的替代量度的组织化学组织评定的结果显示，与来自癌症和非癌症病例的正常结肠粘膜相比，在瘤形成和发炎的非新生物组织中的表达增加(图5)。TMA中EGFR途径分子的表达水平的组织化学评估结果在图6-9中显示。个体病例中EGFR途径分子的表达水平的组织化学评估结果在图IO中示出。来自两个实验的结果都显示，随着结肠直肠癌症发展通过连续的分期类别，pMEK、Ki67和pHERl蛋白水平提高，而EGFR、PTEN和pAKT蛋白水平降低(图11)。这些发现鉴定了生物标记物分布，其在诊断和跟踪结肠直肠肿瘤发展中是有用的，包括在早期小的腺瘤中高水平的EGFR(蛋白)、PTEN和低水平的pMEK，以及在包括恶性表型的发展的疾病状态中低水平的PTEN和高水平的pMEK。实施例2利用原位杂交的结肠直肠癌症肿瘤分期和EGFR基因拷贝数之间的相关性在来自个体病例的单玻片切片和多组织阵列上预先形成EGFR的焚光原位杂交(FISH),以评估结肠直肠癌症发展中的基因状态。利用双色FISH，在福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)单玻片切片中和在多组织阵列中评估每个细胞的EGFR基因拷贝的数目(图12)。单玻片切片和多组织阵列的细节在实施例1中概述。使用来自Ventana(SpectrumOrange标记的)、Invitrogen(SPOTLightTM-EGFR，DIG标i己的)或Vysis(SpectrumOrangeEGFR和SpectrumGreenCEP7标记的探针)的任何探针来进行EGFR基因的原位杂交检测。在VentanaDiscoveryXT上用完全自动化的规程来检测来自Ventana和Zymed的EGFR探针。Vysis探针的检测是半自动化的，具有离线进行的探针杂交，如制造商(Vysis,DownersGrove,IL)所述。根据制造商的包装插页(Vysis,Cat.No.32-191053)进行FISH规程。如Hirsch等JCO,21:3798-3807)中所述来进行FISH评估。图12显示来自显示平衡的二体性、平衡的三体性、平衡的多体性和基因扩增的细胞的代表性显微照片。通过病理观察测定了EGFR和CEP7的每个细胞的基因拷贝平均数。在个体病例中和在TMA中的EGFRFISH分析的结果显示从小的腺瘤到腺癌，EGFR基因状态从平衡的二体性(正常)进化到平衡的三体性/多体性(异常)，如表3所示。具有提高水平的EGFR基因拷贝数(三体性+)的样品都具有如IHC所分析的有高水平蛋白质的亚群(3+,>50°/。)(实施例1)。实施例1和2的发现还暗示了在早期癌症阶段中不一致的(discordant)基因扩增水平(正常)和蛋白质表达水平(高)。表3.结肠直肠癌症发展中EGFR基因表达的概要分布<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>实施例3肿瘤内EGFR途径分子的表达水平中的异质性在结肠直肠癌症病例研究中评估EGFR途径分子的表达水平，以评价在单个胂瘤中这些分子的表达水平方面可能的异质性。呈现直肠出血和腹部绞痛(abdominalcramping)的41岁男性诊断具有3cm直肠胂块。放疗之后的末端结肠切除术显示阶段T3的良好分化的直肠腺癌。如实施例1中详述的制备来自肿瘤的各个区域的单玻片切片。如实施例1中所述，进行IHC以测定EGFR、HER-2、pAKT、Ki67、存活蛋白和VEGF的表达水平。用来自Novus的抗体(NB500-201)通过在室温温育2小时来检测存活蛋白。使用来自SantaCruz的抗体(SC-7269)通过在室温包括1小时来检观寸VEGF。图14-19显示肺瘤生物标记物的表达水平在同一肿瘤内可显著变化。这些结果显示，患者可以受益于针对特定肿瘤的个体的表达标志修整的个体化的组合治疗。应该理解的是，上述公开强调了本发明的某些特定的实施方式，而且与其等同的所有修改或替换在如所附的权利要求所阐述的本发明的精神和范围之内。权利要求1.一种评估个体中结肠直肠癌症发展的方法，包括分析获自所述个体的组织或细胞样品来检测一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式，其中所述生物标记物是EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHER1、pERK或Ki67，其中所述一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式基本上类似于来自对结肠直肠发展的诊断是特征性的组织或细胞样品的一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式。2.—种评估个体中结肠直肠癌症发展的方法，包括分析获自所述个体的组织或细胞样品来检测一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式，其中所述生物标记物是EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67，其中所述一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式不同于来自第二组织或细胞样品的一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式。3.权利要求2的方法，其中所述第二组织或细胞样品是非结肠直肠癌症组织或细胞样品。4.权利要求2的方法，其中所述第二组织或细胞样品是来自发展的早期的结肠直肠组织或细胞样品。5.权利要求4的方法，其中来自发展的早期的所述结肠直肠组织或细胞样品是从所述个体获得的。6.权利要求l的方法，其中分析获自所述个体的组织或细胞样品来检测两种或更多生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式，其中所述两种或更多生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式基本上类似于来自对结肠直肠发展的已知诊断是特征性的组织或细胞样品的两种或更多生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式。7.权利要求6的方法，其中所述生物标记物是EGFR、PTEN、pMEK、Ki67和pHERl。8.权利要求1的方法，还包括使用标记的基于核酸的探针测量编码EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排的步骤。9.权利要求l的方法，其中所述方法评估个体中处在小的腺瘤阶段的结肠直肠癌症发展。10.权利要求9的方法，还包括使用标记的基于核酸的探针测量编码EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排的步骤，其中所述扩增、缺失或重排的程度在两种样品中是基本上类似的。11.权利要求9的方法，其中来自获自所述个体的组织或细胞样品的一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式包括与非肿瘤组织或细胞样品中所表达的、所磷酸化的、或所表达和磷酸化两者的情况相比，更大的EGFR的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者，更大的PTEN的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者，或降低的pMEK的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者。12.权利要求11的方法，还包括使用标记的基于核酸的探针测量编码EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排的步骤，其中在获自所述个体的组织或细胞样品中所述扩增、缺失或重排的程度是平衡的二体性。13.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式基本上类似于来自对小的腺瘤是特征性的组织或细胞样品的一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式。14.权利要求13的方法，还包括使用标记的基于核酸的探针测量编码EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排的步骤，其中所述扩增、缺失或重排的程度在两种样品中是基本上类似的。15.权利要求1的方法，其中所述方法评估个体中处在腺癌阶段的结肠直肠癌症发展。16.权利要求15的方法，还包括使用标记的基于核酸的探针测量编码EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排的步骤，其中所述扩增、缺失或重排的程度在两种样品中是基本上类似的。17.权利要求15的方法，其中来自获自所述个体的组织或细胞样品的一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式包括与小的腺瘤组织或细胞样品中所表达的、所磷酸化的、或所表达和磷酸化两者的情况相比，降低的PTEN的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者，或更大的pMEK的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者。18.权利要求15的方法，还包括使用标记的基于核酸的探针测量编码EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排的步骤，其中在获自所述个体的组织或细胞样品中所述扩增、缺失或重排的程度是平衡的二体性和平衡的三体性。19.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式基本上类似于来自对腺癌是特征性的组织或细胞样品的一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式。20.权利要求19的方法，还包括使用标记的基于核酸的探针测量编码EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排的步骤，其中所述扩增、缺失或重排的程度在两种样品中是基本上类似的。21.权利要求1的方法，其中所述方法评估个体中处在恶性腺癌阶段的结肠直肠癌症发展。22.权利要求21的方法，还包括使用标记的基于核酸的探针测量编码EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排的步骤，其中所述扩增、缺失或重排的程度在两种样品中是基本上类似的。23.权利要求21的方法，其中来自从所述个体获得的组织或细胞样品的一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式包括与小的腺瘤组织或细胞样品中所表达的、所磷酸化的、或所表达和磷酸化的情况相比，降低的PTEN的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者，更大的pMEK的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者，并所述方法还包括使用标记的基于核酸的探针测量编码EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排的步骤，其中获自所述个体的细胞样品的组织的基因状态是平衡的二体性和平衡的多体性。24.权利要求21的方法，还包括使用标记的基于核酸的探针测量编码EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排的步骤，其中在获自所述个体的细胞样品的组织中所述扩增、缺失或重排的程度是平衡的二体性和平衡的多体性。25.权利要求1的方法，其中所述一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式基本上类似于来自对恶性腺癌是特征性的组织或细胞样品的一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式。26.权利要求25的方法，还包括使用标记的基于核酸的探针测量编码EGFR的基因组DNA的扩增、缺失或重排的步骤，其中所述扩增、缺失或重排的程度在两种样品中是基本上类似的。27.权利要求1的方法，其中所述分析步骤包括在使用标记的特异性结合试剂染色之后对组织切片的计算机辅助的图像分析。28.—种鉴定对化学治疗剂有反应的结肠直肠癌症肿瘤的方法，包括分析获自所述结肠直肠癌症肿瘤的组织或细胞样品来检测一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式，其中所述生物标记物是EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67，其中所述生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者将所述哺乳动物肿瘤鉴定为用化学治疗剂可治疗的。29.权利要求28的方法，其中所述化学治疗剂是EGFR抗体。30.权利要求28的方法，其中所述化学治疗剂是激酶抑制物。31.权利要求28的方法，其中所述化学治疗剂既是EGFR抗体又是激酶抑制物。32.权利要求28的方法，其中所述方法包括分析获自所述个体的组织或细胞样品来检测两种或更多生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的模式。33.—种用于评估个体中结肠直肠癌症发展的试剂盒，包括用于检测一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的至少两种试剂，其中所述生物标记物是EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67。34.权利要求33的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于检测一种或多种生物标记物的表达、磷酸化、或表达和磷酸化两者的至少三种试剂。35.权利要求33的试剂盒，其中所述生物标记物是EGFR、pHERl、PTEN、pMEK、pERK或Ki67。36.权利要求33的试剂盒，其中所述生物标记物是EGFR、PTEN或pMEK。37.权利要求33的试剂盒，其中所述生物标记物是PTEN和pMEK。38.权利要求33的试剂盒，还包括用于检测EGFR基因扩增、缺失或重排的试剂。39.权利要求38的试剂盒，其中所述生物标记物是EGFR、pHERl、PTEN、pMEK、pERK或Ki67。40.权利要求38的试剂盒，其中所述生物标记物是EGFR、PTEN或pMEK。41.权利要求38的试剂盒，其中所述生物标记物是PTEN和pMEK。全文摘要本发明提供了使用来自个体的含有组织或肿瘤细胞的样品来评估肿瘤发展的试剂和方法。本发明还提供了用于评估对化疗的反应的试剂和方法。文档编号G01N33/574GK101384901SQ200780005752公开日2009年3月11日申请日期2007年2月16日优先权日2006年2月16日发明者加里·A·佩斯塔诺,琳达·K·萨马德扎德申请人:文塔纳医疗系统公司