用于癌症预后和病理分期的试剂和方法

用于癌症预后和病理分期的试剂和方法
【专利说明】用于癌症预后和病理分期的试剂和方法
[0001] 本申请是申请日为2007年2月16日、中国申请号为200780005752. 5、发明名称为 "用于癌症预后和病理分期的试剂和方法"的发明申请的分案申请。
[000引本申请要求2006年2月16日提交的美国临时申请系列号NO. 60/774, 563的优先 权，将其通过引用并入本文。
[000引发明背景
[0004] 1.发明领域
[0005] 本发明设及用于评估个体中结肠直肠癌症发展（progression)的试剂和方法。更 具体地，本发明提供了用于测定或诊断癌症的发展或病理分期（pathological staging) W 更精确地修整（tailor)对个体的治疗的所述试剂和方法。本发明还设及用于监测和分析 生物样品的EGFR途径的生物标记物的任一种或信息性组合的定量表达和活化的免疫试剂 和方法，所述生物标记物包括EGFR、PTEN、P肥R1、pAKT、祀服、pMEK和Ki67。
[0006] 2.发明背景
[0007] 癌症治疗的基本目标是选择性地杀死或抑制恶性细胞的不受控制的生长而不有 害地影响正常细胞。传统的化学治疗药物是高度细胞毒性的试剂，其优选的对恶性细胞具 有比正常细胞更大的亲和性，或至少根据恶性细胞的高细胞生长速度和代谢活性优先地影 响恶性细胞。然而，证明该些试剂不是"魔术子弹"，并常常损害正常细胞W及癌细胞；相反 地，某些癌症产生出正常细胞不会产生的对所述化学治疗剂的抗性。可W祀向恶性细胞并 不伤害正常细胞的癌症治疗被称为祀向治疗，是癌症化学治疗的新浪潮。该种新的方法与 治疗实体肿瘤癌症是特别相关的，实体肿瘤癌症保持了需要具有较少副作用的灵活和应答 性（responsive)治疗的慢性病症，它们的发展需要被研究。
[000引一般地，祀向癌症治疗试图通过干扰特异于癌发生的分子或细胞内途径来阻断癌 细胞的生长和散布，因而不伤害非癌细胞。该些试剂的作用与传统的化学治疗剂或化学预 防剂截然不同（in contradistinction)，传统的化学治疗剂或化学预防剂用于产生癌细胞 或前癌细胞的生长延滞、末端分化和细胞死亡，但也能阻断正常细胞的发育。然而，难W开 发用于祀向治疗的鲁椿（robust)诊断的候选生物标记物，该部分是由于正常细胞和癌细 胞表达的受体和配体的多样性，并得到来自受体信号转导的可变的结果。
[0009] 几种信号转导途径已显示为了解和治疗肿瘤发生的重要标祀；该些包括生长因子 信号转导途径。所述生长因子途径调节响应于细胞内和环境信号（cue)的细胞生长和新陈 代谢。该些信号转导途径在癌症中通常被改变或异常调节，导致不受控生长的表型和周围 组织的侵入。
[0010] 在癌症诊断和治疗中的细胞生长的关键决定因素和活性研究的目标是表皮生长 因子巧G巧和它的受体巧GFR)。EGF是活化蛋白质受体酪氨酸激酶（RTK)活性来启动信号 转导级联，引起细胞生长、增殖和分化发生改变的生长因子。已知EGF和它的下游祀物（在 图1中说明），包括ras/raf、mek和erk设及不同癌症的发病和发展。该种途径和它的信 号转导分子提供了治疗介入的吸引人的目标，该样的方法正在开发中（Stadler，2005, Cane er, 104:2323-33 ;Normanno,等，2006, Gene, 366:2-16)。
[0011] 祀向EGF和它的受体的试剂包括bevacizum油、PTK787、SU011248和BAY 43-9006。也已经显示了 BAY 43-9006抑制EGF途径中的下游目标，包括raf、mek和 erk(Stadler, 2005Cancer, Id.)。该种受体系统还设及许多人实体肿瘤，包括肺、乳腺、前列 腺、结肠、卵巢、头和颈的发生和发展。HER1/EGFR是四种受体的家族的成员巧GFR(也称为 肥R1或化bBl)、化bB2 (肥R2/neu)、化bB3 (肥R3)和化bB4 (肥R4)}。受体存在于细胞质膜 中，并包括外部的配体结合域、跨膜域和内部酪氨酸激酶域。配体的结合触发受体二聚作用 和内部受体域的自动磯酸化。该启动了细胞反应的级联，其影响细胞分裂和细胞生长的许 多其它方面。EGF受体的活性增高，无论是由提高的配体浓度、受体数量或由受体突变引起 的，都可W引起提高的细胞增殖。现在有明显的证据显示肥R1/EGFR系统可W介导多种实 体肿瘤的建立和发展。
[001引虽然一些研究已经检查了 EGF途径在癌症的控制和治疗中的作用，关于在肿瘤发 展和转移期间该个途径中的改变了解很少。EGFR途径中下游效应物的微妙改变可W根据特 别是肿瘤类型、阶段（stage)和单独的组成来提供治疗介入的独特和灵活的祀点。该种改 变可能对恶性肿瘤的诊断和治疗具有显著的影响。
[0013] 传统的治疗癌症方式已经根据来自大规模试验的结果来开发，并且依靠各种各样 的患者和肿瘤的预示性结果。修整对单独的患者、肿瘤和病理分期（示于图2)的治疗的能 力可W提供具有较少副作用的、对恶性肿瘤的更有效的治疗。此外，监测癌症治疗的发展并 因而调整治疗的能力将允许响应于先前使用来自大批患者的数据开发的治疗方式对个体 差异的更快速的反应。
[0014] 本领域需要开发诊断性生物标记物W容许在癌症治疗之前或期间筛选和快速检 测各种细胞内信号转导分子中的改变，从而快速地诊断癌症阶段并监测针对EGFR途径的 治疗的效果。还需要针对EGFR途径的抑制物的改善的鉴定方法。

【发明内容】

[0015] 本发明提供了在患有癌症的个体中评估肿瘤发展的试剂和方法，特别是其中所述 方法用于确定肿瘤阶段和评估抗癌治疗的效力。本发明还提供了为患者提供个体化的抗癌 治疗和对治疗的反应的方法，其中根据使用本发明的方法确定的肿瘤类型和阶段将特定的 治疗施用于个体患者，根据患者对所述治疗的个体反应维持或改变治疗。
[0016] 在第一个方面，本发明提供了试剂，特别是免疫学试剂，W及评估个体中肿瘤 发展、特别是结肠直肠癌症发展的方法。在该个方面，分析来自患者的含有组织或肿瘤 细胞的样品来检测一种或多种生物标记物的表达、磯酸化，或表达和磯酸化两者的模式 (pattern)。在具体的实施方式中，所述生物标记物是EGF代谢途径的成员，包括但不限于 EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、P肥R1、祀服或Ki67。在该些实施方式中，评估肿瘤发展，其中一种 或多种（特别是多种）该些生物标记物的表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者的模式基本上 类似于来自具有所述肿瘤的发展确定阶段的组织或细胞样品的一种或多种（特别是多种） 该些生物标记物的表达、磯酸化、或表达和磯酸化两者的模式。
[0017] 在可选择的实施方式中，本发明提供了试剂，特别是免疫学试剂，W及评估个体中 肿瘤发展、特别是结肠直肠癌症发展的方法。在该个方面，分析来自患者的含有组织或肿 瘤细胞的样品来检测一种或多种生物标记物的表达、磯酸化，或表达和磯酸化两者的模式。 在具体的实施方式中，所述生物标记物是EGF代谢途径的成员，包括但不限于EGFR、PTEN、 pAKT、pMEK、p肥Rl、祀服或Ki67。在该些实施方式中，评估肿瘤发展，其中一种或多种（特 别是多种）该些生物标记物的表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者的模式不同于来自包含 正常细胞而不是肿瘤细胞的非肿瘤组织或细胞样品的一种或多种（特别是多种）该些生物 标记物的表达、磯酸化、或表达和磯酸化两者的模式。
[001引本发明的试剂和方法的优选的用途是用于评估结肠直肠癌的临床阶段，其中包 含所述表达、磯酸化、或表达和磯酸化的模式的生物标记物包括EGFR、PTEN、pMEK、Ki67和 P肥R1。还落入本发明的该些方面的范围内的是测量编码EGFR的基因组DM的基因扩增的 其它步骤。在某些实施方式中，该些分析检测基因组的编码EGFR的DNA中平衡的二体性 (balanceddisomy)。
[0019] 在该些方面中，组织样品优选地是小的腺瘤或腺瘤性息肉。具体地，在该些实施方 式中，本发明提供了表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者的模式，其中相比非肿瘤组织或细 胞样品中该些生物标记物的表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者的水平，EGFR的表达、磯酸 化、或表达或磯酸化两者被提高；PTEN的表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者被提高；pMEK 的表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者被降低。
[0020] 在其它实施方式中，所述肿瘤是腺癌。具体地，在该些实施方式中，本发明提供了 表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者的模式，其中相比小的腺瘤组织或细胞样品中该些生物 标记物的表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者的水平，PTEN的表达、磯酸化、或表达或磯酸化 两者被降低；pMffi的表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者被提高。该些实施方式可包括处于 它们的范围内的测量编码EGFR的基因组DNA的基因扩增的其它步骤。在某些实施方式中， 该些分析检测基因组的编码EGFR的DNA中平衡的二体性和平衡的S体性（trisomy)。
[0021] 在更进一步的实施方式中，来自患者的组织样品是恶性样品，而本发明提供了表 达、磯酸化、或表达或磯酸化两者的模式，其中相比小的腺瘤组织或细胞样品中该些生物标 记物的表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者的水平，PTEN的表达、磯酸化、或表达或磯酸化两 者被降低，W及PMK(的表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者被提高。该些实施方式可包括处 于它们的范围内的测量编码EGFR的基因组DNA的基因扩增的其它步骤。在某些实施方式 中，该些分析检测基因组的编码EGFR的DNA中平衡的二体性和平衡的多体性（polysomy)。
[0022] 在优选的实施方式中，包含在本发明的方法中检测到的模式的、所述生物标记物 的表达、磯酸化、或表达和磯酸化两者的该些模式通过免疫组织化学或原位杂交来检测。在 优选的实施方式中，所述方法包括在使用标记的特异性结合试剂（优选免疫学试剂）染色 之后利用组织切片的计算机辅助图像分析来有利进行的分析。
[0023] 在本发明的方法的实施中提供了用于鉴定对一种或组合的特定化学治疗剂有反 应的、带有肿瘤，特别是结肠直肠癌症肿瘤的个体的方法。在该些实施方式中，本发明的方 法用于检测一个或多个生物标记物的表达、磯酸化、或表达或磯酸化两者的模式。在某些实 施方式中，所述肿瘤是结肠直肠癌症，而所述生物标记物包括但不限于EGFR、PTEN、pAKT、 pMEK、p肥Rl、祀服或Ki67。在本发明的方法的有利实施方式中，表达、磯酸化、或表达和磯 酸化两者的模式鉴定出对一个或组合的化学治疗剂是应答性的肿瘤。在具体的实施方式 中，本发明的方法对于鉴定对化学治疗剂是应答性的肿瘤样品是有用的，所述化学治疗剂 包括但不限于EGFR抗体或激酶抑制物，或EGFR抗体和激酶抑制物两者。
[0024] 在其它的方面，本发明提供了用于实施本发明的方法的试剂盒。在有用的实施方 式中，所述试剂盒包括至少两种试剂，优选特异结合试剂和更优选免疫学试剂，用于检测在 人肿瘤样品中关于肿瘤发展或化学治疗剂应答性为信息性的生物标记物的表达、磯酸化、 或表达和磯酸化两者。在某些实施方式中，所述至少两种试剂对于检测生物标记物的表达、 磯酸化、或表达和磯酸化两者是有用的，所述生物标记物包括但不限于EGFR、祀GFR、PTEN、