象分析系统可W增强肿瘤样品的视 觉检查。在代表性实施方式中，将细胞或组织样品暴露于对特定的生物标记物是特异性的 可检测标记的试剂，然后通过计算机处理细胞的放大的图像，计算机从电荷禪合器件（CCD) 或照相机例如电视摄像机接收图像。该种系统可W用于，例如，检测和测量样品中EGFR、 ptyr、PTEN、pAKT、pMEK、P肥R1、祀服或KI67、或任何其它诊断生物标记物的表达和活性水 平。因而，本发明的方法提供了更精确的癌症诊断和组织学鉴定的癌细胞中更好的基因表 达特征，最特别的是关于肿瘤标记物基因或已知在特定癌症类型和亚型（例如具有不同程 度的恶性肿瘤）中表达的基因的表达。该种信息允许施用更为信息性和有效的治疗方案， 因为可将对某些肿瘤类型或亚型具有临床效力的药物施用于其细胞被该样鉴定出的患者。
[0097] 常规抗癌治疗的另一个缺点是特定化学治疗剂在治疗个体人患者中的特定癌症 方面的效力是不可预测的。鉴于该种不可预测性，本领域不能够在开始治疗之前确定一种 或多种选定的试剂是否将在个体患者中作为抗肿瘤试剂是活性的、或提供精确的预后或治 疗过程。该是特别重要的，因为特定的临床癌症可能为临床医师提供了治疗方案的选择，而 无评估哪种方案对于特定个体将是最有效的任何目前的方法。本发明的方法的优势是它们 能够更好地评估提出的治疗试剂（或试剂的组合）在个体患者中预期的效力。所要求保护 的方法对于其它原因也是有益的，所述原因是它们在化学治疗方案效力的评估中是有时间 和成本效率的，并且对癌症患者是最小外伤性的。
[009引使用本发明的方法来检测和定量多肤的表达和磯酸化的模式。更具体地，使用本 发明的方法来检测和定量作为肿瘤相关信号转导途径的细胞成分的多肤的表达和磯酸化 模式。例如，可W使用特异于所述多肤的生物检测试剂（包括但不限于抗体）来检测多肤 的表达和磯酸化的模式。作为选择，生物检测试剂可W是核酸探针。
[0099] 如本文公开的发明性方法所使用的，将核酸探针定义为一种或多种核酸片段的集 合，所述核酸片段与样品的杂交可W被检测。探针可W是未标记的或标记的，从而其与祀物 或样品的结合可W被检测。探针产生自来自基因组的一个或多个特定（预选的）部分的核 酸来源，例如一个或多个克隆、分离的完整染色体或染色体片段、或聚合酶链式反应（PCR) 扩增产物的集合。核酸探针也可W是固定在固体表面（例如，硝化纤维、玻璃、石英、蒸汽沉 积二氧化娃（fumed silica)载玻片）上的分离的核酸，如在阵列中。探针可W是例如WO 96/17958中描述的核酸的阵列的成员。能够产生高密度阵列的技术也可W用于该个目的 (参见，例如，r^odor, 1991, Science玄：767-773 ;Johnston, 1998, Qirr. Biol. 8: R171-R174 ; Schummer, 1997, Biotechniques23:1087-1092；Kern,1997, Biotechniques23:120-124； U. S.化t. No. 5, 143, 854)。技术人员将认识到，可将特定探针的确切序列修饰到一定程度来 产生"基本上相同的"、但保持了与衍生它们的探针的相同祀物或样品的特异性结合（即， 特异性杂交）能力的探针。术语"核酸"是指单链或双链形式的脱氧核糖核巧酸或核糖核 巧酸。该术语包括核酸，例如，寡核巧酸，含有天然核巧酸的已知类似物，所述类似物对于期 望的目的具有与参考核酸相似或改进的结合性质。该术语还包括核酸，所述核酸W类似于 天然存在的核巧酸的方式、或W对于期望的目的改进的速率被代谢。该术语还包括具有合 成的骨架的核酸样结构。通过参考例如设及结肠癌细胞的筛选的美国专利6, 326, 148,技术 人员将知道如何使用核酸探针用于筛选样品中的癌细胞。
[0100] 可使用针对直接检测的生物标记物（包括但不限于EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、P、 祀RK或Ki67)的合适的初级抗体，或使用适当的二级抗体（例如当使用小鼠初级抗体时为 兔抗小鼠IgG)和/或第=抗生物素蛋白（或抗生蛋白链菌素（Strepavidin))生物素复合 物（"ABC")通过图像分析来定量与癌症相关的多肤。
[0101] 如本文例示的在本发明方法的实施中有用的试剂的实例包括免疫学试剂。"免疫 学试剂"是指抗体，特别包括多克隆抗血清和单克隆抗体。可通过用于合成抗体的本领域已 知的任何方法（包括化学合成或重组表达技术，或优选使用常规的免疫学方法）来产生本 发明的抗体。如本文使用的，术语"抗体"包括但不限于天然存在的和非天然存在的抗体。 如本文使用的，术语"抗体"意图广泛地设及任何免疫学结合试剂，例如IgG、IgM、IgA、I曲 和I班。一般地，IgG和/或IgM是优选的，因为它们是生理学情况中最常见的抗体，并且因 为它们是在实验室环境中最容易制造的。更具体地，术语"抗体"包括多克隆和单克隆抗体， W及它们的抗原结合片段，例如F油、F油'和F(油'）2片段。此外，术语"抗体"包括嵌合抗 体和完全合成的抗体，包括遗传工程化的抗体，和它们的片段。多克隆和单克隆抗体可W是 "纯化的"，其是指所述多克隆和单克隆抗体不含任何其它的抗体。
[0102] 制备多克隆和单克隆抗体的方法是本领域公知的（参见，例如，Sambrook 等，1989,MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL Second Edition, Cold Spring 化rbor，N. Y. ;and HurrelUEd. )，M0N0化ONAL HYBRIDOMA ANTIB孤IES:TECHNIQ肥S AND AP化ICATIONS，CRC Press，Inc.，Boca Raton，Fla.，通过引用将其并入本文）。对本领域 普通技术人员显而易见的是，多克隆抗体可W产生自各种温血动物，例如马、牛、山羊、绵 羊、狗、鸡、兔、小鼠和大鼠。可W通过使用佐剂例如弗氏佐剂（完全的和不完全的）、矿 物质凝胶例如氨氧化侣、表面活性物质，例如溶血卵磯脂、普卢兰巧克多元醇（pluronic polyol)、聚阴离子、肤、油乳剂、钥孔戚血藍蛋白化eyhole limpet hemo巧anin)、二 硝基酪和潜在有用的人佐剂例如BCG (卡介苗）和短小椿杆菌（corynebacterium parvum)来增加抗原性表位的免疫原性。该些佐剂也是本领域公知的。例如在 Tijssen(1987, PRACTICE AND T肥0RY OF ENZYME IMMUNOASSAYS,化(1 Ed.，Elsevier:New York)中公开了关于佐剂和免疫分析的各个方面的信息。设及制备多克隆抗血清的方 法的其它有用的参考文件包括 Microbiology (1969, Hoeber Medical Division, Ha巧er and Row) ；Landsteiner(1962, SPECIFICITY OF SEROLOGICAL REACTIONS,Dover 化blications:New York)，和 Wi11iams 等（1967,METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMMUNOCHEMISTRY，V〇1. 1，Academic Press:New York)。
[0103] 在多克隆抗体的生产中使用的免疫原组合物的数量根据免疫原的性质W及用于 免疫的动物而改变。可使用多种的途径施用免疫原（皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内）。 可W通过在免疫后各个点采样免疫的动物的血液来监测多克隆抗体的产生。也可W给予第 二次强化剂化ooster)注射。重复强化和滴定的过程直到实现适合的滴度。当获得期望水 平的免疫原性时，可将免疫的动物放血，分离血清并保存。
[0104] 可W直接使用从使用标准方法免疫的动物产生的血清，或者可W使用标准方法例 如血浆分离术（plasmaphoresis)或用IgG-特异性吸附剂如固定的蛋白质A的吸附层析来 从血清中分离IgG级分。
[0105] 可根据已知的方法通过裂解和收集期望片段来从相应的抗体产生抗体片段，例如 F (油'）2和F油片段（参见，例如 An化ew等，1992, "Rra卵entation of Immunoglobulins"in CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,化it 2.8,Greene Publishing Assoc.and John Wiley&Sons) 〇
[0106] 作为选择，可W根据公知的技术，例如通过引用并入本文的在美国专利 No. 4, 196, 265中例示的那些来制备针对本发明的抗原性肤的单克隆抗体。通过公知的技术 来产生针对本发明的抗原性肤产生单克隆抗体的杂交瘤。通常，本方法包括永生细胞系与 产生期望抗体的B-淋己细胞融合。永生细胞系通常是转化了的哺乳动物细胞，特别是晒齿 动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。晒齿动物例如小鼠和大鼠是优选的动物，然而，使用兔或 羊细胞也是可能的。小鼠是优选的，BALB/c小鼠是最优选的，因为它是最常使用的并且一 般得到更高百分比的稳定的融合物。
[0107] 从注射了抗原的哺乳动物获得生产抗体的淋己细胞的技术是公知的。一般地，如 果采用的是人来源的细胞，则使用外周血淋己细胞（PBL)，或使用来自非人哺乳动物来源的 脾脏或淋己结细胞。用重复剂量的纯化抗原注射宿主动物，允许动物产生期望的生产抗体 的细胞，然后收获细胞用于与永生细胞系融合。最经常地，永生细胞系是大鼠或小鼠骨髓瘤 细胞系，为了方便性和可用性的问题来采用它们。融合的技术也是本领域公知的，一般地包 括将细胞与融合试剂，例如聚己二醇混合。
[010引一般地，选择具有生产抗体的潜力的下述免疫体细胞，特别是B-淋己细胞炬-细 胞），用于mAb生产规程。该些细胞可W从活检脾脏、扁桃体或淋己结、或从外周血样品获 得。脾脏细胞和外周血细胞是优选的，前者是因为它们是处于分裂浆母细胞阶段（dividing plasm油last stage)的生产抗体的细胞的丰富来源，后者是因为外周血是容易获得的。通 常，将一栏（a panel of)动物免疫，将具有最高抗体效价的动物的脾脏取出，通过用注射器 将脾脏均质化来获得脾淋己细胞。通常，来自免疫的小鼠的脾脏含有大约五千万到两亿淋 己细胞。
[0109] 适用于生产杂交瘤的融合步骤的骨髓瘤细胞系优选是非抗体生产性的、具有高融 合效率、和酶缺陷的，所述酶缺陷使得它们不能在某些选择培养基中生长，所述选择培养基 仅支持期望的融合细胞（杂交瘤）的生长。可W使用许多骨髓瘤细胞中的任一种，如本 领域技术人员已知的。可得到的鼠骨髓瘤系，例如来自美国典型培养物保藏中屯、（ATCC)， lOSOlUniversity Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA 的那些，可用于杂交。例如，当 免疫的动物是小鼠时，人们可W使用P3-X63/A妍、X63-A妍.653、NS1/1. Ag 41、Sp210-Agl4、 FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1. 7 和 S194/5XX0Bul ;对于大鼠，人们可 W使用 R210. RCY3、Y3-Ag 1. 2. 3、IR983F 和 4B210 ;U-266、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2 和 UC729-6 在 人细胞融合方面都是有用的。一种优选的鼠骨髓