一种检测乳腺肿瘤预后生物标记物LncRNA的方法及临床应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种检测乳腺肿瘤预后生物标记物LncRNA 的方法及临床应用。
【背景技术】
[0002]人体中编码蛋白质的基因大约有2-3万个，仅占人类基因组的2 %，其 余9 8 %不编码蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的，是生物体中的垃圾， 通常被称为"垃圾DNA。但目前的研究表明，这些垃圾DNA大多可转录产生非编 码RNA(non-codingRNA,ncRNA)。根据成熟转录本大小的不同，ncRNA可分为小分 子ncRNA(如siRNA，miRNA，piRNA等），中等长度ncRNA(70_200nt)和长ncRNA(long ncRNA,LncRNA, >200nt)。目前，ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA，而对LncRNA的研究 还处于起步阶段。由于序列内部存在过多的终止密码子，LncRNA不能被翻译成蛋白质，他 们通常是以RNA转录本的形式行使其生物学功能，如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细 胞凋亡和类固醇代谢等，越来越多的证据表明LncRNA在细胞中起着调控基因表达的重要 作用。最近的研究发现LncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系，起乳腺肿瘤抑制基因作 用的LncRNA表达下降或者缺失会导致乳腺肿瘤的发生，已经发现LncRNA与肺癌、非霍杰金 淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等乳腺肿瘤疾病有关。这些研究结果都 表明LncRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用，乳腺肿瘤相关LncRNA的发现可 能会对乳腺肿瘤的诊断及基因治疗产生重大的影响。通过大范围分析乳腺肿瘤和正常组织 的IncRNA，可以鉴定与乳腺肿瘤特异相关的LncRNA，使其成为潜在的病理诊断标记。因此， 发现乳腺肿瘤特异性表达的LncRNA，这对乳腺肿瘤预后诊断和治疗具有重要的临床指导意 义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供一种检测乳腺肿瘤预后生物 标记物LncRNA的方法及临床应用。
[0004] 本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。
[0005] 这种LncRNA分子，所述核酸分子选自：
[0006]1)、序列表中SEQIDNol、SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5 所 不的核酸分子；
[0007]2)、与序列表中SEQIDNol、SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5 所示的核酸序列具有90%或以上同源性的核酸分子。
[0008] 所述的LncRNA分子作为乳腺肿瘤预后标志物的应用。
[0009] -种LncRNA分子的检测方法，在分离的乳腺肿瘤样本中检测LncRNA分子的方法 采用杂交法、扩增法或测序法。
[0010] 所述杂交法为Northern杂交、基因芯片杂交及原位杂交法。
[0011] 所述扩增法为实时荧光定量聚合酶链式反应。
[0012] 所述测序法为高通量测序。
[0013] 所述的乳腺肿瘤样本是乳腺肿瘤组织样本、血清、血浆、口腔粘液、尿液或体液。
[0014] 一种探针，该探针能够检测所述的LncRNA分子。
[0015] 所述探针具有SEQIDNo 6所示的核酸序列，同时包括由权利要求1中SEQID Nol、SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5设计的探针序列。
[0016] 所述探针在制备乳腺肿瘤预后检测试剂中的应用。
[0017] -种诊断乳腺肿瘤的预后检测系统，该检测系统包含所述的探针，该系统还包括 逆转录酶及其反应缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、荧光定量PCR反应缓冲 液、人工合成的内参及正常人对照品。
[0018] -组寡聚核酸分子，所述寡聚核酸分子为：
[0019]
[0020] 所述的寡聚核酸分子组合在制备检测试剂中的应用，由5个LncRNA分子延伸的 设计的所有探针序列。
[0021] -种诊断乳腺肿瘤预后的方法，该方法包含以下步骤：
[0022] 1)测定离体样本中段落1所述的LncRNA分子的水平；
[0023] 2)比较被测定样本中段落1所述的LncRNA分子的水平与参考样本中的段落1所 述的LncRNA分子
[0024] 的水平，如果与参考样本相比，被测定样本中该LncRNA分子的水平有显著改变， 其表达超过2倍，
[0025] 说明该Lnc RNA在预后样本中有显著性上调。
[0026] 本发明要解决的技术问题是根据个体样本中非编码RNA的表达水平进行乳腺肿 瘤预后的诊断。本发明要解决的问题还涉及提供用于乳腺肿瘤诊断的方法及相应诊断试 剂。
[0027] 本发明经过广泛而深入的研究，发现并分离出新的可做为乳腺肿瘤标志物的 LncRNA分子：Linc00657、Linc00346、Linc00654、Linc00925、HCG11。该LncRNA分子在正 常组织或者癌旁组织中不表达或表达量很低，在乳腺肿瘤组织中有超过正常组织或者癌旁 组织中2倍的表达。在此基础上完成了本发明。本发明的应用还包括乳腺肿瘤的血清、血 浆、体液、口腔唾液、尿液等。
[0028] 在本发明的第一方面，提供了一组新颖的LncRNA分子，它包含具有SEQIDNol、 SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5所示序列；或者与序列表中SEQIDNol、 SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5所示的核酸序列具有90%或以上同源 性的核酸序列。上述核酸可通过杂交法、扩增法或测序法进行检测。具体地说，扩增法包括 荧光实时定量聚合酶链式反应，杂交法包括芯片杂交和Northern杂交，测序法包括高通量 测序法。
[0029]本发明第二方面提供了检测SEQIDNol、SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、 SEQIDN〇5所示序列的探针或者特异性引物。优选的，所述检测探针具有10序列（SEQID No 6)。10 序列（SEQIDNo6)只是SEQIDNol、SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQ IDN〇5种的一种探针，另外包括由段落1中5个LncRNA分子延伸的设计的所有探针序列。 本发明第三方面提供了一种诊断乳腺肿瘤预后的检测系统，该系统包含上述检测探针；或 该系统包含上述检测引物，在较佳的实施方式中，该系统还包括逆转录酶及其反应缓冲液、 四种脱氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、荧光定量PCR反应缓冲液、人工合成的内参及正常 人对照品。
[0030] 本发明第四方面提供了一种诊断乳腺肿瘤预后效果评价的方法，该方法包含以下 步骤：
[0031] 1)测定离体样本中SEQIDNol、SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQID No5的表达水平；
[0032] 2)比较被测定样本中SEQIDNol、SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQID No5的水平与参考样本中的SEQIDNol、SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5 的水平，如果与参考样本相比，被测定样本中LncRNA分子有表达，且表达超过2倍以上，说 明乳腺肿瘤预后效果差。
[0033]测定离体样本中SEQIDNol、SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5 的LncRNA分子的表达水平的方法，可以为杂交法、扩增法或测序法。具体地说，扩增法包括 荧光实时定量聚合酶链式反应，杂交法包括芯片杂交和Northern杂交以及原位杂交，测序 法包括高通量测序法。如果通过上述方法测定的离体样本中SEQIDNolLncRNA分子的表 达水平比参考样本中该寡聚核酸分子的表达水平升高，且高出正常组织或者癌旁组织2倍 以上，则说明存在乳腺肿瘤预后差的风险。
[0034] 本发明的有益效果为：
[0035](1)、本发明筛选出一组新的长非编码RNA，该RNA可作为乳腺肿瘤预后效果诊断 的特异性标志物。
[0036] (2)、通过高通量测序技术筛选了一组在乳腺癌和对应癌旁或者正常样本表达差 异的LncRNA。
[0037](3)、将筛选出一组的LncRNA作为新型的乳腺癌检测特别是预后的分子标记物， 制备用于乳腺癌预后检测的试剂盒和生物芯片，具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低等 优点。
[0038](4)、采用一组LncRNA作为新的乳腺肿瘤预后标记物，将改进单一的标记物所难 以克服的个体差异所带来的低差异和低灵敏性，可有效提高乳腺疾病人预后效果评价从而 指导临床治疗指南。
[0039] (5)、LncRNA检测技术的优势在于，其