一种确定食道癌病人生存预后的试剂的制作方法

专利名称：一种确定食道癌病人生存预后的试剂的制作方法
技术领域：
本项申请涉及根据病人的microRNA水平来进行疾病(例如食管癌)诊断、预后和提高生存率的方法。
背景技术：
食管癌是消化道的第三大癌，也是全球癌症致死的第七大起因。食管癌最常见的类型是鳞状上皮细胞癌和腺癌。鳞状上皮细胞癌发生于沿食管排列的扁平细胞。腺癌发生于食管内层并和Barrett’ s食管相关。食管鳞状上皮细胞癌具有典型的从侵袭前发育异常到侵袭性鳞状上皮细胞癌的发展阶段，晚期通常伴随转移(Wen et al. , Fam. Cancer. 2006 May 25 ； [Epub ahead of print])。食管癌通常伴随许多基因的表达变化。比如，C0X-2和VEGF通常和化生发展与发育异常有关，和癌症有关，和潜在转移有关(Liang et al, Cancer Res. 2006,66 7111-7118 ；Vallbohmer et al,Arch Surg. 2006,141 :476-481 ；Fam. Cancer. 2006 May 25， [Epub ahead of print] ；Matsumoto et al, J Gastrointest Surg. 2006,10 :1016-1022 ; Soma et al, Int J Cancer. 2006,119 :771-782)。microRNA(miRNA)是一类小的、22个核苷酸长的非编码单链RNA，部分或完全与靶标序列同源，与靶标mRNA分子的非编码区(3:_相互作用(Bartel, Cell 2004， 116 =281-297)。miRNA和靶标mRNA的相互作用阻止mRNA翻译为蛋白。在一些情况下，当靶标mRNA和miRNA精确匹配时，mRNA也会发生降解。miRNA参与一系列细胞过程，例如细胞分化、细胞生长和细胞死亡(Cheng et al, Nucleic Acids Res 2005,33 :1290-7 John et al, PLoS Biol. 2004，2 :e363)。据估计人类基因组上存在多达 1000 个 miRNA(Zamore and Haley, Science 2005,309 :1519-1524)。约有三分之一的人类mRNA可能是潜在的miRNA靴标(Lewis et al, Cell 2005,115 :787-798) 越来越多的证据表明，不同的miRNA序列对于癌症的发生和发展起着重要的作用 (Lu et al, Nature 2005,435 :834-838 ；Volinia et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103 :2257-2261 ；Wynter, Med. Hypotheses. 2006,66 :612-35 ；Li et al,Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006，348 :229-237)。miRNA基因通常位于基因组上癌症容易发生修饰的位点，例如脆性位点(FRAs)，断裂点和区域，基因组扩增的最小区域，以及失异质性的区域(Calin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002,99 :15524-15529 ；Calin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004,101 :2999-3004)，以上说明癌症中所观察到的一些miRNA表达水平的变化是基因组不稳定性的结果。人们利用miRNA 芯片表达谱(Babak et al.，RNA 2004,10 :1813-9 ；Barad et al. ， Genome Res. 2004,14 :2486-94 ；Calin et al. ， Proc Natl Acad Sci USA. 2004,101 11755-11760 ；Liu et al.，Proc Natl Acad Sci USA. 2004,101 :9740-4 ；Nelson et al.， Nat Methods 2004，1 :155-61 ；Thomson et al.，Nat Methods 2004，1 :47-53 ；Ciafre et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005,334 1351-1358 ；Shingara et al. , RNA 2005, 11 :1461-1470)，磁珠杂交(Lu et al. , Nature 2005，435 :834-838)和 RT_PCR(Bandres et al. ,Mol Cancer 2006，5 :29)来研究癌症组织的miRNA表达水平。在许多癌症中都发现了 miRNA表达水平变化，例如慢性淋巴细胞性白血病(Calin et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 2004，101 :11755-11760)，直肠癌(Bandres et al.，Mol Cancer 2006，5 :29)，胶质母细胞瘤(Ciafre et al.，Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005,334 :1351-1358)和胸腺癌 (Iorio et al. , Cancer Research 2005,65 :7065-7070) 目前，一些保存的癌症组织活组织切片，如福尔马林保存的石蜡包埋组织(FPPE) (Nelson et al. ,RNA 2006，12 187-191)， 冰冻保存组织(Lu et al, Nature 2005，435 :834-838)，或两种方法各保存的组织同时应用(He et al, Nature 2005，435 :拟8_833)，或其他未明确说明保存情况的组织(Volinia et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 2006，103 :2257-2261 ；Yanaihara et al. ,Cancer Cell 2006,9 :189-198)都被成功应用于癌症中miRNA表达谱的分析。此处所涉及的所有出版物、专利、专利申请以及已公开的专利申请均完整地列为参考文献。

发明内容
本发明涉及根据miRNA的水平或相应基因的状态，进行癌症的诊断和预后，特别是用于食管癌的诊断和预后。另外本发明也提供了应用探针用于癌症的诊断和预后，特别是应用检测miRNA或相应基因状态探针用于癌症的诊断和预后，特别是食管癌的诊断和预后。与此相应，本发明提供了个体癌症诊断的方法，该方法包含以下步骤a)测定个体组织样品中至少一种miRNA水平，b)比较测定样品中的miRNA水平与参考miRNA水平， 如果测定样品组织中miRNA水平同参考miRNA水平比较有明显改变，说明个体有癌变。另一方面，本发明提供了在个体中诊断食道癌方法，该方法包含以下步骤a)测定个体食管组织样品中怀疑有癌变部分的至少一种miRNA水平，例如测定图1中的miRNA 中的至少一种或其相应的同源物，b)比较测定样品中的miRNA水平与参考miRNA水平，如果测定样品组织中miRNA水平同参考miRNA水平比较有明显改变，说明个体有食道癌。具体地说，上述方法测定的食管癌可以为食管鳞癌，也可以是食管腺癌。具体地说，在上述方法中测定的miRNA不是miRj9b、miRj9a、miR-96、miR-182s、 miR-182as、miR-183 和 miR-U9_l，也不是 miR-15 和 miR-16。具体地说，在上述食道癌诊断方法中，至少一个(例如也可以至少是2，5，10，14 个)从含有SEQ ID Nos. 1-14的选择的miRNA水平或它们相应的同源物水平被测定；如果在检测中结果中至少有一个含有SEQ ID Nos. 1-14的miRNA或它们相应的同源物有显著升高，表明样品中有食道癌。在另外一些具体情况下，至少一个从含有SEQ ID Nos. 15-38选择的miRNA或它们相应的同源物的水平被测定，如果在检测中结果中至少有一个含有SEQ ID Nos. 15-38的miRNA或它们相应的同源物有显著降低，表明样品中有食道癌。具体说，在上述方法中至少一个从SEQ ID Nos. 1-14中选择的miRNA和至少一个从SEQ ID Nos. 15-38的miRNA中选择，如果在检测中结果中至少有一个含有SEQ ID Nos. 1-14的miRNA有显著升高和至少一个SEQ ID Nos. 15-38的miRNA有显著降低，表明样品中有食道癌。具体地说，在上述方法中测定miRNA的水平用生物芯片分析方法。具体地说，在上述方法中miRNA水平通过芯片上miRNA的杂交信号确定。具体地说在上述方法中miRNA水平通过芯片上miRNA的杂交信号与参考样品杂交信号之间比率确定。具体地说上述方法中miRNA水平用Northern杂交、原位杂交和定量逆转录聚合酶链反应方法中的任一方法确定。具体说，一种在人体中诊断食道癌的方法，该方法包含分析人体中食管组织样品中怀疑有癌变的组织部分中至少一种miRNA相应的基因状态，例如在图1中的miRNA相应的基因状态；比较检测样品中的miRNA的基因状态与参照品miRNA的基因状态，如果检测样品组织中的miRNA的相应基因同参照品miRNA中基因相比较有明显改变，说明人体有食道癌。具体说，上述方法中测定miRNA的基因状态通过基因删除或扩增来确定。具体说，在上述方法中确定miRNA的基因改变是根据基因拷贝数的改变。具体说，本发明提供了用于测定至少一个如图1所示miRNA或它们的相应类似物 (或者相应的miRNA基因状态)的水平的系统，例如微阵列芯片；该系统由多个探针组成， 每个探针可以检测食管组织样本中的一个miRNA或相应miRNA的基因状态，至少有15 % (包括例如至少20 %、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探针能够检测如图1中所示的miRNA或它们的相应类似物，或相应miRNA的基因状态。具体说，本发明提供了一个来诊断食管癌的系统，例如微阵列芯片；该系统由许多探针组成，每个探针可以检测样本中的一个miRNA (或相应miRNA的基因状态)，至少有15% (包括例如至少20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%)的探针能够检测如图1中所示的miRNA(或相应 miRNA的基因状态)。具体说，本发明提供了应用一个系统来诊断食管癌，该系统由至少一个(包括例如至少2、5、10、15、20、25、30、35和40个)探针组成，例如寡核苷酸，每个探针可以检测如图1中所示的miRNA水平或相应miRNA的基因状态，如果如图1中所示的miRNA水平或它们相应的类似物，或相应miRNA的基因状态中的至少一个有明显改变，说明有食管癌。具体说，本发明提供了应用系统来诊断食管癌，例如微阵列芯片，该系统由许多探针组成，每个探针可以检测样本中一个miRNA或相应miRNA的基因状态的水平，其中至少有15% (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%)的探针能够检测如图1中所示的miRNA或它们的相应类似物，或相应miRNA的基因状态的水平，如果如图1中所示的 miRNA或它们的相应类似物或相应miRNA的基因状态的水平有明显变化表明有食管癌。本发明也提供了检测miRNA的探针用于制备上述系统。具体说，本发明提供了用一个或多个探针(例如寡核苷酸)来制造用于诊断个体食管癌的系统，每个探针可以检测如图1中所示的miRNA或它们的相应类似物，或相应miRNA的基因状态水平。具体说，本发明用探针(例如寡核苷酸)来制造用以诊断食管癌的系统(例如微阵列芯片)，每个探针可以检测样本中一个miRNA的水平或相应miRNA的基因状态，至少有15% (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探针能够检测如图1中所示的 miRNA或它们的相应类似物，或相应miRNA的基因状态水平。另一方面，本发明还提供了食管癌患者分型的方法，例如确定食道癌的分化水平、肿瘤分期和病理类型。具体说，本发明提供了划分食管癌病人的方法，包括例如判定分化水平、肿瘤分期和病理类型，该方法包含检测个体食管癌组织中至少一个miRNA，例如表2 中所示的miRNA或它们的相应类似物，或相应miRNA的基因状态，而miRNA的水平或相应 miRNA的基因状态是作为划分食管癌病人的基础。具体说，本发明提供了决定个体食管癌分化水平的方法，包含检测个体食管癌组织中如图加中所示的miRNA或它们的相应类似物的水平，或相应miRNA的基因状态，而 miRNA的水平或相应miRNA的基因状态是作为决定个体食管癌分化水平的基础。具体说，检测的miRNA至少一个是hsa-miR-335或它的相应类似物。在某些情况下，至少一个miRNA 是hsa-miR-25或它的相应类似物。具体说，检测的miRNA至少一个是hsa_miR-130b或它的相应类似物。具体说，检测的miRNA至少一个是hSa-miR-130a或它的相应类似物。具体说，检测的miRNA至少一个是hsa-miR-181d或它的相应类似物。具体说，本发明提供了一个系统来检测样本中至少一个如表2所示miRNA或它们的相应类似物，或者相应的miRNA基因状态的水平，例如微阵列系统，该系统包含有多个探针，每个探针可以检测样本中的一个miRNA或相应miRNA的基因状态，至少有15% (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探针能够检测如表2中所示的miRNA或它们的相应类似物(或相应miRNA的基因状态)。具体说，本发明提供了通过一个系统来划分食管癌患者，例如微阵列；该系统由多个探针组成，每个探针可以检测样本中的一个miRNA或相应miRNA的基因状态水平，至少有15% (包括例如至少20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探针能够检测如表2中所示的miRNA或它们的相应类似物(或相应miRNA的基因状态)的水平。具体说，本发明提供了应用一个系统来划分食管癌患者，该系统由一个或多个探针组成，每个探针可以检测如表2中所示的miRNA或它们的相应类似物的水平，或相应 miRNA的基因状态。具体说，本发明提供了应用一个系统来划分食管癌患者，系统由一个或多个探针组成，每个探针可以检测样本中的一个miRNA，至少50 %的探针能够检测如表2中所示的miRNA或它们的相应类似物的水平。具体说，本发明提供了应用一个或多个探针来制造用以划分食管癌患者的系统， 每个探针可以检测如表2中所示的miRNA或它们的相应类似物的水平，或相应miRNA的基因状态。具体说，本发明提供了应用探针来制造用以划分食管癌患者的系统，例如微阵列； 每个探针可以检测样本中的一个miRNA的水平或相应miRNA的基因状态水平，至少有15% (包括例如至少20 %、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探针能够检测如表2中所示的miRNA或它们的相应类似物(或相应miRNA的基因状态)的水平。具体说，本系统应用于确定个体食管癌患者食道癌的分化水平。具体说，本系统应用于从病理上划分食管鳞状上皮细胞癌。具体说，本系统可以应用于确定个体食管癌的肿瘤分期。本发明另外一方面提供关于判断食管癌患者预后的方法，包括判断食管癌患者的生存预后。具体说，提供了判断食管癌患者的生存预后方法，该方法包含以下步骤a) 检测个体食管癌组织样本中至少一个miRNA的水平，b)将该miRNA的水平和临界值相比较，该比值与个体的生存率成正相关或负相关。具体说，本发明提供了判断食管癌患者的生存预后的方法，包括分析至少一个miRNA基因状态，例如hsa-miR-103、hsa-miR-107和
6hsa-miR-23b中的一个的基因状态，和对照样本相比基因状态的有变化说明患者的高生存率或低生存率。具体说，上述miRNA 中至少一个是 hsa-miR-103、hsa-miR-107 或 hsa_miR-23b 中的一个或它们的相应类似物。具体说，至少一个miRNA是hsa-miR-107。具体说，至少一个 miRNA是hsa-miR-23b。具体说，生存率是总生存率。具体说，生存率是无病生存率。具体说，个体处于食管癌早期。具体说，该方法还包括决定个体的适宜疗程。本发明还提供了应用可以检测miRNA水平或相应miRNA的基因状态的探针，或应用包含有一个或多个探针的系统的用于判定生存预后。具体地说，本发明提供一个或多个探针或包含有由一个或多个探针组成的系统来判定食管癌患者的生存预后，每个探针可以检测样本中的一个miRNA，将该miRNA的水平和临界值相比较，该比值与该个体的生存率成正相关或负相关。具体说，本发明提供了应用一个或多个探针来判定食管癌患者的生存预后，将miRNA的水平和临界值相比较，该比值与该个体的生存率负相关，这些miRNA至少有一个是 hsa-miR-103、hsa-miR-107 或 hsa_miR-2;3b 或它们的相应类似物。具体说，本发明提供了应用一个或多个探针来制造用以预测食管癌患者生存预后的试剂(或系统)，每个探针可以检测样本中的miRNA，将该miRNA的水平和临界值相比较， 该比值与该个体的生存率成正相关或负相关。具体说，提供了用一个或多个探针来制造用以预测食管癌患者生存预后的试剂(或系统)，miRNA水平与临界的比值与该个体的生存率负相关，这样的miRNA至少有一个是hsa-miR-103、hsa-miR-107或hsa_miR-2;3b或它们的相应类似物。具体说，至少有一个 miRNA 是 hsa-miR-103、hsa-miR-107 或 hsa_miR-23b。本发明同时提供了提高食管癌患者生存率的方法。具体说，本发明提供了提高食管癌患者生存率的方法，该方法包含给患者提供降低某种miRNA水平的有效量的试剂， 这种miRNA水平与阈值的比值与该个体的生存率负相关。具体说，本发明提供了降低某种 miRNA水平的试剂在制备药物中的应用，该药物用来提高食管癌患者生存率，这种miRNA水平与临界值的比值与该个体的生存率负相关。具体说，本发明提供了提高食管癌患者生存率的方法，该方法包括给与患者有效剂量来降低某种 miRNA 水平的试剂，miRNA 包括 hsa-miR-103、hsa-miR-107、hsa_miR-23b 或它们的相应类似物。具体说，本发明还提供了使用降低某种miRNA水平的试剂，在制备提高食管癌患者生存率的药物中应用，此类miRNA包括hsa-miR-103、hsa-miR-107、 hsa-miR-23b或它们的相应类似物。具体说，这些试剂至少同时降低hsa-miR-103、 hsa-miR-107或hsa-miR-23b中的两种。具体说，这些试剂可以同时降低hsa-miR-103、 hsa-miR-107 禾口 hsa_miR-23b。具体说，本发明提供了含有至少能够降低一种miRNA水平的试剂和一种药物可应用的载体的药物复合物，该药物复合物能降低的miRNA包括hsa-miR-103、hsa-miR-107 或hSa-miR-2;3b或它们的相应类似物中的至少一种。某些情况下，至少一个miRNA是 hsa-miR-103 ο具体说，至少一个miRNA是hsa-miR-107。具体说，至少一个miRNA是 hsa-miR-23b0具体说，此种药物是双链RNA (例如短的或小的干扰RNA，或siRNA)、反义核苷酸或具有酶活性的RNA分子例如核酶。本发明还包括提供上述各种方法的试剂盒。


图1在食管癌患者中水平发生变化的miRNA。图加在不同分化阶段的食管癌患者中水平发生变化的miRNA。图2b在了菌伞型以及髓质型食管鳞状上皮细胞癌中水平发生变化的miRNA图2c在不同肿瘤期(N0/N1)的食管癌患者中水平发生变化的miRNA。图3表达水平与食管癌生存率负相关的miRNA。图4用微阵列显著性分析(SAMs)方法所挑选出的miRNA的聚类分析。有40个 miRNA在冰冻的食管癌组织和癌旁组织中差异表达，对31对样本组中这40个miRNA的表达谱进行聚类分析。样本按列排列，miRNA按行排列。标有#的样本表示“错误分类”。图5比较了新鲜组织和冰冻组织的miRNA表达谱。miRNA表达谱通过5对新鲜组织验证。这10个样本用SVM方法验证，证实10个样本全部正确分类。标有#的训练样本提示“错误分类”。图6是食管癌患者的Kaplan-Meier生存曲线。图6A提示hsa_miR-103的低表达(n = 15)和食管癌患者的总生存率正相关，hsa-miR-103的高表达(n = 16)和食管癌患者的总生存率负相关。图6Β提示hsa-miR-107的低表达(n = 14)和食管癌患者的总生存率正相关，hsa-miR-107的高表达(n = 17)和食管癌患者的总生存率负相关。图C提示 hsa-miR-23b的低表达(n = 17)和食管癌患者的总生存率正相关，hsa-miR-23b的高表达 (n = 14)和食管癌患者的总生存率负相关。图D提示hsa-miR-103的低表达(n = 15)和食管癌患者的无病生存率正相关，hsa-miR-103的高表达(n = 16)和食管癌患者的无病生存率负相关。图E提示hsa-miR-107的低表达(n = 14)和食管癌患者的无病生存率正相关，hsa-miR-107的高表达(n = 17)和食管癌患者的无病生存率负相关。
具体实施例方式此项发明主要基于对31对正常食管组织和食管癌组织进行的基因组水平的 miRNA表达谱研究。具体来说，即是用微阵列芯片比较癌组织和相应癌旁组织中的miRNA表达差异。我们找到40个在癌组织中高表达或低表达的miRNA。我们还找到了不同疾病状态下表达有差异的miRNA。此外，我们还发现三个miRNA的水平与食管癌患者的总生存率以及无病生存率相关。此项发明基于某些miRNA的表达水平或相应基因的状态，为癌症(例如食管癌) 的诊断和预后提供了方法和药物。从一个方面来说，我们提供了基于某些miRNA表达水平的有关癌症(例如食管癌) 诊断的方法和药物。从另一个方面来说，我们还提供了基于某些miRNA表达水平的，根据病理类型、分化水平和肿瘤分期来划分癌症患者，尤其是食管癌患者的方法。从另一个方面来说，我们还提供了基于某些miRNA表达水平的，判定癌症患者，尤其是食管癌患者的生存预后的方法和药物。从一个方面来说，我们提供了用RT-PCR检测miRNA表达水平的方法，用以诊断疾病。此项发明提供了上述所有方法的系统和试剂盒。“个体”表示一个脊椎动物，尤其是哺乳动物，特别是人。哺乳动物不仅指家畜、野畜、宠物、灵长类、小鼠和大鼠。在某些情况下，个体是指人。在某些情况下，个体是指用以研究食管癌的模式动物。也就是说，如果个体指的不是人，那么miRNA就是指对应人源miRNA 的相应类似物或同源物。在某些情况下，个体是指男性。在某些情况下，个体是指女性。在某些情况下，个体并不代表食管癌的病理类型。在某些情况下，个体是指有食管癌家族史。这里所说的一个“食管组织样本”是指食管的组织样本。在某些情况下，组织样本是新鲜组织。在某些情况下，组织样本是冰冻组织。在某些情况下，组织样本是被固定的。 在某些情况下，组织样本被甲醛固定。在某些情况下，组织样本被石蜡包埋。如下所述，根据具体的方法，使用完整组织，或者使用被分成小块的组织，或者是细胞团块或单个细胞。食管癌包括，但不局限于食管鳞状上皮细胞癌和食管腺癌。用以诊断癌症，特别是食管癌的方法和药物从一个方面来说，此项发明为个体疾病(例如癌症)诊断提供的方法包括a)检测来自某个个体样本的至少一个miRNA的水平；b)将该miRNA的水平和对照相比较，miRNA 水平的典型变化可作为疾病(例如癌症)的提示。用此项发明可以诊断的疾病包括癌症，例如肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、大肠癌、胰腺癌、白血病、淋巴瘤、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌；心血管疾病，例如冠状动脉性心脏病、高血压、动脉硬化；年龄相关性疾病，例如帕金森氏病、阿尔茨莫氏病、糖尿病。从一个方面来讲，此项发明为食管癌诊断提供的方法包括a)检测来自某个食管癌疑似病例的食管组织样本的至少一个miRNA(例如图1中显示的至少一个miRNA或它们相应的同源物)的水平；b)将该miRNA的水平和参照相比较，miRNA水平的特征性变化可作为食管癌的提示。在某些情况下，此项发明为食管癌诊断提供的方法包括a)将来自某个食管癌疑似病例的食管组织样本的miRNA (例如图1中显示的至少一个miRNA或它们相应的同源物) 水平和参照相比较；b)根据至少一个miRNA水平的特征性变化来判断个体是否患有食管癌。在某些情况下，方法还包括从个体取得食管组织样本的步骤。在某些情况下，方法还包括从组织样本提取miRNA的步骤。在某些情况下，此项发明为食管癌诊断提供的方法包括a)检测来自某个食管癌疑似病例的食管组织样本的至少一个miRNA(例如图1中显示的至少一个miRNA或它们相应的同源物)的水平；b)根据该miRNA的水平为食管癌诊断提供信息，该miRNA的水平可以作为诊断基础，该miRNA水平的特征性变化可作为食管癌的提示。在某些情况下，miRNA不是 miRj9b，miR-29a, miR-96, miR-182*，miR_182a*， miR-183，和 miR-U9_l，在某些情况下，miRNA 不是 miR-15 和 miR-16。在某些病例，检测SEQ ID编号1-14或相应类似物中至少一个miRNA(例如至少是 2、5、10中的一个)的水平，其中至少一个miRNA水平的显著增加可提示食管癌。在某些病例，检测SEQ ID编号15-38或相应类似物中至少一个miRNA (例如至少是2、5、10、15、20、24 中的一个)的水平，其中至少一个miRNA水平的显著增加可提示食管癌。在某些病例，检测 SEQ ID编号1-14或相应类似物中至少一个miRNA (例如至少是2、5、10、14中的一个)以及 SEQ ID编号15-38或相应类似物中至少一个miRNA (例如至少是2、5、10、14中的一个)，其中图1中编号1-14 WmiRNA以及它们相应类似物中至少有一个miRNA水平显著增加，同时编号15-38的miRNA以及它们相应类似物中至少有一个miRNA水平显著下降可以提示食管癌。在某些病例，我们检测图1所示的所有miRNA的水平，SEQ ID编号1_14中至少一个miRNA(例如至少是2、5、10中的一个)的水平升高，同时SEQ ID编号15-38中至少一个 miRNA (例如至少是2、5、10、14中的一个)的水平下降可以提示食管癌。在某些情况下，SEQ ID编号1-14中至少两个miRNA的水平升高，同时SEQ ID编号15-38中至少两个miRNA的水平下降可以提示食管癌。在某些情况下，SEQ ID编号1-14中的miRNA的水平升高，同时 SEQ ID编号15-38中的miRNA的水平下降可以提示食管癌。组织样本中miRNA的水平可以反映miRNA基因状态的变化。基因状态的改变可由 miRNA基因缺失或扩增来反映或是由miRNA基因的拷贝数变化来反映。因此在某些情况下，我们为食管癌诊断提供的方法包括分析来自食管癌疑似病例的组织样本的至少一个miRNA(例如图1中显示的至少一个miRNA或它们相应的同源物) 基因状态，相比于对照样本如果发生基因状态的改变可以提示食管癌。在某些情况下，基因状态的改变由miRNA基因缺失或扩增来决定，在某些情况下，基因状态的改变由miRNA基因的拷贝数变化来决定。在某些情况下，我们为食管癌诊断提供的方法包括分析来自食管癌疑似病例的组织样本的至少一个图1中所示的miRNA，看该miRNA基因是否有缺失或扩增，相比于对照样本如果发生基因缺失或扩增来可以提示食管癌。例如，在某些情况下，我们分析SEQ ID编号1-14中的miRNA基因是否发生扩增，至少一个miRNA基因的扩增可以提示食管癌。在某些情况下，我们分析SEQ ID编号15-38中的miRNA基因是否发生缺失，至少一个miRNA基因的缺失可以提示食管癌。在某些情况下，方法还包括从疑似病例取得食管组织样本的步骤。在某些情况下，方法还包括从组织样本提取DNA的步骤。在某些情况下，我们为食管癌诊断提供的方法包括分析来自食管癌疑似病例的组织样本中，是否有图1中所示的miRNA基因拷贝数的变化。女性常染色体或性染色体上如果有多于两个miRNA基因，男性性染色体上如果有多于一个miRNA基因可以提示食管癌。例如，在某些情况下，我们分析SEQ ID编号1-14中的miRNA基因的拷贝数，至少一个miRNA 基因如果在女性常染色体或性染色体上有多于两个拷贝数，男性性染色体上有多于一个拷贝数可以提示食管癌。在某些情况下，我们分析SEQ ID编号15-38中的miRNA基因的拷贝数，至少一个miRNA基因如果在女性常染色体或性染色体上少于两个拷贝数，男性性染色体上少于一个拷贝数可以提示食管癌。在某些情况下，方法还包括从疑似病例取得食管组织样本的步骤。在某些情况下，方法还包括从组织样本提取DNA的步骤。这里所描述的miRNA有如下作用根据食管癌组织样本中一个以上miRNA的水平以及一个以上miRNA基因状态来划分食管癌病人类型、预测食管癌的进展、监测食管癌病人的病程和监测食管癌病人的治疗。在某些情况，我们提供用来检测如图1所示miRNA或它们的相应类似物水平的系统(例如微阵列)，或提供用来检测如图1所示miRNA或它们的相应类似物的基因状态的系统(例如微阵列)。这些系统对于判定如图1所示miRNA或它们的相应类似物水平以及诊断食管癌十分有用。下面着重讲述用以检测miRNA水平的系统，但对于熟悉此类操作的人员来说，亦可熟练掌握检测miRNA基因状态的系统。在某些情况，我们通过一个系统(例如微阵列)来判定至少一个如图1所示miRNA 或它们的相应类似物(或者相应的miRNA基因状态)的水平，系统由许多探针组成，每个探针可以检测食管组织样本中的一个miRNA (或相应miRNA的基因状态)，至少有15 % (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的探针能够检测如图1中所示的miRNA或它们的相应类似物(或相应miRNA的基因状态)。在某些情况，我们通过一个系统(例如微阵列)来诊断食管癌，系统由许多探针组成，每个探针可以检测样本中的一个miRNA (或相应miRNA的基因状态)，至少有15 % (包括例如至少20 %、30 %、40 %、50 %、 60%、70%、80%、90%或95% )的探针能够检测如图1中所示的miRNA(或相应miRNA的基因状态)。在某些情况，我们通过一个系统(例如微阵列)来诊断食管癌，系统由至少一个 (包括例如至少2、5、10、15、20、25、30、35和40个)探针(例如寡核苷酸)组成，每个探针可以检测如图1中所示的miRNA水平(或相应miRNA的基因状态)。下面将详细描述这些系统(例如微阵列)。这些诊断食管癌的系统可以有多种作用。在某些情况，我们通过一个系统来诊断食管癌，系统由至少一个(包括例如至少2、5、10、15、20、25、30、35和40个)探针(例如寡核苷酸)组成，每个探针可以检测如图1中所示的miRNA水平(或相应miRNA的基因状态)，因而如图1中所示的miRNA或它们相应的类似物(或相应miRNA的基因状态)中至少一个的水平特征性变化可以提示食管癌。在某些情况，我们通过一个系统(例如微阵列) 来诊断食管癌，系统由许多探针组成，每个探针可以检测样本中一个miRNA(或相应miRNA 的基因状态)的水平，因而至少有15% (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80^^90%或95% )的探针能够检测如图1中所示的miRNA或它们的相应类似物(或相应 miRNA的基因状态)的水平，而如图1中所示的miRNA或它们的相应类似物(或相应miRNA 的基因状态)的水平特征性变化可以提示食管癌。以下是关于制造系统所用的检测miRNA的探针的描述。在某些情况，我们用一个或多个探针(例如寡核苷酸)来制造用以诊断个体食管癌的系统，每个探针可以检测如图1 中所示的miRNA或它们的相应类似物(或相应miRNA的基因状态)的水平。在某些情况， 我们用探针(例如寡核苷酸)来制造用以诊断食管癌的系统(例如微阵列)，每个探针可以检测样本中一个miRNA的水平(或相应miRNA的基因状态)，至少有15% (包括例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%)的探针能够检测如图1中所示的 miRNA或它们的相应类似物(或相应miRNA的基因状态)的水平。诊断食管癌所涉及的miRNA现有的发明确定了 40个水平与食管癌相关的miRNA。如表2和图1所示。图1提供了这些miRNA的名称、序列和染色体定位。可以通过http://miRNA. sanger. ac. uk/.(参 JAL Griffths-Jones et al. , Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34,Database issue)得到这些miRNA的信息。诊断食管癌的方法基于图1所示的miRNA水平和基因状态。这里所描述的系统就是用来监测图1所示的miRNA水平，进而诊断食管癌。通过实践，可以确定这些方法用以检测单个miRNA的可接受灵敏度和特异性，然而当检测两个以上miRNA时方法的有效性(例如灵敏度和特异性)将会大大提高。例如， 在某些情况下，至少要检测图1中的3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35或38号miRNA。
在某些情况下，我们至少检测SEQ ID编号1_14中的两个miRNA (例如至少是3、 5、10中的一个)。在某些情况下，我们至少检测SEQ ID编号15-38中的两个miRNA (例如至少是3、5、10、15、20中的一个)。在某些情况下，我们至少检测SEQ ID编号1_14中的一个miRNA和SEQ ID编号15-38中的一个miRNA的基因状态。在某些情况下，我们至少检测 SEQ ID编号1-14中的两个miRNA (例如至少是3、5、10中的一个)和SEQ ID编号15-38中的两个miRNA(例如至少是3、5、10、15、20中的一个)的基因状态。在某些情况下，我们检测图1中所有miRNA的基因状态。在某些情况下，需要判断上述miRNA的相应类似物的水平。上述miRNA的“相应类似物”指的是和miRNA具有至少50%序列相似性的miRNA(也包括至少60%、70%、80%、 90 %、95%、98%和99%的序列相似性)。例如，SEQ ID NO 1号miRNA的相应类似物具有和 SEQ ID NO :1号miRNA至少50%的序列相似性(也包括至少60%、70%、80%、90%、95%、 98%和99%的序列相似性)。和参考序列(SEQ ID NO :1号miRNA)具有95%以上相似性的miRNA可认为和参考序列相同，除非每100个核苷酸有5个点突变。这5个点突变可以是缺失、替换、插入，可以在序列的任何地方发生，可以散布在参考序列中或者集中在参考序列一个或多个簇。基于miRNA水平的食管癌诊断方法在某些情况下，食管癌诊断方法是基于miRNA水平的。这里所说的“水平”是指miRNA或其前体堆积的量或速度。这个词可以指某个样品中miRNA的绝对量(例如用杂交信号强度来表示)，也可以指样品中miRNA量与对照的比值(例如用样品比对照的杂交信号比值)。对照miRNA可以是同一样本中水平相对恒定的不同的miRNA，也可以是不同样本中的同一个miRNA(例如来自同一个体的非癌组织样本， 或者另一个非食管癌个体的组织样本)。miRNA分子的前体或“miRNA前体”指的是未剪切的miRNA基因转录子，典型的包括大约70个核苷酸长度的RNA转录子。miRNA前体被RNA酶(例如Dicer，Argonaut或者 RNA酶III)消化成为活性miRNA分子，典型的为19-25个核苷酸长度。“食管组织样本的miRNA水平”是指组织样本的miRNA水平。在大多数情况下，食管组织样本的miRNA水平是通过直接测量食管组织样本的miRNA水平获得，然而食管组织样本的miRNA水平也可以通过淋巴结(例如邻近的淋巴结或淋巴液)样本、血浆、全血或者邻近的体液如痰液来反映。在某些情况下，miRNA水平是通过淋巴结样本(例如淋巴结活切或针吸)的miRNA水平来决定的。在某些情况下，miRNA水平是通过全血或血浆中的miRNA 水平来决定的。在某些情况下，miRNA水平是食管组织拉网的miRNA水平来决定的。在某些情况下，miRNA水平是通过内窥镜引导取样所得样本中的miRNA水平(例如RT-PCR分析) 来决定的。内窥镜引导的针吸(FNA)采样是侵入性最小的技术，对于纵隔淋巴结非手术性取样尤其适合，并可以进行更详细的分子标志物分析。对非食管癌组织的miRNA水平分析可以单独和与其它方法联合使用。例如，可以首先确定血浆中的miRNA水平，然后分析区域淋巴结的miRNA水平，这样多步骤的分析可以提供更丰富的信息并增加诊断的可信度。可以在不同的时期检测miRNA水平。例如，可以在术前、术中、术后，以及肿瘤治疗前、治疗中、治疗后检测miRNA水平。在某些情况下，miRNA水平是由食管组织拉网所取得的样本(特别是食管组织)中的miRNA水平来决定的。
测定miRNA水平的方法在文献中有报道。例如，Northern斑点杂交，原位杂交， RT-PCR和微阵列。这些方法在文献中有报道，例如Einat，Methods Mol. Biol. 2006,342 139-157 ；Thompson et al.，Genes Dev. 2006,20 :2202-2207.根据经典方法，细胞的总RNA可以通过在核酸提取缓冲液的环境中胞质勻浆化然后再离心获取。核酸被沉淀，DNA通过DNA酶作用再离心后去除。RNA通过标准化技术用凝胶电泳分离，再转移到硝酸纤维素膜，进行Northern斑点杂交等。RNA通过加热固定在膜上。通过与目标RNA互补的荧光标记的DNA或RNA探针来鉴定和定量。在成相膜上通过放射自显影方法也可以鉴定miRNA。扫描成相膜，可以对RNA转录子的水平精确定量。也可以用光成像计算机计算方法对杂交斑点进行RNA水平精确定量。除了 Northern和其他斑点杂交技术，RNA转录子水平还可以通过原位杂交来测定。这项技术是将整个细胞或组织固定在显微镜盖玻片上，利用含有放射线标记的探针或其他方式标记探针(例如cRNA探针)的溶液来测定细胞或组织的核酸。miRNA水平也可通过对miRNA转录子逆转录，然后进行多聚酶链反应(RT-PCR) 来检测。miRNA的水平可以通过和内参相比较来定量，内参可以是同一样本中看家基因的 mRNA等。用作内参的适宜的看家基因包括肌球蛋白、3、磷酸甘油醛脱氢酶或人TO基因。在文献中有定量RT-PCR及其他相关技术的描述。表1列出了 RT-PCR的常用引物。在某些情况下，实时RT-PCR(qRT-PCR)检测miRNA比经典的组织活切或在癌症早期miRNA染色检测方法更加灵敏。qRT-PCR检测miRNA水平对于食管癌的诊断、分类和预后评估来说是更灵敏和特异的方法。现有的发明，提供了用RT-PCR来检测个体(患有疾病，例如癌症的个体) miRNA水平的方法。在某些情况下，miRNA水平用qRT-PCR方法来检测。在某些情况下，miRNA水平用此文描述的微阵列来检测。上述方法中所述的核酸探针可用体外重组或化学合成的方法获得，这在文献中已有报道。另外，杂交探针可用不同的标记方法来标记，例如放射性同位素、荧光物质、报告系统酶、生物素和其他配体。这些可探测的标记物还可以偶联光学检测物质，进而可以用光化学方法来检测。标记和探测的探针在文献中也有报道。用于检测miRNA的核酸探针可以在严格条件下和样本中的miRNA杂交。根据不同的方法，文献中的成熟技术可以改变条件，从而优化对特定样本中特定miRNA的检测。总的来说，杂交物的稳定性依赖于离子浓度和温度。一般来说，杂交反应在低严谨性的条件下进行，然后在高严谨性的条件下洗涤。适度严谨性杂交是指允许核酸分子例如探针和互补核酸分子杂交的条件。杂交的核酸分子至少有60%的相似性，也包括70%， 75 %，80 %，85 %，90 %，或95 %的相似性。适度严谨性杂交条件等价于42°C在50 %甲酰胺、 ^cDenharfs 溶液、5xSSPE、0. 2% SDS 条件下杂交,然后 42°C用 0. 2xSSPE,0. 2% SDS 洗涤。 高严谨性杂交条件可以是42°C在50%甲酰胺、5xDenhart~ s溶液、5xSSPE、0. 2% SDS条件下杂交，然后 65°C用 0. IxSSPE,0. 1% SDS 洗涤。低严谨性杂交是指在与以下条件相当的杂交条件下杂交10%甲酰胺、 5XDenhart' s 溶液、6XSSPE、0. 2 % SDS，22 °C 杂交，然后在 37 °C 用 1XSSPE、0.2% SDS 清洗。Denhart，s溶液含有Ficoll、l%聚乙烯苯三酚和牛血清。20XSSPE(氯化钠、磷酸钠、EDTA)含有3M氯化钠、0. 2M磷酸钠和0.025M EDTA。其他适当的中度严谨性和高严谨性杂交溶液和条件都为此领域内的人熟知，他们也报道过，例如=Sambrooket al, Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd ed, Cold Sping Harbor Press, Plainview, N. Y. (1989) ；and Ausubel et al. , supra,1999)。具体地说，miRNA的水平是在多于一个时间点从一个患者中获得的。这种“连续的”取样的方法很适合于对食管癌患者的癌症发展进行监视。连续取样可以根据需要在不同的时间点进行，如每半年、每年、每两年或更长时间取样一次。测量得到的水平与参考水平之间的比较可以每次测量一个新样品后进行，也可以获得一定测量数据后再进行。在此描述的方法，参考水平指的是某种miRNA通常被认为“正常”的水平。有时候， 参考水平是指同一个人的非食管癌组织中的miRNA水平。有时候，是指没有食管癌的人的水平。有时候是指一群没有食管癌的人的水平的平均水平。有时候，参考水平来自于样品库，包括被测样品本身。参考水平可以事先决定也可以在测量样品的同时决定。在此使用的“参考”的值可以是绝对值，相对值，有上限或下限的值，一序列值，平均值，中值，中间值，或者与特定对照或基准值比较的值。与参考值的比较可以是图1 中 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，或 38 的任意miRNA或者他们的同源物。比较一个miRNA水平与参考水平的过程可以根据检测组织中miRNA值的类型使用方便的方法进行。例如，当通过miRNA的杂交信号来检测miRNA水平时，水平的比较可能通过肉眼定性地比较杂交信号的强弱。对于定量检测，比较可能通过观察数据，洞察数据所代表的涵义进行(如，将观察数据用图形表示，诸如柱状图、线形图之类)。比较的过程可以是手工(如通过专业的方法进行视觉观察)也可以是自动的。有时候，对比是通过比较测量的和参考的水平的数量级进行的(例如，比较“比值”或百分比的不同)。在此，“比值”指的是数字描述的miRNA测量值与参考值之间的数量级不同。在miRNA水平中一个“特征性的改变”可能是相对参考水平来说患者中miRNA水平显著的减少或增加。“显著的增加”在此指的是miRNA水平至少增加5%，包括例如至少 6%，7%，8%，9%，10%，15%，20%，30%，40%，50%或更多。类似的，“显著的减少”指的是 miRNA 水平至少减少 5%，包括例如至少 6%，7%，8%，9%，10%，15%，20%，30%，40%， 50%或更多。图1展示的是表示的miRNA改变的总结。miRNA水平特征性的改变是用来诊断食管癌的基础。例如，有时候，当SEQ ID Nos. 1-14中至少一个miRNA的水平确定了，测量的 miRNA水平至少一个显著的增加就暗示有患食管癌的可能。有时候，当SEQ ID Nos. 15-38中至少一个miRNA的水平确定了，测量的miRNA水平至少一个显著的减少就暗示有患食管癌的可能。有时候，当SEQ ID Nos. 1-14中至少一个miRNA的水平确定了和SEQ ID Nos. 15-38 中至少一个miRNA的水平确定了，SEQ ID Nos. 1_14中至少有一个显著的增加和SEQ ID Nos. 15-38中至少有一个显著的减少就暗示有患食管癌的可能。有时候图1中所有的miRNA水平都决定了，SEQ ID Nos. 1-14中至少有一个显著的增加和SEQ ID Nos. 15-38中至少有一个显著的减少就暗示有患食管癌的可能。有时候， SEQ ID Nos. 1-14中至少有两个显著的增加和SEQ ID Nos. 15-38中至少有两个显著的减少就暗示有患食管癌的可能。在那些情况下，当使用多于一个miRNA而这些miRNA的水平并不一致暗示患有食管癌时，“大多数”的指示可以被认为是检测结果。例如，当使用5个miRNA时，其中3个暗示有食管癌，结果可以认为暗示此人诊断为食管癌。然而，在某些情况下，食管癌的诊断需要至少一个或更多特异的miRNA特征性的变化。例如，假设一个miRNA是has-miR-16， has-miR-16水平显著的增加可能是食管癌诊断的先决条件。基于miRNA基因水平的诊断方法有些情况下，基于图1中至少一种miRNA或他们的同源物的基因在患者样品中的水平可以提供多种食管癌诊断方法。有时候，基因水平的评估是通过分析至少一个miRNA基因在样品中的删除或扩增，相对于对照样品在miRNA基因中探测到删除或扩增则暗示此患者有患食管癌的可能。miRNA基因的删除或扩增可以通过检测被怀疑患有食管癌的患者的食管癌组织细胞中基因的结构或序列，然后与对照样品的基因结构或序列对比。任何适用于检测基因结构或序列改变的技术都可以被用来实践此方法。例如，miRNA基因删除或扩增可以通过基因组DNA的Southern Blot和miRNA序列特异性核酸探针杂交来实现。也可以利用序列分析和单链构象多态性。miRNA基因的删除或扩增也可以通过PCR扩增这些基因片段来检测，通过测序或电泳来分析从患者DNA样品中扩增出来的片段序列或者长度是否与对照相同。miRNA基因的删除也可以通过其附近的染色体标记的删除来鉴定。一个患者的细胞中的mi RNA基因水平也可以通过测量样品中至少一个mi RNA基因的拷贝数来评估，其中基因只有一个拷贝数意味着此患者有患食管癌的可能，而不是体细胞染色体上和女性染色体上的两个拷贝，也不是男性染色体上的一个拷贝。任何适用于检测基因拷贝数的技术都可以应用于此方法，包括Southern Blot和 PCR扩增技术。还有一个确定食管癌组织样品中miRNA拷贝数的方法是根据很多miRNA或基因簇都与染色体标记或其他基因紧密相连。患者中一个与标记或其他杂合基因相连的 miRNA基因的丢失可以从杂合性或标记基因的信息上得知。因此确定杂合性标记的技术也可用于此方法。“对照样品”可以是来自没有食管癌患者的组织样品。或者是来自一群患者的组织样品集合。图1 中的miRNA 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，或 38任意一个或其同
源物的基因水平都可以确定。当使用多于一个miRNA的基因水平但是并不一致表明有食管癌时，“大多数”的指示可以被认为是检测结果。例如，当使用5个miRNA时，其中3个暗示有食管癌，结果可以认为暗示此人诊断为食管癌。然而，在某些情况下，食管癌的诊断需要至少一个或更多特异的miRNA特征性的变化。有多种技术可以用来确定miRNA基因水平，例如包括为阵列上的等位基因特异性延伸，PCR/LDR通用阵列，基于微滴的单碱基链延伸，序列标签分子倒置探针和组合的杂交测序。食管癌病人的分类方法另一方面，这为食管病人提供了一个分类方法，例如，分化水平、肿瘤阶段和病理的分类。具体来说就是提供了一个食管病人(包括诸如确定分化的水平，确定肿瘤阶段，和食管病人的病理分类)分类方法，包括检测至少一种miRNA(例如表2中的miRNA或者他们的同源物)的水平或食管癌病人组织中的miRNA基因水平，在此miRNA的水平(或者相应的miRNA基因水平)用来作为食管病人分类的基础。这为确定食管癌患者中的分化水平提供了一种方法，包括图加中的至少一种 miRNA(或相应的基因)在患者的食管癌组织中的水平，在此miRNA(或相应的基因)水平被用来作为确定食管癌分化水平的基础。例如，通过测定的miRNA水平可以确定患者的高、 中、低分化水平。miRNA(或相应的基因)水平与分化水平之间的关系也可以确定，例如，可以通过分析用已知的方法被分为不同分化水平的食管癌群体样品的miRNA(或相应基因) 的水平来实现。miRNA 可以是 hsa-miR-25，hsa_130b 和 hsa_miR-130a 的任意一个或他们的同源物，食管癌样品中的miRNA水平与分化水平是相反的，也就是说低水平的miRNA与高分化水平相关联，而高水平的miRNA与低分化水平相关联。有时候至少一个miRNA是hsa-miR-335。 有时候至少一个miRNA是hsa-miR-25。有时候至少一个miRNA是hsa_miR-130b。有时候至少一个 miRNA 是 hsa-miR-130a。有时候至少一个 miRNA 是 hsa_miR-181d。这为食管上皮细胞癌患者病理分类提供了一种方法，包括图2b中的至少一种 miRNA (或相应的基因)在患者的食管癌组织中的水平，在此miRNA (或相应的基因)水平被用来作为患者病理的分类基础。例如，某个患者有可能被确定为霉菌状生长或髓质状食管上皮细胞癌，这取决于检测到的miRNA水平。miRNA(或相应基因)的水平与癌症不同的病理状态之间的关系可以建立起来，例如，可以通过分析用已知的方法被分为不同病理类别的样品的miRNA(或相应基因)的水平来实现。这为确定食管癌患者内的肿瘤阶段提供了一种方法，包括图2c中的至少一种 miRNA(或相应的基因)在患者的食管癌组织中的水平，在此miRNA(或相应的基因)水平被用来作为确定肿瘤阶段的基础。例如，某个患者有可能被确定为有I，II，或III阶段的肿瘤，这取决于检测到的miRNA水平。有时候某患者被确定有T1，T2，或T3阶段的肿瘤，这也取决于检测到的miRNA水平。有时候某患者被确定有NO或m阶段的肿瘤，这也取决于检测到的miRNA水平。miRNA(或相应基因)的水平与肿瘤不同阶段之间的关系可以建立起来， 例如，可以通过分析用已知的方法被分为不同肿瘤阶段的样品的miRNA(或相应基因)的水平来实现。这里还提供了一些系统(例如微阵列)，这些系统包含了可以检测表2(包括图 2a, 2b, 2c中的任意miRNA或其同源物)中的miRNA的探针以及决定表2中miRNA的基因或其同源物的水平的系统。这些系统在决定表2中miRNA (或其相应的基因)水平和对食管癌患者进行分类很有用。因此，这提供了一个确定表2中的至少一种miRNA或其同源物(或相应的基因)水平的系统(例如微阵列)，在此系统中包含了多数探针，每个探针可以检测到一种 miRNA (或其基因)，至少 15% (包括 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%， 或95%)的探针可以检测到表2中的miRNA或其同源物(或相应的基因)。这为食管癌病人分类提供了一个系统(如微阵列)，在此系统中包含了多数探针，每个探针可以检测到一种 miRNA (或其基因)，至少 15% (包括 20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，或 95% )的探针可以检测到表2中的miRNA或其同源物(或相应的基因)。这为患有食管癌的患者分类提供了一个系统(如微阵列)，在此系统中包含了至少2，5，10，20，30，或40个探针，每个探针可以检测到表2中的一种miRNA或其同源物(或其相应的基因)。另外这里提供的系统还可以用来对食管癌病人进行分类。例如，这里提供了一个有用的系统可以对患食管癌的患者进行分类，在此系统中包含一个或多个探针，每个探针可以检测到一种表2中miRNA或其同源物(或其相应的基因)。这里提供了一个有用的系统可以用来确定食管癌分化的水平，此系统包含了一个或多个探针，每个探针可以检测到一种表或其同源物(或其相应的基因)。这里提供了一个有用的系统可以用来对食管上皮细胞癌患者进行病理分类，此系统包含了一个或多个探针，每个探针可以检测到一种表2b中miRNA或其同源物(或其相应的基因)。这里提供了一个有用的系统可以用来确定食管癌患者的肿瘤阶段，此系统包含了一个或多个探针，每个探针可以检测到一种表2c中miRNA或其同源物(或其相应的基因)。还为制造提供所描述的用来检测miRNA (或其相应基因)的系统的探针。这里为制造提供了食管癌患者分类系统的一个或多个探针，每个探针可以确定表2中的一个miRNA 或其同源物(或其相应的基因)水平。这里为制造业提供了一个用来对食管癌患者进行分类系统(如微阵列)的探针，每个探针可以检测不同的miRNA(或其相应基因)的水平，至少 15% (包括 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或 95% )的探针可以检测表 2中的一种miRNA或其同源物(或其相应的基因)。这为确定食管癌分化水平的系统制造业提供了一种或更多探针，每种探针可以确定图加中的一个miRNA或其同源物(或其相应的基因)水平。这为确定食管上皮细胞癌患者病理分类的系统制造业提供了一种或更多探针，每种探针可以确定图2b中的一个miRNA 或其同源物(或其相应的基因)水平。这为确定食管癌病人肿瘤阶段的系统制造业提供了一种或更多探针，每种探针可以确定图2c中的一个miRNA或其同源物(或其相应的基因) 水平。预后的方法与组成及促进食管癌患者的生存另一方面此发明为食管癌病人预测提供了方法，例如包括确定食管癌病人生存率的方法。此发明的预测方法在确定食管癌病人的治疗过程方面很有用。例如，确定生存的可能性可以帮助决定使用保守疗法还是激进疗法，或各种药征是否可以结合使用。另外，这种预后可以帮助决定改进生存的药剂(如这里提到的药剂)是否是必要或是否有效。这里为食管癌患者预后生存概率提供了方法，包括(a)确定患者的食管癌组织样品中至少一种miRNA的水平和(b)将上述样品的miRNA水平与阈值进行比较，其中与阈值比较的miRNA水平与患者生存相关联或反相关联。此处的“相关联”指的是与阈值相比低水平的miRNA暗示低生存率，反之亦然。此处的“反相关联”指的是与阈值相比高水平的 miRNA暗示高生存率，反之亦然。有时候，至少一种miRNA是调节目的基因的miRNA，目的基因是从一组基因里选出来的，包括PPP6C，SATB2, CHSTl 1, CRELD1, ESRRA, MTMR4, RNF125 ；SYNJl, TAF5, YWHAH, ZYX, CHSTl 1，KIAA1033, TGFBR3, SNRK, RNF125, AXIN2, CAPZA2, SYNJl, DLLl，YWHAH, MTMR4, PPP6C, CAMKV,禾P TAF5, PPPlCB, P0U4F2, MYHl，MYH2, T0P2B, STX17, GBAS, MYH4, CPSF4, EIF4EBP3, LHX4, CLK3, CAPN6, KIAA1622, AUH, PPIF, KCNK3, IL6R, CSNK2A2, ZNF579, NRGN, CUL3, CIB2, ZBTB26, GPBPl，TMEM16D, HOXAl，CAMTA1，MCM3AP，MPPED2, H00K2, PLAU, MCFD2, BLCAP, DHX15, FBNl，NC0A6, SNRPC, CCK, SFRS15, TMODl，GPRC5B, ZNF403, DCUN1D5, ZNF423, 和GPR64。有时候，至少一种miRNA可以调节选自于以下一组基因的目的基因PPP6C， SATB2, CHSTl 1，CRELDl，ESRRA, MTMR4, RNF125 ；SYNJl，TAF5, YWHAH，禾口 ZYX.。有时候，至少一种miRNA可以调节选自于以下一组基因的目的基因CHST11，KIAA1033, TGFBR3, SNRK, RNF125, AXIN2, CAPZA2, SYNJl, DLLl, YWHAH, MTMR4, PPP6C, CAMKV，禾口 TAF5。有时候，至少一种miRNA可以调节选自于以下一组基因的目的基因PPP1CB，P0U4F2，MYH1，MYH2，T0P2B, STX17, GBAS, MYH4, CPSF4, EIF4EBP3, LHX4, CLK3, CAPN6, KIAA1622, AUH, PPIF, KCNK3, IL6R, CSNK2A2, ZNF579, NRGN, CUL3, CIB2, ZBTB26, GPBPl，TMEMl6D，HOXA1，CAMTA1，MCM3AP， MPPED2，H00K2，PLAU，MCFD2，BLCAP，DHX15，FBNl，NC0A6，SNRPC，CCK，SFRS15，TMOD1，GPRC5B， ZNF403, DCUN1D5, ZNF423，和GPR64.有时候，miRNA相应的基因位于5、10、9号染色体中的任意一条上。有时候，miRNA是图3中的任意一个或者是他们的同源物。有时候，至少一个 miRNA 是 hsa-miR-103。有时候，至少一个 miRNA 是 has-miR-107.有时候，至少一个 miRNA 是 has-miR-23b.这里为食管癌患者预后生存概率提供了方法，包括(a)确定患者的食管癌组织样品中至少一种miRNA的水平和(b)将上述样品的miRNA水平与阈值进行比较， 其中与阈值比较的miRNA水平与上述患者生存反相关联，这其中至少一个miRNA是 hsa-miR-103，hsa-miR-107，或hsa-miR-2;3b或他们相应的同源物。有时候，至少一个miRNA 是hsa-miR-103。有时候，至少一个miRNA是has-miR-107。有时候，至少一个miRNA是 has-miR-23b.这里叙述的miRNA水平也有可能反映了 miRNA基因水平的变化(如这里描述的 miRNA)。有时候，这为患有食管癌的患者提供了一个预后的方法，包括分析至少一种miRNA 基因的水平(如与hsa-miR-103，hsa-miR-107，和hsa_miR-2;3b相应的或其同源物的miRNA 基因)，其中与对照样品比较基因水平的改变暗示着高或低生存率。例如，有时候，这为患有食管癌的患者提供了一个预后的方法，包括分析至少一种与hsa-miR-103，hsa-miR-107，和 hsa-miR-23b相应的扩增的miRNA基因，其中相对对照miRNA基因而言，扩增的miRNA基因与低生存率相关联。有时候，这为患有食管癌的患者提供了一个预后的方法，包括确定至少一种与hsa-miR-103，hsa-miR-107，和hsa_miR-23b相应的miRNA基因的拷贝数，其中拷贝数多于2的暗示低生存率。另外还提供了一种方法，即利用能够检测miRNA(或其相应的基因)水平的探针或含有一种或多种探针的系统来预后。例如，有时候，利用一种或多种探针(或含有一种或多种探针的系统)来确定食管癌患者的生存几率，其中的探针能够检测样品中的miRNA，与阈值相比其miRNA水平与上述患者的生存几率相关联或反相关联。有时候，这提供了一种或多种用来为食管癌患者预后的探针，与阈值相比miRNA水平与上述患者的生存几率呈反相关联,其中至少一种miRNA是hsa-miR-103，hsa-miR-107，或hsa_miR-2;3b或他们相应的同源物。这里为试剂(或系统)的制造提供了一种或多种探针，此试剂(或系统)可以用来为患有食管癌的患者预后，这些探针可以检测样品中的miRNA水平，与阈值相比其miRNA 水平与上述患者的生存几率相关联或反相关联。有时候，这里提供了一种或多种探针，可以用来为患有食管癌的患者预后，与阈值相比其miRNA水平与上述患者的生存几率反相关联，其中至少一种miRNA是hsa-miR-103，hsa-miR-107,或hsa_miR-2;3b或他们相应的同源物。此发明也为患有食管癌的人改善生存状态提供了方法。具体的说，包括给患者服用有效剂量的药物来减低miRNA水平，与阈值相比，此miRNA的水平与上述患者的生存几率呈反相关。这里为药剂制造商提供了一种药剂，使用此药剂可以降低miRNA水平从而改善患有食管癌的患者的生存状况，与阈值相比，此miRNA水平与上述患者的生存几率呈反相关联。这为患有食管癌的患者改善生活状况提供了一个方法，包括给患者服用有效剂量的药物来减低miRNA水平，此miRNA选自于包括hsa-miR-103，hsa-miR-107,或 hsa-miR-23b或他们相应的同源物的一组miRNA。这里为药剂制造商提供了一种改善患有食管癌的患者的生存状况的药剂，此药剂可以降低上述miRNA的水平。在此叙述的方法可能首先考虑为患者预后(例如用此处提到的方法)，再考虑药剂的给予。有时候，多于一个miRNA的水平有下降。这可以通过利用例如减低两种或多种 miRNA水平的药剂来实现。也可以使用两种或多种药剂来减低两种或多种miRNA的水平。 例如，有时候，这为患有食管癌的患者改善生活状况提供了一个方法，包括给患者服用有效剂量的一种或多种药物来减低至少两种miRNA水平，这些miRNA选自于包括hsa-miR-103， hsa-miR-107，或hsa-miR-2;3b或他们相应的同源物的一组miRNA。有时候，这里为药剂制造商提供了一种或多种改善患有食管癌的患者的生存状况的药剂，此药剂可以降低至少两种 miRNA 的水平，这些 miRNA 选自于包括 hsa-miR-103，hsa-miR-107，或 hsa_miR-23b 或他们相应的同源物的一组miRNA。有时候，这为患有食管癌的患者改善生活状况提供了一个方法，包括给患者服用有效剂量的一种或多种药物来减低hsa-miR-103，hsa-miR-107,或 hSa-miR-2;3b的水平。有时候，这里为药剂制造商提供了一种或多种改善患有食管癌的患者的生存状况的药剂，此药剂可以降低hsa-miR-103，hsa-miR-107，或hsa-miR-23b的水平。这里提供了一种降低miRNA水平的药物组分和一种药剂学上可以接受的载体，其中至少一种 miRNA 为 hsa-miR-103，hsa-miR-107，或 hsa-miR-23b。有时候，至少一种 miRNA 为hsa-miR-103。有时候，至少一种miRNA为hsa-miR-107。有时候，至少一种miRNA为 hsa-miR-23b。有时候，此药剂是双链RNA(例如短的或小干扰RNA或“siRNA”)，反义核酸链，或具有酶活性的RNA分子如核酶。改善生活状况的方法将在下文详述。这里所说的生存状况可以是无疾病的生存状况或者是全面的生存状况。在此，“无病生存状况”是指不出现肿瘤复发和/或扩散以及诊断后个体的命运，例如，某个人从此以后肿瘤不复发。“总生存状况”是指患者诊断后的命运，无论肿瘤复发与否。生存预后一些为生存者预后的方法及在此描述的方法是基于相对阈值的miRNA水平的基础上的。阈值可以通过多种方法来决定，假设阈值可以提供一条界线，应该存在一组miRNA 水平高于阈值的病人生存率与另一组miRNA水平低于阈值的病人生存率不同。阈值可以通过非癌的食管癌组织样品中的miRNA水平来确定。也可以通过分析患有食管癌的人群的miRNA水平来决定。这可以通过柱状图分析来完善，图中将一群被检测的人的数据展示出来，其中一条轴表示miRNA水平，另一条表示个体的存活率。两个或多个独立的群体可以通过相同或不同miRNA水平分为不同亚群来确定。例如，在某些情况下，阈值可以基于一群高存活率的人和一群低存活率的人的miRNA的平均水平的基础之上。阈值也可以代表两种或多种miRNA。这可以通过每种miRNA水平的比率来体现。阈值可以是一个单个数字，可以运用于每一个食管癌患者，或根据具体的亚群不同而不同。例如，上了年纪的男人可能与年轻男人的阈值不同，女人可能与男人的阈值不同。更进一步，一个阈值可以是为一个人确定的。例如，阈值可能是一个确定的比率，即同一个人中食管癌组织相对非癌组织的miRNA水平的比率。阈值能将低于阈值和高于阈值的食管癌病人生存概率区分开，这可以通过单变量或多变量分析来实现。这些方法确定一个或多个变量与给定的结果之间的可能关系。在特殊情况下，这些方法可以确定一个miRNA水平与癌症患者无疾病或全面的生存状况之间的可能联系。任何在这个领域内为人们所熟知的可以用来进行此类分析的方法都可以利用。单变量分析的例子如 Kaplan-Meir 法或 the Cox proportional-hazards regression model ο例如通过柱状图来确定基于人群的阈值，可以用一群足够数量的病人来确定两组或多组独立的具有不同水平miRNA的病人。典型的，这样一群人包括至少25个病人，包括至少50，75，100，125，150，或200个。类似地，确认阈值可以包括至少25个病人，包括至少 50,75,100，125，150，或 200 个。更进一步，一个阈值可以分离两组病人，可能存在多个阈值可以分离大量病人。例如，两个阈值可以首先分离一组高水平miRNA的病人，然后分离一组中等水平的病人，剩下一组低水平的病人。一定数量的不同阈值可以描述一条曲线，例如一条连续的线，可以描述病人无疾病的或全面的生存状况的可能性。这种曲线构成一个“连续”的miRNA水平，病人无疾病生存或全面生存状况的可能性与其体内miRNA水平成比例。两种或多种miRNA水平可以由此曲线来展现。在某些情况下，在此项为癌症病人预后的发明中miRNA之间可能相互组合。两种或多种miRNA的组合为预后决定起了更重要的作用。miRNA水平也可以用来与其他变量相结合，此变量可能是在统计学上具有重要意义，暗示食管癌病人的无疾病或全面的生存状况的可能性，例如病理暗示(例如年龄，肿瘤大小，肿瘤组织学，临床阶段，家族史等等)。例如，癌症的临床阶段在统计学上具有暗示无疾病或全面生存的重要意义，在此阈值可能根据在不同的临床阶段而不同。因此，miRNA的阈值可能根据另一个指示参数的不同而不同。在一个模范方法中，Kaplan-Meier分析用来确定生存率与miRNA水平之间的关系。在某些情况下，此方法包括(a)检测个体中食管癌组织中至少一种miRNA的水平，(b)将个体分成第一组和第二组，其中第一组具有低水平的miRNA和更大的生存可能，第二组具有高水平的miRNA和较小的生存可能，在此至少一种miRNA为hsa-miR-103， hsa-miR-107, hsa-miR-23b.确定一种或多种miRNA的水平并与阈值进行比较后，就可以将病人分到相应的无疾病或全面生存可能性的组。然后此病人无疾病或全面生存的可能性就有哪一组人无疾病或全面生存的可能性来确定。例如，一个样品可以被认为具有低水平的miRNA。这个病人则被分到低水平miRNA 的病人组。因为已经确定高水平miRNA的病人具有更高的无疾病或全面的生存状况的可能性，所以特定的病人可能会被认为具有更高的无疾病或全面的生存状况的可能性。在此描述的方法可以进一步为个人确定合适的治疗过程。此领域内其中一个常用的方法就是为癌症病人预后，癌症早期和癌症晚期患者不一样。例如，为I阶段的癌症患者预后可能倾向于癌症继续生长或转移，而对IV阶段的癌症患者则可能倾向于有效的癌症治疗方法。合适的治疗方式的确定会考虑这些变数。改善生存状态的方法与措施这里还提供改善癌症患者生存状况的方法，这通过使用减少特定miRNA水平的药剂来实现，例如图3所示的miRNA。任何可以减少miRNA水平的药剂都可以用于此发明的方法。合适的抑制miRNA基因表达的药剂包括双链RNA (例如短的或小干扰RNA或称“siRNA”)，反义核酸，具有酶活性的RNA分子如核酶，小分子复合物和蛋白质。这些药物可以单独使用也可以结合使用(例如这里提到的其他药物)。这些药物可以直接(如抑制miRNA的表达或功能)或间接(如通过影响miRNA基因的水平)地降低miRNA的水平。例如，一个给定的miRNA的表达可以通过双链RNA(dsRNA)诱导的RNA干扰抑制， 此双链RNA分子与miRNA基因产物有至少70 %，包括至少75 %，80 %，85 %，90 %，95 %， 98 %，99 %，或100 %的序列同源性。在某些情况下，双链RNA就是“短的或小干扰RNA”或称 “siRNA”。在当前的方法中使用的siRNA由10_30bp的双链RNA组成，包括例如12_28， 14-26，16-24，或18-22任意一种。siRNA包含一条有义RNA链和一条反向互补的RNA链，二者通过Watson-Crick碱基配对原则结合在一起。有义链包含一段与目标miRNA中的核酸序列互补的序列。siRNA的有义和反义链可以包含两条互补的、单链RNA分子，或只包含一个单一的分子，它的互补部分有一条链通过碱基配对合共价连接形成“发卡”结构而形成。通过单个或多个碱基的插入、缺失、替换、变异等，siRNA与天然的RNA不同。这种变异包括非核苷物质的插入，例如在siRNA的末端或者是一、两个核苷内，或是的siRNA抵制核酶消化的修饰。在某些情况下，siRNA的一条或两条链也包含3 ‘突出末端。siRNA可以通过化学合成或生物合成得到，或者通过重组质粒或病毒载体表达得到，这将在下文详述。给定miRNA的表达可以被反义核酸抑制。此处的“反义核酸”指的是通过RNA-RNA 或RNA-DNA相互作用，与目标RNA结合的核酸分子，这样就改变了目标RNA的活性。适用于目前的方法的反义核酸是与miRNA毗邻的序列互补的单链核酸(例如，RNA, DNA, RNA-DNA嵌合体，PNA，和LNA)。在某些情况下，反义核酸是至少有70%，75%，80%，85%，90%，95%， 或100%与miRNA的毗邻序列互补的核酸序列。在某些情况下，反义核酸有10-30个核苷， 包括例如12-28，14-26，16-24，或18-22个核苷。反义核酸也可以在核酸骨架或糖或碱基上有特定的修饰来增强靶标特异性、核酶抵抗力、运输或其他与效率相关的特征。这些修饰包括胆固醇、相互作用如吖啶或包含一个或多个核酶抵制组。反义核酸可以通过化学方法或生物方法产生，或者也可以从重组质粒或病毒表达得到。这将在下文详述。给定miRNA的基因表达也可以被具有酶活性的核酸抑制。这里的“具有酶活性的核酸”指的是包含底物结合区域的核酸，此区域与miRNA毗邻的核酸序列互补，特异性地裂解miRNA。在某些情况下，酶活性的核酸的结合区域与miRNA毗邻区域50-100%互补，包括如75-100%或95-100%互补。酶活性的核酸也可以在碱基、糖基、或磷酸基包含有修饰。一个典型的用于当前方法的具有酶活性的核酸就是核酶。具有酶活性的核酸可以通过化学方法或生物方法产生，或者也可以从重组质粒或病毒表达得到。这将在下文详述。将核酸分子导入细胞，包括癌细胞，的方法在此领域内有很多。这些方法包括显微注射，电穿孔，脂质体介导，磷酸钙介导的转化，DEAE-葡聚糖介导的转化，微粒轰击，胶质散射系统传递(例如大分子复合物，珠子，水中的油乳液，胶束，混合胶束和脂质体)，以及与抗体结合，gramacidinS，人造病毒颗粒或其他载体如TAT。利用合适的载体也可以在活体内或活体外将核酸药物导入到哺乳动物细胞中。合适的载体包括病毒载体和非病毒载体如质粒载体。这种载体对提供治疗剂量的药剂如反义 RNA或siRNA很有用处。基于病毒的系统具有一个优势能够将相对高水平的异质核酸导入到不同的细胞中。介导核酸的合适的病毒载体包括，例如疱疹单纯病毒载体，牛痘病毒载体，细胞巨化病毒载体，鼠白血病病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，逆转录病毒载体和慢病毒载体。 病毒载体的定向运动也可以通过对载体用其他病毒的包膜蛋白或表面抗原来修饰。例如， AAV载体可以被狂犬病泡状病毒(VSV)、埃博拉病毒、Mokola等的表面蛋白修饰。此发明中的核酸或载体可以含有任意的可诱导的启动子或增强子，从而可以通过添加刺激或分子控制反义RNA或siRNA的表达。这种可诱导系统包括例如四环素诱导系统，重金属诱导的金属硫蛋白，蜕皮激素诱导的昆虫类固醇激素或相关类固醇如幕黎甾酮， 类固醇如糖皮质激素和雌激素诱导的鼠乳腺瘤病毒(MMTV)以及温度改变诱导的热激启动子。一种药剂能够降低miRNA水平的剂量即为有效剂量。在某些情况下，药剂可以降低miRNA水平与阈值之间差异的10%，20%，30%，40%，或50%。药物(如核酸药物)典型的剂量包括 0. l-3000mg/kg 体重，10-2000mg/kg 体重，50-1000mg/kg 体重，100-500mg/kg 体重，但并不局限于这个范围。在某些情况下，药物(如任意的核酸药物)的剂量大约为 10-500mg/g 肿瘤，例如 20-300mg/g 肿瘤，50_200mg/g 肿瘤，和 100_150mg/g 肿瘤.此领域内有一种常用的技术可以很容易地确定一个人治疗使用的合适剂量。药剂的经典频率包括至少每三周一次，每两周一次，每周一次，每周两次，每周三次，每周四次， 每周五次，每周六次或每天一次，但并不局限于这些。在某些情况下，每次用药的时间间隔少于一个星期，包括6，5，4，3，2，1天。在某些情况下，每次用药时间间隔是不变的。例如， 可以是每天，每两天，每三天，每四天，每五天，或每周。在某些情况下，可以是每天两次，每天三次或更多。用药时间可以很长，如从一个月到三年。例如，剂量给药可以延长到2，3，4，5，6，7， 8,9,10，11，12，18，24，30，和36个月。在某些情况下，给药安排不能停。在某些情况下，用药的间隔不能长于一星期。再次描述的合成物可以通过常规途径给药，包括但不局限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。这里还提供药物复合物，包含一种减低miRNA水平的成分和制药学上可以接受的载体。在某些情况下，以上miRNA选自于hsa-miR-103，hsa-miR-107, hsa_miR-23b或他们的同源物。在某些情况下，至少一种是hsa-miR-103。在某些情况下，至少一种是 hsa-miR-107 ο在某些情况下，至少一种是hsa_miR-23b。在某些情况下，此成分是siRNA。 在某些情况下，此成分是反义RNA。在某些情况下，此成分是核酶。在某些情况下，药物成分是无菌的。在某些情况下，药物成分是无热源的。合适的制药学上可以接受的载体有水，水缓冲液，常规的盐，0.4%的盐，0.3%的盐和透明质酸。药物成分还可能包括传统的药物学赋形剂，和/或添加剂。合适的药物学赋形剂包括稳定剂，抗氧化剂，渗透度调节剂，缓冲液，PH调节剂。合适的添加剂包括生理学生物合适的缓冲液，附加螯合掩蔽剂(如DTPA或DTPA双酰胺)或钙螯合复合物(如DTPA， CaNaDTPA双酰胺)或钙或钠盐(氯化钙，抗坏血酸钙，葡萄糖酸钙或乳酸钙)。此发明的药物成分可以用液体形式包装或冻干。此发明的固体药物成分，可以用传统的制药学上可接受的无毒载体，例如，制药等级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等等。miRNA水平检测系统和/或miRNA基因水平检测系统此发明为检测食管癌病人中有特征性改变的miRNA水平提供了多种系统，还提供了确定miRNA基因状况的系统。如上所述，这些系统可以用于多种目的，包括食管癌诊断， 食管癌病人分类，和为食管癌病人预后。此处描述的系统包括检测miRNA和/或miRNA基因状态的探针。以下的讨论集中在能够检测miRNA的系统，具有此领域内的常规技术的人很容易理解此处描述的特定方面也适用于包含可以检测基因缺失，扩增或miRNA基因拷贝数改变的探针的系统。例如，在某些情况下，这里提供了一个包含多数探针的系统，每一个探针可以检测样品内不同的 miRNA，其中至少 15% (包括 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%， 或95%)的探针可以检测图1，表2或图3中的miRNA或其同源物。在某些情况下，此系统包含至少2，5，10，20，30，40，或50种探针，其中每种探针可以检测图1，表2或图3中的一种miRNA或其相应同源物。在某些情况下，这里提供了一个包括多数探针的系统，其中每个探针可以检测样品中的一个 miRNA，其中至少 15% (包括 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或 95%)的探针可以检测图1中的miRNA或其同源物。在某些情况下，此系统包含至少2，5， 10，20，30，40，或50种探针，其中每种探针可以检测图1中的一种miRNA或其相应同源物。应用中，提供有多种探针组成的体系，其中每个探针能检测样品中一个不同的 miRNA,至少 15 % (包括至少 0 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，或 95 % )的探针能检测表2 (包括图2a，2b，和2c中的任何miRNA)中的一个miRNA。应用中，该体系至少有2，5，10，20，30，或40个探针组成，其中每个探针能检测表2中的miRNA或他们的同源物 (包括图2a，2b，和2c中的任何miRNA)。实际应用中，提供有多种探针组成的体系，其中每个探针能检测样品中一个不同的 miRNA，至少 15% (包括至少 0%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或 95% )的探针能检测图3中的一个miRNA或他们的同源物。实际应用中，该体系至少有1，2，3，6，9， 12，15，18，or 21个探针组成，其中每个探针能检测图3中的miRNA。这里描述的体系中用两个以上的探针检测相同miRNA。例如，在实际应用中，当体系是芯片，探针以多种拷贝(如2，3，4，5，6，7或更多)存在。应用中，体系中不同探针检测相同siRNA。例如，这些探针结合到miRNA的不同区域(重叠或非重叠)。在一些例子中，探针是寡聚核苷酸。为了检测miRNA，一定的序列变异是可以接受的。这样，寡聚核苷酸的序列(或者他的互补序列)与miRNA可以存稍微的不同。专业技术人员知道，这种序列变异并不能显著影响寡核苷酸确定miRNA水平的能力。例如，寡核苷酸的同源物和变异体用标准方法进行比对，确定相对高的序列相似性。发明中的寡核苷酸与miRNA序列至少有40% (包括50%，60%，70%，80%，90%，95%或更多)的相似性。应用中，部分寡核苷酸用于检测miRNA和其他蛋白，其他部分用于寡核苷酸与基质结合。应用中，其他部分由非特异序列(如PolyT)组成，增加互补序列部分与基质表面的距离。系统中的寡聚核苷酸包括DNA，RNA, PNA, LNA,以上的结合体或者修饰形式。他们也包括采用修饰的寡聚核苷酸作为主体。在一些例子中，寡聚核苷酸至少由9，10，12，13， 14，15，16，17，18，19，20或更多的与miRNA互补或相同的寡聚核苷酸组成。单个的寡聚核苷酸由两个以上的互补序列组成。在一些例子中，活性组分(如氨基)与寡聚核苷酸的5’或 3’端结合，使之能与基质结合。在一些例子中，体系是布有探针的微阵列芯片。微阵列芯片和芯片，可以交换使用，其表面是个阵列，一个规则阵列，分布着性质不确定的生化样品的假定结合(杂交)位点。在一些实际应用中，芯片是固定在基质特定位置上的不同寡聚核苷酸的集合。例如，应用中，提供由多种探针组成的芯片，其中每个探针能检测样品中一个不同的 miRNA，至少 15% (包括至少 0%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或 95% )的探针能检测图1，表2，或图3中的一个miRNA以及他们的同源物。应用中，提供由多种探针组成的芯片，其中每个探针能检测样品中一个不同的miRNA，至少15% (包括至少0%， 30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或95% )的探针能检测图1中的一个miRNA以及他们的同源物。应用中，提供由多种探针组成的芯片，其中每个探针能检测样品中一个不同的 miRNA，至少 15% (包括至少 0%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，或 95% )的探针能检测图1，表2中的一个miRNA以及他们的同源物。应用中，提供由多种探针组成的芯片，其中每个探针能检测样品中一个不同的miRNA，至少15 % (包括至少0 %，30 %，40 %， 50%，60%，70%，80%，90%，或95% )的探针能检测图3中的一个miRNA以及他们的同源物。提供了确定miRNAs基因状态的微阵列芯片。微阵列芯片是确定基因状态的经典方法。例如，标签序列分子组成的系统用于确定基因状态。芯片可以在多种材料的基质上加工，如纸，玻璃，塑料(聚丙烯，尼龙，聚苯乙烯)， 聚丙烯酰胺，硝化纤维，硅，光纤或其他适合的固态或半固态支持物，形成平面构象(如玻璃板，硅片)或者三维构象(针型，纤维，珠子，颗粒，微孔板，毛细管)。在实际应用中，探针是寡聚核苷酸，组成芯片的寡聚核苷酸可以通过多种方法与基质结合，并不局限于，(1)采用光蚀刻技术的原位杂交(例如高密度寡聚核苷酸芯片)； (2)在玻璃，尼龙或硝酸膜上点或印中低密度芯片；C3)采用荫蔽；(4)在尼龙或者硝酸素杂交膜上点印记。寡聚核苷酸利用杂交，磁珠，或者微孔盘或毛细管等流体相，通过非共价键的固定在基质上。将核酸与固体基片(如玻璃板)结合的经典技术。一种方法是结合修饰的碱基或类似物，它们的一部分能结合到固体基片，例如氨基，氨基衍生物或其他带正电荷的基团。 扩增的产物与被醛基或其他反应基团包被固体基片接触，如玻璃板，扩增的产物与活性基团形成共价键，并以共价的形式与玻片结合。使用Biodot (BioDot，Inc. Irvine, CA)点样仪，将扩增产物点在醛基包被的玻板上，制作成芯片。按照发表的步骤，将扩增产物点在醛基玻片(Schena et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1995)93 :10614-10619).。芯片也可用机械手印在玻璃，尼龙(Ramsay, G.，Nature Biotechnol. (1998),16 :40-44)，聚丙烯 (Matson, et al.，Ahal Biochem. (1995), 224 (1) :110-6)，硅树脂片上(Marshall, A. and Hodgson, J.，Nature Biotechnol. (1998),16 :27-31)。其它芯片装备的方法包括电场中精细微穿刺(Marshall and Hodgson, supra)，和将多聚核苷酸直接点样在正电荷包杯的平板上。——些方法也是常用的，如 www. cmt. corning, com 禾口 http://cmRm. Stanford, edu/ EtamZ公开的，用氨基丙烷硅油进行化学表面处理的方法。通过制备高密度核苷芯片来制备芯片。众所周知，该技术采用多聚核苷酸的快速沉积(Blanchard et al. ,Biosensors & Bioelectronics，11 :687-690)。其他制备芯片的方法，如通过荫蔽(Maskos and Southern, Nucleic. Acids. Res. (1992)，20 :1679-1684)。原则上，上面所提到的任何芯片，可以点印迹在尼龙杂交膜上使用。但是，专业技术人员经常首选非常小的芯片，因为它们有较小的杂交体积。试剂盒该专利为这里描述的多种方法提供了试剂盒。例如，在应用中，提供了一个试剂盒，包括用于检测miRNA水平的一个体系(如微阵列芯片)。在应用中，试剂盒包括额外的进行检测的试剂，也提供说明书或者用户手册，详细介绍使用该发明的最优方法，这些说明指导也可以从因特网上得到。在应用中，试剂盒提供了一个用于诊断食道癌的体系(芯片)。该试剂盒进一步包括对照样品用于确定参考水平，和/或获得参考水平的信息。应用中，试剂盒包括说明书， 介绍如何使用它诊断食道癌。在应用中，试剂盒提供了一个用于分类食道癌病人的体系(芯片)。该试剂盒进一步包括对照样品用于分类个体，和/或对照样品的信息。应用中，试剂盒包括说明书，介绍如何使用它分类个体。应用中，提供试剂盒用于确定一个食道癌病人生存的预后。例如，这个试剂盒由检测miRNA(如图3所示)的探针组成。应用中，试剂盒进一步包括对照样品用于确定临界水平或有关临界水平的信息。应用中，试剂盒还包括说明书，指导使用试剂盒对病人生存预后。使用中，试剂盒还包括一些试剂用于降低miRNA水平或者药物合成物用于提高生存率。该试剂盒进一步包括一些实际，但不局限于这些，如基片，标签，引物，标记miRNA 的试剂，抽提miRNA的试剂，用于杂交和检测的阴性或阳性对照，试管和/或其他附件，收集组织样品的试剂，缓冲液，杂交盒，封口膜等，还包括软件包，如用于miRNA水平分析和/或 miRNA水平特征改变的统计方法，任意选择密码和账号，用于评估编辑的数据库。应用中，试剂盒中包括一个药物组合物，其成分能降低图3中所示miRNA水平，以及如何使用组合物提高食道癌患者的生存率。在使用中，试剂盒包括载体或其他媒介用于运输组合物。使用中，试剂盒还有说明书指导药物组合物的使用。下面的例子用于阐明该发明，但并不仅限于此。实施例1该例子说明分析miRNA水平的样品制备。病人和样品训练集中包括31对原发食道麟癌细胞和相应的邻近正常食道癌组织。这些样品从中国医学科学院肿瘤医院病人中采集，并获得知情同意。所有组织样品来自不曾治疗过的病人，通过手术获得，在液氮中迅速冷冻，_80°C储存(少于6年)直到miRNA抽提。第二个独立集中的新鲜组织的来自5对病例，作为独立的有效性数据集，是2006年从相同医院收集，储存时间少于6个月。被切除食道癌的外围部分用石蜡包被，切片，用常规H&E (苏木精&曙红)染色。病理学家评估肿瘤细胞浓度和确定肿瘤]组织学。追踪资料来自中国医学科学院肿瘤医院的追踪数据库。所有样品的临床病理学信息(年龄，性别，病理学，分化， 下匪分期，肿瘤阶段，手术后生存时间)都是可以得到的。该研究被中国医学科学院肿瘤医院的医学道德委员会批准。miRNA芯片的制备共有509个成熟的miRNA序列被装配和集成到我们的miRNA芯片设计，其中435 个人源(包括从发表文献中获得的122个预测的miRNA)，来自miRNA数据库的196个大鼠和261个小鼠的成熟的miRNA。此外，设计了 8个短寡核苷酸，它们与已知的RNA序列不同源，采用Ambion miRNA探针构建试剂盒(Cat. No. 1550，Austin, TX)，通过体外转录获得这 8个短寡核苷酸相应的合成miRNA.在分析之前，将不同数量的这些合成miRNA加入到人的 miRNA样品中，作为内标。所有设计的miRNA探针序列与它们同源的全长的成熟miRNA完全互补。为了将探针固定化到醛基修饰的玻片表面，这些探针序列连接起来长度有40nt (3’端的miRNA探针加上5’端19mer的polyT)，并有C6 5’ -氨基修饰。寡核苷酸探针在MWG Biotech合成， 溶解在 EasyArray 点样溶液中，浓度为 40 μ Μ。使用 SmartArray microarrayer (Capital Bio Corp.)每个探针重复点样3次。靶标RNA的标记用TRIZOL 试剂抽提总 RNA，低分子量 RNA 用 Ambion，s miRNA Isolation Kit 抽提。按照Thomson，protocol (Thomson et al.，2004)使用T4RNA连接酶标记技术。简单的说，4 μ g ^[氏分子量 RNA 被 500ng 的 5' -phosphate-cytidyl-uridyl-cy3-3' (Dharmacon, Lafayette, CO)在 T4RNA 连接酶(New England Biolabs,Bei jing, China)作用下标记。标记反应在4°C进行2小时。标记的RNA用0. 3M乙酸钠和2. 5倍体积乙醇沉淀，再用乙醇洗涤，干燥后再悬浮在15μ 1杂交缓冲液中，含有3XSSC，0. 2% SDS and 15%甲酰胺。玻片杂交在LifterSlipTM(Erie，Portsmouth, NH)中进行杂交，杂交盒法在 BioMixerTM(CapitalBio)，以便能不间断的混合杂交缓冲液，使整个玻片的杂交更均衡，防止边缘效应，该方法的有效性在我们的全基因组mRNA表达芯片中得到证实。杂交在42°C水浴中过夜。芯片在42°C用洗涤溶液(0.2% SDS, 2 X SSC)连续洗涤5分钟，用0. 2% SSC在室温下洗涤5分钟。芯片用共聚焦的LuxScanTM扫描仪扫描，用LuxScanTM 3. OTM软件分析获得图像。计算分析每条miRNA的重复点的平均值除去背景，标准化后进行进一步分析。采用每个芯片中值进行标准化，使用中值矩阵。对于所有样品中，从数据中除去表达信号低于800的基因。通过芯片显著性分析(SAM) (www-stat. Stanford, edu/ tibs/SAM/index. html))确定不同表达的miRNAs。对于每个基因，SAM根据相对于所有测量的标准偏差的表达变化情况，给出一个数值。根据平均连锁和皮尔森相关性进行分级聚类。支持向量机方法用于交叉验证和预测测试集。用4种公开可利用的算法分析最显著的miRNA的靶标，如MIRANDA (http //www. miRNA. org/)， TARGETSCAN(http//www. targetscan. org/)， PICTAR(http://pictar. bio. nyu. edu/) and miRBase (http: //miRNA. sanRer. ac. uk/sequences/)。为了减少假阳性，所接受的假定靶标基因至少要被3个程序预测到。Kaplan-Meier曲线用于确定miRNA表达与从诊断到治疗结束时间的相关性。表1.实时PCR分析为了验证miRNA表达谱，提取全RNAs用microRNA特异性的引物进行qRT_PCR。 反转录酶反应条件2. 5ng/ μ 1全RNA，25ηΜ根-环RT引物，1 XRT buffer,每种dNIPs 0. 25mM,200 U M-MLV 反转录酶，0. 25U/ml RNase 抑制剂 Qnvitrogen)。7. 5ml 反应体系在 MJ Research PTC-225 Thermocycler 中温浴，在 16°C保持 30 分钟，在 42°C C30 分钟，在 85°C保持5分钟，然后在4°C保存。所有逆转录，包括非模板的对照，都有一个重复。实时 PCR 用 FastStart DNA Master SYBR green I 试剂盒和 LightCycler，按照操作手册进行。 10 μ 1 PCR体系包括Ιμ RT产物，IXPCR Master Mix，15nM上游引物和15nM下游引物。 反应95°C保持10分钟，接着进行40个循环95°C保持15秒，60°C保持35秒，72°C保持3 秒。所有qRT-PCR反应，包括非模板的对照，都有一个重复。采用循环数的交叉点(CP)确定 miRNAs的相对表达比率。人TO的基因表达分析用做内标。结果用LightCycler software version 3. 5 (Roche Diagnostics)分析。用溶解曲线分析实时PCR扩增产物，并用凝胶电泳证实。表1列出了引物序列。表1.
权利要求
1.探针在确定食道癌病人生存预后的制剂中应用，所述探针为分别与如下minRNA完全互补的探针hsa-miR-103 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA ； hsa-miR-107 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA。
2.试剂在制造提高食道癌患者生存的药物制剂中的应用，其特征是所述试剂为分别与如下minRNA完全互补的探针hsa-miR-103 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA ； hsa-miR-107 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA。
3.—种药物组合物，其特征是，所述药物组合物为分别与如下minRNA完全互补的探针hsa-miR-103 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA ； hsa-miR-107 :AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA。
全文摘要
本发明提供了根据特定miRNAs的水平或相应的基因状态，用于食道癌诊断、分型和预后的方法和组合物。本发明同时也提供了含有能够降低miRNA水平组分的组合物，使用它因此而提高了食管癌病人生存率。
文档编号A61K48/00GK102399870SQ20111031654
公开日2012年4月4日 申请日期2006年11月28日 优先权日2006年11月28日
发明者凯斯·米切尔逊, 孟欣, 张亮, 程京, 赫捷, 郭永, 陈照丽 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所, 博奥生物有限公司, 清华大学