°C。
[0094] rRNA去除：
[0095] 1)当杂交后样品已经降温到37°C时，快速离心，把样品收集到EP管底部；
[0096] 2)把320μ1的样本转移到已经准备好的Ribominus?MagneticBead;利用移液器 枪头上下吹打混合均匀；
[0097] 3)置于37°C水浴中温育15min，在温育期间，间隔轻微振荡样品。然后低速离心把 样品收集到管底部；
[0098] 4)将EP管放在磁力架上静置lmin，已经结合rRNA的磁珠会被吸附到管壁上， Ribominus?RNA已经存在于溶液中；
[0099] 5)把已准备好的250μ1的磁珠混合液（在Beads的准备中第7步）放在磁力架 上静置lmin，吸取管内液体并弃去；
[0100] 6)向EP管中加入约320μ1的含有Ribominus?RNA(第4步），用枪上下吹打混 合均匀；
[0101] 7)37°C温育15min，期间偶尔轻微振荡，然后离心把样品收集到EP管底部；
[0102] 8)把EP管放在磁力架上静置lmin，把含有Ribominus?RNA的溶液转移至新EP管 内。
[0103] 酒精沉淀法浓缩RiboMinus?RNA
[0104] 1)把RiboMinus?RNA样本转移至RNase-free的2ml的离心管内，
[0105] 2)向RiboMinus?RNA中加入以下试剂：
[0106] Glycogen(20ng/μ1) 1μ1
[0107] 醋酸钠（3Μ) 53μ1
[0108] 100 % 的酒精 1325μ1
[0109] 3)混合均匀，-80°C静置 30min。
[0110] 4) 4°C，12000g离心15min。小心吸走溶液，不要碰触到底部的沉淀，
[0111] 5)加入500μ1 70%的已经预冷的酒精，
[0112] 6) 4°C，12000g离心 5min;去除上清，
[0113] 7)重复 5-6 步。
[0114] 8)打开试管盖，室温自然干燥约5min，用30μ1DEPC水来重新溶解 RiboMinus?RNA。
[0115] (3)solexa测序
[0116] 将以构建完成的ncRNA文库交至华大基因进行Solexa测序。采用的测序仪为 Hi-seq2000,策略为双末端测序，两侧各测100bp即得出的序列长度均是2X100bp。双端 测序是测序技术中的一个重要的技术，通过双端测序可以准确的计算出测序片段的长度， 弥补了单端测序的缺陷，因此可以更准确的进行重复区域序列的定位以及序列的拼接等。
[0117] 实施例2根据solexa中所得测序结果，对所得的数据进行LncRNA的筛选进行不 同病理学分析。
[0118] LncRNA表达的定量分析及在不同病理指标上的表达相关性
[0119] 乳腺癌组织和乳腺癌旁组织样本信息按照数据库网站http://www.cbioportal. org/，对乳腺癌中按"MutationsI?:Putativecopy-numberalterationsfromGISTIC mRNAExpressionz_Scores(RNASeqV2RSEM)"进行筛选，从959例乳腺样本对HUGOgene nomenclaturecommittee(http: //www.genenames.org/)中认可的 2, 7311ncRNAs进行分 析，筛选出959例乳腺病人样本具有完整的病理信息，959病例信息如下：
[0120] 表1乳腺癌及癌旁组织病人的临床病理信息
[0121]
[0122]
[0123] (l)LncRNA在乳腺癌组织中的表达在病理分级上测序结果分析（图1)
[0124] 将乳腺癌样本按病理信息整理乳腺癌病理分期I期（160例）、II(536例）和 III(211 例），发现linc0657,linc00346,linc00654,linc00925 和HCG11 在乳腺癌病理分期 II期表达比例比较高，在乳腺癌病理分期I和III期表达比例比较II期显著要低。因此目标 LncRNA在临床上可作为乳腺癌病理分期II期诊断指标。
[0125] (2)LncRNA在乳腺癌组织中的表达在雌激素受体（ER)上的测序结果分析（图2)
[0126] 由于雌激素受体和孕激素受体的过表达是乳腺癌的主要因素之一，与癌细胞的分 化、转移及内分泌治疗有密切的关系。根据乳腺癌样本按病理信息整理ER阴性（ER-，共288 例），ER阳性（ER+,共 671 例），发现 1inc0657 (7. 09 % )，1inc00346 (5. 11 % )，1inc00654 (5 ?11%),linc00925(3. 34%)在ER阳性组表达的比例高于1111(3〇657(3.44%)，1111(3〇0346(2· 4% )，linc00654 (2. 4% )，linc00925 (2. 4% )在ER阴性组表达，而HCG(1. 56% )在ER阳性 组表达的比例低于HCG11(4. 8% )在ER阴性组表达。说明linc0657,linc00346,linc00654 和linc00925在ER阳性上可能高表达，可根据表达水平进行有效的治疗方案，具有广泛的 临床应用前景。
[0127] (3)LncRNA在乳腺癌组织中的表达在孕激素受体（PR)上的测序结果分析（图3)
[0128]根据乳腺癌样本按病理信息整理PR阴性（PR-，共384例），PR阳性（PR+，共 575 例），发现 1inc〇657 (5·別 ％ )，1incO〇346 (4. 〇7 % )，1incO〇654 (4. 〇7 % )在PR阳性 组表达的比例高于linc0657(4.69 % )，linc00346(3.44% )，linc00654(3.44% )在PR 阴性组表达，而linc00925(2. 19% )和HCG11(1.56% )在PR阳性组的表达比例低于 linc00925(3. 55% )，HCG11(4. 8% )在PR阴性组表达。linc00925 和HCG11 可初步反应PR 在乳腺癌的表达情况。
[0129] (4)LncRNA在乳腺癌组织中的表达在HER2上的测序结果分析（图4)
[0130] 原癌基因人类表皮生长因子受体2(HER2)基因，是重要的乳腺癌预后判断因子， 其在患者中过表达。根据乳腺癌样本按病理信息整理HER2阴性（ER-，共774例），HER2阳 性（ER+,共 185例），发现linc0657(2. 19%),linc00346(1.04%)，linc00654(1.04%)，li nc00925(0. 63% )和HCG11(0. 83% )在HER2 阳性组表达的比例低于linc0657(8. 55% )，1 inc00346 (6. 47 % )，1inc00654 (6. 47 % )，1inc00925 (5. 11 % )和HCG(5. 53 % )HER2 阴性组 表达。说明这5种LncRNA在HER2阴性上可能高表达，可根据表达水平进行有效的治疗方 案，在临床上具有潜在的应用意义。
[0131] (5)LncRNA在乳腺癌组织中的表达在肿瘤大小上的测序结果分析（图5)
[0132] 将乳腺癌样本按病理信息整理肿瘤大小T1期（248例）、T2 (543例）、T3 (111例） 和Τ4 (35 例）发现 1inc0657, 1inc00346, 1inc00654, 1inc00925 和HCG11 在乳腺肿块Τ3 和 T4表达比例比较低，而在乳腺肿块I和II期表达比例比较高。
[0133] (6)LncRNA在乳腺癌组织中的表达在淋巴结肿大上的测序结果分析（图6)
[0134]乳腺癌的癌细胞沿淋巴管扩散性淋巴转移，可根据其转移的位置确定是否采用保 乳手术。根据乳腺癌样本按病理信息整理淋巴结肿大阴性（共446例），阳性（共493例）， 发现linc0657,linc00346,linc00654和linc00925表达比例在淋巴结肿大阴性和阳性 水平上的表达相当，并没有区别，而HCG11在淋巴结肿大阴性的表达比例低于在阳性水平。 HCG11可初步反应淋巴结肿大的情况。
[0135] (7)LncRNA在乳腺癌组织中的表达在患病年龄上的测序结果分析（图7)
[0136] 根据乳腺癌样本按病理信息中的患病年龄得出中位数为52岁，以52岁为界，分为 两个年龄组，对低年龄组的327例样本和高年龄组的612例进行分析，发现linc0657,line 00346,linc00654,linc00925和HCG11在高年龄组表达的水平和低年龄组表达水平相当。 说明这5种LncRNA的表达变化与年