用于乳腺癌的诊断/预后的方法

专利名称：用于乳腺癌的诊断/预后的方法
用于乳腺癌的诊断/预后的方法本发明涉及用于乳腺癌的诊断/预后的方法。本发明还涉及可在本 方法中使用的扩增引物和杂交探针，以及涉及用于乳腺癌的诊断/预后 的试剂盒。乳腺癌是一种常见的疾病每11个妇女就有1个在其一生中发展 出乳腺癌。然而，由于存在各种不同类型的乳腺癌和各种不同的对乳 腺癌的预后，患有乳腺癌的妇女不会全部都接受相同的治疗医生给 每位患者建议一种适合其情况的治疗，以便获得最佳的恢复机会。因而，将作为乳腺癌中的一般疗法的激素疗法用于激素依赖性乳 腺癌，即在其细胞表面上表达激素受体的肿瘤的情形。在手术后，激 素疗法可单独使用或接续在辅助性化疗之后进行使用。在疾病复发的 情况下，激素疗法可单独地开处方，或者与化疗相联合或接续地开处 方。化疗其本身是一种通用的癌症疗法，因为由血液循环携带的药物 可以在生物体的各处发挥作用。化疗在治疗手段中占有重要位置，特 别是在过去的十年左右，伴随着新分子的出现。所述药物最通常通过 静脉输注、通过皮下途径或通过肌内途径来进行施用。因而，取决于激素受体在激素细胞表面的表达，治疗将朝向或不 朝向激素疗法。应该特别提到雌激素受体ER和孕酮受体(PR)，这两种受体是最 熟知的用于预测乳腺癌中对激素疗法的响应的参数。UPA(尿激酶型纤 溶酶原激活物)和PAI-1 (纤溶酶原激活物抑制剂类型-l)基因的表 达分析也使得可能从乳腺癌的预后工具中获益。这些基因牵涉细胞外 基质的破坏，并因而是牵涉肿瘤转移形成的因子(Andreasen等人，Int. J. Cancer, 1997 )。为了给患者提供合适的治疗，因而有必要了解激素受体例如ER和PR的表达。这种表达最通常在原发性肿瘤上通过免疫组织化学来研 究。此外，了解HER2受体的表达是重要的，通过免疫组织化学研究的 HER2受体的过表达是预后不良的一个因素。在存在疑虑情况下，通过 原位杂交(FISH)来研究HER2基因的基因扩增是所使用的备选方法。 最后，作为肿瘤的侵袭性因子的UPA和PAI-1的表达分析通过ELISA (酶联免疫吸附测定法)来进行研究。近些年来，已经能够检测小尺寸的肿瘤，从而使得能较早诊断乳 腺癌，但是由于少量的肿瘤组织使得难以进行对上面提到的激素受体 和因子的蛋白质定量，所以对于这种癌的预后仍然很难。本发明提出了一种用于乳腺癌的诊断/预后的新方法。该方法特别 地利用对UPA和PAI-1基因的表达分析，该分析通过使用可用作扩增 引物或杂交探针的新的核苷酸序列来进行。根据本发明的方法尤其使 得能够确定患有乳腺癌的患者的预后，以便给所述患者提供合适的疗 法。在这方面，本发明涉及用于乳腺癌的诊断/预后的方法，所述方法 包括以下步骤A -从生物样品中提取核物质(mat6riel nucl6ique); B -使用至少一对扩增引物来获得所述核物质的至少一种靶序 列的扩增子；C -使用至少一种检测探针来检测所述扩增子的存在， 所述方法的特征在于，在步骤B中，所述引物对包括至少一种含 有选自SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 8的核苷酸序列的至少10个核苷 酸单元的扩增引物，和/或在步骤C中，所述检测探针含有选自SEQ ID No. 9至SEQIDNo. 10的核苷酸序列的至少10个核苷酸单元。令人惊奇地，本发明人因而已经发现，在用于乳腺癌的诊断/预后 的方法中，将含有选自SEQ ID No. l至SEQ ID No. 8的核苷酸序列 的至少10个核苷酸单元的核苷酸序列用作用于扩增靶序列(例如编码 UPA和PAI-1的基因)的扩增引物是十分恰当的。本发明还已经发现， 对于在靶序列例如编码UPA和PAI-1的基因上的特异性杂交而言，将含有选自SEQ ID No. 9至SEQ ID No. 10的核苷酸序列的至少10个 核苷酸单元的核苷酸序列用作杂交探针是十分适合的。为了本发明目的，术语"生物样品"表示可能含有如下文定义的 核物质的任何样品。这种生物样品可以取自患者，并且特别可以是来 自患者的组织、血液、血清、唾液、循环细胞样品。优选地，这种生 物样品取自肿瘤。这种生物样品通过本发明技术人员已知的任何采样 手段获得。为了本发明的目的，术语"核物质"包括核酸序列，例如脱氧核 糖核酸(DM)或核糖核酸(RNA)序列。根据本发明的一个优选实施 方案，核物质包括脱氧核糖核酸序列。根据本发明的一个优选实施方 案，核物质从取自患者的生物样品中提取。术语"核苷酸序列"(或者，核酸序列或者核苷酸片段序列或者 寡核苷酸或多核苷酸序列)表示通过磷酸酯键组装在一起的一连串核 苷酸单元，其特征在于能与另一核酸序列杂交的天然核酸的信息序列， 所述核苷酸单元串可能含有不同结构的单体，并且可能从天然的核酸 分子开始和/或通过遗传重组和/或通过化学合成而获得。术语"核苷酸单元"表示可能为核酸的天然核苷酸的单体的衍生 物，它的组成元素是糖、磷酸酯基团和含氮碱基；在DNA中，所述糖 是2-脱氧核糖，在RNA中，所述糖是核糖；取决于其是DM还是RM， 所述含氮碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；或 者，该单体是在所述三个组成元素的至少一个中经修饰的核苷酸；例 如，修饰可以在碱基水平上发生，具有经修饰的碱基例如肌苷、5~甲 基-脱氧胞苷、脱氧尿苷、5-二甲基氨基-脱氧鸟苷、2， 6-二氨基-嘌呤、 5-溴-脱氧鸟苷或能够杂交的任何其他经修饰的碱基，或者修饰在糖水 平上发生，例如用聚酰胺替代至少一个脱氧核糖(P. E. Nielsen等人， Science, 254， 1497-1500 (1991))，或者修饰在磷酸酯基团水平上 发生，例如用特别地选自二磷酸酯、烷基膦酸酯、芳基膦酸酯和硫代 磷酸酯的酯替代磷酸酯基团。这种核物质包括至少一种靶序列。术语 "乾序列"表示这样的序列，它的核苷酸单元串对于靶基因，例如优选地编码UPA或PAI-1的基因是特异的。根据本发明的一个优选实施 方案，所述靶序列被包含于选自编码UPA或PAI-1的基因的基因内。 在本公开内容的其余部分，将使用术语"靶序列"而不考虑其是单链 还是双链的。在步骤A中，通过本领域技术人员已知的任何方法从生物样品中 提取核物质。例如，核酸提取可以通过下列步骤来进行将存在于生 物样品中的细胞裂解以便释放包含在细胞的蛋白质和/或脂质包膜(例如细胞碎片，其干扰随后的反应)中的核酸。例如，可以使用如描述 于下列文献中的裂解方法专利申请W0 00/05338,关于磁力和机械的 混合裂解；专利申请WO 99/53304 ，关于电裂解；和专利申请W0 99/15321，关于机械裂解。本领域技术人员可以使用其他熟知的裂解 方法，例如热或渗透压休克或者使用离液剂如胍盐的化学裂解(US 5， 234, 809 )。这种裂解步骤后还可以是纯化步骤，该纯化步骤使得核 酸与在裂解步骤期间释放的其他细胞成分分开。该步骤一般使得能够 浓缩核酸，并且可以适合用于DNA或RNA的纯化。例如，可以使用任 选地通过吸附或共价而用寡核苷酸包被的磁性颗粒(在这方面，参见 US 4， 672, 040和US 5， 750， 338 ),并因而通过洗涤步骤来纯化结合在 这些磁性颗粒上的核酸。如果期望随后扩增所述核酸，那么这种核酸 纯化步骤是特别有利的。此类磁性颗粒的一个特别有利的实施方案描 述于专利申请WO 97/45202和WO 99/35500中。核酸纯化方法的另一 个有利的实例是使用二氧化硅，以柱的形式或者以惰性颗粒(BoomR. 等人，J. Clin. Microbiol., 1990， n。 28(3)， p. 495-503 )或磁 性颗粒(Merck: MagPrep Si 1 ica， Promega: MagneSi 1 Paramagnet ic particles )的形式。其他十分广泛4吏用的方法基于以柱或以顺磁颗粒 形式的离子交换树月旨(Whatman: DEAE-Magarose ) ( Levison PR等人， J. Chromatography, 1998， p. 337-344 )。十分合适但对于本发明 而言并非唯一的另外方法是吸附在金属氧化物支持物(Xtrana公司 Xtra-BindTM基质)上的方法。当期望从生物样品中特异性地提取DNA时，特别地可以进行用苯酚、氯仿和醇的提取，以便除去蛋白质，并且用100%的醇沉淀DM。 然后通过离心让DNA形成粒状沉淀，洗涤，并再悬浮。在步骤B中，使用至少一对扩增引物来获得所述核物质的至少一 种靶序列的扩增子。为了本发明的目的，术语"扩增引物"表示含有10-IOO个核苷酸 单元，优选15-25个核苷酸单元的核酸序列。该扩增引物包含选自SEQ ID No. 1至8的序列的至少10个，优选15个，和更优选20个核苷 酸单元。一对扩增引物使得能够起始酶促聚合作用，例如特别是酶促扩增 反应。术语"酶促扩增反应"表示通过至少一种酶的作用来产生核酸序 列的多个拷贝(或扩增子)的过程。为本发明的目的，术语"扩增子" 表示在酶促扩增反应过程中获得的靶序列的拷贝。这种扩增反应是本 领域技术人员所熟知的，并且可特别提到PCR(聚合酶链反应)，例 如描述于专利US-A-4， 683， 195、 US-A-4， 683， 202和US-A-4， 800， 159 中；LCR(连接酶链反应)，例如在专利申请EP-A-0 201 184中公开； RCR (Repair Chain Reaction)(修复链反应)，描述于专利申请 WO-A-90/01069中；3SR (Self Sustained Sequence Replication)(自动维持序列复制)，专利申请WO-A-90/06995; NASBA(基于核酸 序列的扩增)，专利申请WO-A-91/02818;或者TMA(转录介导的扩增), 专利US-A—5， 399, 491。一般而言，此类酶促扩增反应通常执行一系列包含以下步骤的循环o如果耙序列是双链，则将其变性，以便获得互补的两条靶链， o将在前面的变性步骤中获得的每条靶链与至少一种扩增引物 进行杂交，o在存在聚合酶和核苷三磷酸(根据所述技术为核糖核苷三磷酸 和/或脱氧核糖核苷三磷酸)时，从扩增引物形成链，所述链与它们在 其上杂交的链互补，以给定数目的次数重复该循环，以便以足够允许检测其的比例获 得靶序列。术语"杂交"表示这样一个过程在该过程中，于合适的条件下， 两条核酸序列，例如特别是一个扩增引物和一个乾序列或者一个杂交 探针和一个靶序列，以稳定且特异的氩键相互结合以致形成双链。这 些氢键在互补碱基腺噪呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))之 间(则这称为A-T键)或在互补碱基鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之间 (则这称为G-C键)形成。两条核酸序列的杂交可以是全部的(则称 为互补序列)，即在该杂交过程中获得的双链仅包含A-T键和C-G键。 这种杂交可以是部分的(则称为足够互补的序列)，即获得的双链包 含允许形成双链的A-T键和C-G键，但还包含未与互补碱基结合的碱 基。两条互补序列或足够互补的序列之间的杂交取决于所使用的操作 条件，并且特别是严紧性。严紧性特别是根据两条核酸序列的碱基组 成来定义，以及通过这两条核酸序列之间的错配程度来定义。严紧性 还可以取决于反应参数，例如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和 类型，变性剂的性质和浓度，和/或杂交温度。所有这些数据是所熟知 的，并且合适的条件可以由本领域技术人员来确定。更具体来说，NASBA是核酸的等温扩增技术，其基于三种酶的联 合作用(AMV逆转录酶、RNA酶H和T7 RNA聚合酶)。与靶序列的特 异性扩增引物相组合，NASBA在90分钟内扩增RNA靶多于十亿次。扩 增反应在41。C下进行，并且产生单链RNA分子作为终产物。NASBA需 要一对引物，其中至少 一种引物包含允许起始通过T7噬菌体聚合酶进 行的转录的启动子。这种引物优选选自SEQ ID No. 11和12。根据本 发明的一个特定实施方案，所述引物对包括至少一种包含启动子的扩 增引物，所述启动子允许起始通过T7噬菌体聚合酶进行的转录。根据本发明的一个特定的实施方案，用于步骤B中的所述引物对 选自以下引物对□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 1的至少10个，优选15个，更 优选20个核苷酸单元的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物； 例如，当第一引物具有序列SEQ ID No. 1且第二引物具有序列SEQ ID No. 2时，获得了对于编码PAI-1的基因特异的、大小为216个碱基 对的扩增子，其相应于编码PAI-1的基因的参考序列(Genbank NM一000602. 1 )上的序列394-610。□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 3的至少10个，优选15个，更 优选20个核苷酸单元的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 4的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物； 例如，当第一引物具有序列SEQ ID No. 3且第二引物具有序列SEQ ID No. 4时，获得了对于编码PAI-1的基因特异的、大小为1058个碱基 对的扩增子，其相应于编码PAI-1的基因的参考序列(Genbank NM_000602. 1 )上的序列88-1146。□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 5的至少10个，优选15个，更 优选20个核苷酸单元的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 6的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物； 例如，当第一引物具有序列SEQ ID No. 5且第二引物具有序列SEQ ID No. 6时，获得了对于UPA基因特异的、大小为194个碱基对的扩增 子，其相应于编码UPA的参考序列(Genbank NM-002658. 1 )上的序列 1661-1855。□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 7的至少10个，优选15个，更 优选20个核苷酸单元的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 8的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物； 例如，当第一引物具有序列SEQ ID No. 7且第二引物具有序列SEQ ID No. 8时，获得了对于UPA基因特异的、大小为927个碱基对的扩增 子，其相应于编码UPA的参考序列(Genbank NM-002658. 1 )上的序列 1228-2155。根据本发明的一个特定的实施方案，用于步骤B中的所述引物对 包括含有允许起始通过T7噬菌体聚合酶进行的转录的启动子的第一 引物，并且选自以下引物对□ SEQIDNo. ll的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ IDNo. 2的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物；□ SEQIDNo. 12的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ IDNo. 6的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物。为了考虑可在扩增反应的不同步骤中观测到的酶促效率的可变 性，可以通过同时测定"持家，，基因的表达来使靶基因的表达标准化， 所述"持家"基因的表达在不同患者群体中是类似的。通过得到靶基 因的表达和持家基因的表达之间的比率，从而校正不同试验之间的任 何可变性。本领域技术人员将可特别参考以下出版物Bustin SA /卯/77a/c>//z/<9/eci//ar e/7^/ocr//Wo 2002， 29: 23-39; Giulietti A Me^ o&， 2001， 25: 386-401。根据本发明的一个特定实施方案， 在步骤B中，还利用至少一对扩增引物来获得持家基因的特异的扩增 子。术语"持家基因"表示其表达在给定组织中是稳定的而与生理情 况无关的基因。根据本发明的一个优选的实施方案，持家基因是编码 亲环蛋白B的PPIB基因。本领域技术人员还可特别参考申请 PCT/FR04/050661,该申请以参考形式包括在本申请内。在步骤C中，使用至少至少一种检测探针来检测所述扩增子的存 在。该检测步骤可以通过在涉及核酸检测的领域中的技术人员已知的 任何方法来进行。为本发明的目的，术语"杂交探针"表示10-100个核苷酸单元， 特别是15-35个核苷酸单元的核酸序列，该核酸序列在确定条件下具 有杂交特异性，从而与靶核酸序列形成杂交复合物。杂交探针可以包含允许其检测的标记物。那么将其称为检测探针。术语"检测"表示 通过物理方法来直接检测，或通过借助于标记物的检测方法来间接检 测。存在许多检测方法用于检测核酸[参见，例如Kricka等人， Clinical Chemistry, 1999， n。 45(4)， p. 453-458;或Keller G.H. 等人，DNA Probes, 2nd Ed. ， Stockton Press, 1993， sections 5 and 6， p. 173-249]。术语"标记物"表示能产生可被检测的信号的示踪剂。 这些示踪剂的非限制性名单包括，产生可例如通过比色法、荧光或发光进行检测的信号的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；生色团，例如荧光化合物、发光化合 物或染料化合物；可通过电子显微镜或通过它们的电学性质如电导率， 通过电流分析法或伏安法，或通过阻抗测量进行检测的电子密集性基 团；可通过光学方法例如衍射、表面等离子体共振、接触角变化，或 通过物理方法例如原子力光镨学、隧道效应等进行检测的基团；放射 性分子如"P、 "S或1251。为本发明的目的，杂交探针可以是"检测"探针。在该情形中， 所述"检测"探针借助于如上定义的标记物进行标记。由于这种标记 物的存在，有可能检测在给定检测探针和给定种类的特异靶序列之间 的杂交反应。检测探4十可以特另'J是:ft口 Tyagi & Kramer ( Nature biotech， 1996， 14 : 303-308 )描述的"分子信标"检测探针。这些"分子信标"在杂 交过程中变成能发荧光。它们具有颈-环型结构并且含有荧光团和"猝 灭剂，，基团。特异的环序列与靶核酸的其互补序列的结合引起颈展开 并且在以合适的波长激发过程中发射荧光信号。杂交探针也可以是"捕获探针，，。在这种情形中，通过任何合适 的手段，即直接或间接地，例如通过共价或吸附将捕获探针固定在或 可固定在固体支持物上。然后检测在给定捕获探针和靶序列之间的杂 交反应。对于杂交反应的检测，可以使用经直接(特别是通过将标记物整 合入靶序列中)或间接(特别是通过使用如上面定义的检测探针)标 记的靶序列。特别地，在杂交步骤之前可以进行靶序列的标记和/或切 割步骤，例如在酶促扩增反应过程中使用经标记的脱氧核糖核苷三磷 酸。切割可以特别地通过咪唑和氯化锰的作用来进行。靶序列也可以 在扩增步骤后进行标记，例如通过根据文献WO 91/19812中描述的夹 心杂交技术使检测探针杂交来进行。标记核酸的另一种优选的特定方 法描述于申请FR 2 780 059中。作为固体支持物，可以使用合成材料或天然材料，任选经化学修饰的，特别是多糖，例如基于纤维素的材料，例如纸，纤维素衍生物 例如醋酸纤维素和硝酸纤维素，或葡聚糖，聚合物，共聚物，特别是 基于苯乙烯类型的单体的，天然纤维例如棉花，以及合成纤维例如尼龙；矿物质例如二氧化硅、石英、玻璃、陶瓷；胶乳；磁性颗粒；金 属衍生物；凝胶等。固体支持物可以是微量滴定板的形式，如申请WO 94/12670中描述的膜形式，或颗粒形式。根据本发明的一个优选的实施方案，检测探针包含荧光团和幹灭 剂。根据本发明的一个更优选的实施方案，杂交探针在其5'端包含荧 光团FAM ( 6-羧基荧光素)或ROX ( 6-羧基-X-罗丹明)，和在其3'端 包含猝灭剂(Dabsyl)。在后面的公开内容中，这种杂交探针称为"分 子信标"。根据本发明的一个优选的实施方案，步骤B和C同时进行。这种 优选的实施方案可以通过"实时NASBA，，进行，所述实时NASBA在单 个步骤中合并了 NASBA扩增技术和使用分子信标的实时检测。NASBA 反应在试管中进行，产生了单链RNA，特异性的分子信标可以同时与 其杂交而产生荧光信号。新RNA分子的形成通过在荧光读取器中连续 监控信号来实时测量。与通过RT-PCR的扩增不同，通过NASBA的扩增 可以在样品中存在DNA时进行，即，即使在RNA提取过程中DNA还未完全去除的情况下进行。如在下文的实施例中介绍的，当期望检测编码PAI-1的靶基因(参 考序列的NCBI登录号NM_000602. 1 )时，在步骤b)中，优选使用□ SEQ ID No. 1或11的第一引物□ SEQ ID No. 2的第二引物， 并且，在步骤c)中，优选使用□ 包含SEQ ID No. 9的检测探针。如在下文的实施例中介绍的，当期望检测编码UPA的靶基因(参 考序列的NCBI登录号NM—0O2658. 1 )时，在步骤b )中，优选使用 a SEQ ID No. 5或12的第一引物□ SEQ ID No. 6的笫二引物，并且，在步骤C)中，优选使用□ 包含SEQ ID No. IO的检测探针。当在步骤B中使用扩增引物对来获得持家基因的特异性扩增子 时，所述持家基因的特异性扩增子可以以与上面描述的相当的方式进 行检测，特别是通过使用检测探针来检测。根据本发明的一个优选的 实施方案，持家基因是编码亲环蛋白B的PPIB基因。优选地，检测探 针包含荧光团和摔灭剂。本发明还涉及舍有选自SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 8的核苷酸 序列的至少10个，优选15个，和更优选20个核苷酸单元的扩增引物。根据本发明的一个优选的实施方案，扩增引物含有允许起始通过 T7噬菌体聚合酶进行的转录的启动子。这种引物可以特别是SEQ ID No. 11至12中的任一种，并且优选用于NASBA扩增反应。本发明还涉及选自以下引物对的引物对□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 1的至少10个，优选15个，更 优选20个核苷酸单元的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 2的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物； 例如，当第一引物具有序列SEQ ID No. 1且第二引物具有序列SEQ ID No. 2时，获得了对于编码PAI-1的基因特异的、大小为216个碱基 对的扩增子，其相应于编码PAI-1的基因的参考序列(Genbank NM—000602.1 )上的序列394-610。□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 3的至少10个，优选15个，更 优选20个核香酸单元的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 4的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物； 例如，当第一引物具有序列SEQ ID No. 3且第二引物具有序列SEQ ID No. 4时，获得了对于编码PAI-1的基因特异的、大小为1058个碱基 对的扩增子，其相应于编码PAI-1的基因的参考序列(Genbank NM—000602.1 )上的序列88-1146。□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 5的至少10个，优选15个，更 优选20个核苷酸单元的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物； 例如，当第一引物具有序列SEQ ID No. 5且第二引物具有序列SEQ ID No. 6时，获得了对于UPA基因特异的、大小为194个碱基对的扩增 子，其相应于编码UPA的参考序列(GenbankM_002658， 1)上的序列 1661-1855。□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 7的至少10个，优选15个，更 优选20个核苷酸单元的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 8的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物； 例如，当第一引物具有序列SEQ ID No. 7且第二引物具有序列SEQ ID No. 8时，获得了对于UPA基因特异的、大小为927个碱基对的扩增 子，其相应于编码UPA的参考序列(GenbankNM-002658. 1 )上的序列 1228-2155。根据本发明的一个优选的实施方案，所述第 一引物包含允许起始 通过T7噬菌体聚合酶进行的转录的启动子。这种引物可以特别是SEQ ID No. 11至12中的任一种。当第一引物包含允许起始通过T7喏菌体 聚合酶进行的转录的启动子时，该第一引物优选被包括于选自以下引 物对的引物对中□ SEQ ID No. 21的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ IDNo. 2的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物；□ SEQ ID No. 22的第一扩增引物，和含有核苷酸序列SEQ ID No. 4的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的第二扩增引物。本发明还涉及如上定义的至少一种扩增引物和/或如上定义的至 少一对引物在NASBA扩增反应中的用途。本发明还涉及含有选自SEQ ID No， 9和SEQ ID No. 10的核苷酸 序列的至少10个，优选15个，更优选20个核苷酸单元的检测探针。优选地，这种检测探针包含荧光团和猝灭剂。本发明还涉及如上定义的至少一种引物和/或如上定义的至少一 对引物和/或如上定义的至少一种检测探针用于乳腺癌的诊断/预后的 用途。最后，本发明涉及用于乳腺癌的诊断/预后的试剂盒，所述试剂盒 包含如上定义的至少一种引物和/或如上定义的至少一对引物和/或如 上定义的至少一种检测探针。如在下文的实施例中介绍的，当期望检测编码PAI-1的耙基因时， 试剂盒优选包含□ SEQ ID No. 1或11的第一引物□ SEQ ID No. 2的第二引物□ 含有SEQ ID No. 9的检测探针。如在下文的实施例中介绍的，当期望检测编码UPA的靼基因时， 试剂盒优选包含□ SEQ ID No. 5或12的第一引物□ SEQ ID No. 6的第二引物□ 含有SEQ ID No. IO的检测探针。本发明还涉及用于乳腺癌的诊断/预后的试剂盒，其使得能够测定 □患有乳腺癌的患者是能受益于激素疗法(他莫昔芬)还是能受 益于免疫疗法(赫赛汀(Herceptin))。□ 所讨论的癌症具有好的预后还是差的预后，□ 肿瘤的侵袭性。为此，该试剂盒包含用于检测ER、 PR、 HER-2、 UPA和/或PAI-1 基因所必需的试剂，例如引物和/或探针。关于检测ER、 PR和HER-2 基因所需的引物和探针，本领技术人员可特别地参考专利申请 PCT/FR04/050661,其引入本文作为参考。关于检测UPA和PAI-1基因 所需的引物和探针，本领技术人员可参考上面说明的公开内容。下面的图以举例说明的方式给出，并且不具有任何限制性质。这将使得能够更清楚地理解本发明。图l描述了关于PAI-1和PPIB基因(图la， PAI-1为实线，PPIB 为虚线)以及UPA和PPIB基因(图lb， UPA为实线，PPIB为虚线) 而获得的的标准曲线，如下面的实施例中描述的。关于每种基因而获得的每条标准曲线表示了作为在NASBA扩增开始时存在的RNA拷贝数 的函数的达到扩增指数期出现所需的时间(也称为TTP:达到阳性 (positivity)的时间，阈时间)(在扩增开始时起始的RNA拷贝量 越大，达到指数期出现所需的时间越短)，其中标准曲线的获得是基 于对所述基因特异的参考序列，用分别对UPA和PAI-1基因特异的PCR 产物和关于PPIB基因的质粒在体外转录成RNA。下面的实施例以举例说明的方式给出，并且不具有任何限制性质。 这将使得能够更清楚地理解本发明。实施例1 -编码PAI-1和UPA的mRNA的扩增和实时检测 1/获得并制备样品该实施例使用三种肿瘤细胞系来进行，所述肿瘤细胞系的UPA和 PAI-1蛋白的表达先前已经通过ELISA进行测定；使用以下细胞系 MDA-MD-231 (表达因子UPA和PAI-1 )和MCF7 (既不表达UPA也不表 达PAI-1)。这些细胞系来源于美国典型培养物保藏中心(ATCC， Manassas, USA )。将这些细胞系在37t:下，对于MCF7在含有5% C02 的气氛中而对于MDA-MD-231在含有0% 0)2的气氛中，于DMEM培养基 (MCF-7)或Leibovitz培养基(MDA-MD-231)中培养，所述培养基补充有胎牛血清(io%)、非必需氨基酸(1%)和青審素(so 000 U)-链霉素(50pg)。该实施例还用来自患有乳腺癌的患者(n = 77)的肿瘤来进行， 在所述肿瘤中UPA和PAI-1的表达先前根据本领域技术人员已知的常 规技术通过ELISA测定。ELISA技术揭示了所迷蛋白质的表达。2/总RNA的提取使用Trizol Reagent,才艮据该试剂盒供应商(Invitrogen， Canada)的建议，从所述细胞系中提取总RNA。 RNA的质量和数量在260至280 nm测定，并且在琼脂糖凝胶上检验。然后于-70lC下冷冻 RNA直至使用。总RM还以相当的方式从患有乳腺癌的患者的肿瘤中提取。 3/通过MSBA进行扩增NASBA扩增反应基于禽类成髓细胞性白血病病毒的逆转录酶 (AMV-RT )、大肠杆菌RNA酶H和T7噬菌体RNA聚合酶的同时的活性 (Compton J， 1991， Nature, 350 : 91-92 )。扩增子的实时检测用 Nuclisens Easy(f读取器(bioM6rieux BV， The Netherlands)和如 上定义的"分子信标"检测探针来进行。NASBA定量基于使用从参考 序列获得的标准曲线，所述参考序列对于靶基因是特异的，在质粒中 体外转录成RNA。该标准曲线表示了作为在NASBA扩增开始时存在的 RNA拷贝数的函数的达到扩增指数期出现所需的时间(在扩增开始时 起始的RNA拷贝量越大，达到指数期出现所需的时间越短)。a) PAI-1和UPA基因以及PPIB持家基因的扩增-标准曲线的获得銷竭/^/-J ^乾差^^标^必4'(图la)对于编码PAI-1的靼基因(参考序列的NCBI登录号 NM一000602, 1 )，使用SEQ ID No. 3即5' CCAGCCCTCA CCTGCCTAGT 3' 的第一引物，该引物具有额外的相应于SP6启动子的序列，以及SEQ ID No. 4即5' CACCGTGCCA CTCTCGTTCA 3'的第二引物，这两个引物分 别位于参考序列的位置88-107和1127-1146，以便通过PCR (第一个 变性循环(95C; l分钟)，然后35个包括以下步骤的循环变性 94。C; l分钟；杂交601C; 1分钟；延伸2分钟，以及包括 一个变性步骤的最后一个循环72X:; 7分钟)产生1058 + 23 ( 23 为SP6序列的)个碱基对的扩增子，该扩增子对于编码PAI-1的基因 是特异的(这将称为"PAI-1扩增子")。然后，纯化如上所述获得的PAI-1扩增子(Qiaquicl^柱，Qiagen， Hilden， Germany)，并随后用RNA聚合酶(SP6 (Megascript⑧试剂盒，Ambion， Austin, USA)，根据扩增子的取向)在体外直接转录成RNA。 在通过用DNA酶进行处理从而除去质粒后，将所述RNA用Rneasy Mini Kit (Qiagen， Hilden， Germany)纯化并定量(R腸000Nano， Agilent Technologies, Walbronn， Germany)。获得的扩增子对于PAI-1基 因是非常特异的。将上面获得的RNA稀释成不同的浓度(储液0. 2xl()U拷贝/Vl， 从O. 2xl0"拷贝/pl至0.2><102拷贝/>1的级联稀释液)。在存在特异 性的PAI-1引物SEQ ID No. 1和特异性的PAI-1引物SEQ ID No. 2 和"分子信标"SEQ ID No. 9时，用Nuclisens basic⑧试剂盒 (bioM6rieux BV， The Netherlands)通过NASBA来扩增这些级联稀 释液口 0.2 ^M的第一PAI-1引物SEQ ID No. 1，即CTCCTTTCCC AAGCAAGTTG ，该引物在其端包含用小写字母表示的含有T7聚合 酶的启动子的序列，即完整序列为SEQ ID No. 11的第一引物5'□ 0.2 pM的第二 PAI-1引物SEQ ID No. 2,即5' GGGCCATGGA ACAAGGATGA ;□ 0. 1 jiM的包含SEQ ID No. 9即5' TGTTCCGGAG CACGGTCAAG 3' 的"分子信标，，，其在5'端用荧光团FAM ( 6-羧基-荧光素)标记并在 3'端用猝灭剂(Dabsyl ) 标记(完整序列 FAM-cgfl^^TGTTCCGGAGCACGGTCAAGc^^c^-Dabsyl )。在扩增过程中，信号与产生的扩增子的量成比例地增强。作为时 间的函数的荧光曲线使得能够确定将出现扩增指数期的时间(也称为 TTP:达到阳性的时间，阈时间)。PAI-1标准曲线将开始时存在于溶 液中的转录产物的数目与在NASBA扩增过程中测定的TTP相联系。利 用标准曲线，计算靼基因的绝对拷贝数目。最后，利用持家基因(在 本情况下为PPIB基因)使该值标准化。该PAI-1标准曲线显示在图 la中(实线曲线)。编确W為差西W标屏必戏'编码UPA的靶基因的曲线根据与关于PAI-1的相同的原理来产生， 除了所使用的扩增引物和分子信标之外，所述扩增引物和分子信标对 于UPA是特异的。因而，对于编码UPA的把基因(参考序列的NCBI登录号 NM-002658. 1 )，使用SEQ ID No. 7即5' CCAAGGCCGC ATGACTTTGA 的第一引物和SEQ ID No, 8即5' GCCAAGAAAG GGACATCTATG 3,的第 二引物，这两个引物分别位于参考序列的位置1228-1248和 2135-2155。然后，用RNA聚合酶(T7或SP6 (Megascript⑧试剂盒，Ambion， Austin, USA),根据扩增子的取向)将所述扩增子体外转录成RNA。 在通过用DNA酶进行处理从而除去质粒后，将所述RNA通过Rneasy Mini Kit ( Qiagen， Hilden， Germany)纯化并定量(RNA6000Nano， Agilent Technologies, Walbronn， Germany)。获得的扩增子对于 PAI-l基因是非常特异的。将上面获得的RNA稀释成不同的浓度(储液0. 2xl0"拷贝/pl， 从0. 2xl()U拷贝/nl至0. 2xl0卩拷贝/ji1的级联稀释物)。在存在以下 物质时用 Nuclisens basic 试剂盒 (bioM"ieux BV， The Netherlands)通过NASBA来扩增这些级联稀释物口 0. 2 的第一 UPA引物SEQ ID No. 5，即5' AGCCCTGCCC TGAAGTCGTT A 3、该引物在其5'端包含用小写字母表示的含有T7聚 合酶的启动子的序列，即完整序列为SEQ ID No. 12的第一引物5'□ 0. 2 jiM的第二 UPA引物SEQ ID No. 6，即5' CAGGGCATCT CCTGTGCATG 3"，□ 0. 1 pM的包含SEQ ID No. 10即5' TGTAAGCAGC TGAGGTCT 3' 的所使用的"分子信标"，其在5'端用荧光团FAM (6-羧基-荧光素) 标记并在3'端用猝灭剂(Dabsyl )标记(完整序列5' FAM-cg"cg TGTAAGCAGC TGAGGTCT c^k纩Dabsyl 3')。UPA的标准曲线显示于图lb中。PPIB靶基因的标准曲线PPIB靶基因的曲线根据与关于PAI-1的相同的原理来产生，除了扩增引物和分子信标之外，所述扩增引物和分子信标对于PPIB是特异的。因而，对于PPIB持家基因(参考序列的NCBI登录号M60857 )， 使用SEQ ID No. 13即5' ACATGAAGGT GCTCCTTGCC 3'的第一引物和 SEQ ID No. 14即GTCCCTGTGC CCTACTCCTT 3'的第二引物，这两个引物分别位于参考序列的位置11-30和631-650。这些PPIB扩增子的序列通过测序来验证(Biof idal， Vaulx en Velin， France)，以 确保其确实相应于想要扩增的靶基因的序列。获得的扩增子对于PPIB 基因是非常特异的。然后，用RNA聚合酶(T7或SP6 (Megascript⑧试剂盒，Ambion， Austin, USA)，根据扩增子的取向)将所述扩增子体外转录成RNA。 在通过用DNA酶进行处理从而除去质粒后，将所述RNA通过Rneasy Mini Kit (Qiagen， Hilden， Germany)纯4匕并定量(RNA6000Nano， Agilent Technologies, Walbronn， Germany)。将上面获得的RNA稀释成不同的浓度(储液0. 2xl()n拷贝/pl， 从O. 2xlO"拷贝/Vl至0. 2xl(f拷贝/Vl的级联稀释物)。在存在以下 物质时用 Nuclisens basic 试剂盒 (bioM&ieux BV， The Netherlands)通过NASBA来扩增这些级联稀释物□ 0.2 jiM的第一 PPIB引物SEQ ID No. 13，即CAGGCTGTCT TGACTGTCGT GA 3',该引物在其5'端包含用小写字母表示的含有T7 聚合酶的启动子的序列，即完整序列为SEQ ID No. 16的第一引物 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTCTTGACTGTCG TGA 3。□ 0.2 jiM的第二 PPIB引物SEQ ID No. 14,即5' AGGAGAGAAA GGATTTGGCT 3';□ 0. 1 的包含SEQ ID No. 15即GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3， 的"分子信标"，其在5'端用荧光团ROX (6-羧基-X-罗丹明)标记并 在 Y端用猝灭剂(Dabsyl )标记(完整序列 5' ROX-(^a&^GATCCAGGGCGGAGACTTCAc^a c^Dabsyl 30。PPIB标准曲线显示在

图1A和1B中(虛线曲线)。b) NASBA扩增反应 bl) PAI-1和PPIB基因的双重扩增该扩增反应4吏用Nuclisens basic⑧试剂盒(b满rieux BV， The Netherlands)来进行。为此，将从不同细胞系提取的5 ng的总RNA 加至10 pl的MSBA緩冲液(在20 pi反应介质中的终浓度40 mM的 Tris HC1, pH 8. 5， 12mMMgCl2， 7mMKCl， 5mM二硫苏糖醇，15% v/v DMS0， 1 mM的每种dNTP， 2 mM的每种NTP)中。在该介质中加入O. 1 jiM的分子信标，其包含□ SEQ ID No. 9，在5'端用荧光团FAM ( 6-羧基-荧光素)标记 并在3'端用猝灭剂(Dabsyl)标记，用于检测PAI-1基因的RNA;□ SEQ ID No. 15，在5'端用焚光团R0X ( 6-羧基-X-罗丹明)标 记并在3'端用猝灭剂(Dabsyl)标记，用于检测PPIB基因的RNA。在该介质中还加入以下物质□ 0. 2 pM的第一PAI-l引物SEQ ID No. 1，该引物在其5'端包 含含有T7聚合酶的启动子的序列，□ 0. 2 jLiM的第二PAI-l引物SEQ ID No. 2,□ 0. 2 pM的第一 PPIB引物SEQ ID No. 13，该引物在其5'端包 含含有T7聚合酶的启动子的序列，□ 0. 2 inM的第二PPIB引物SEQ ID No. 14。在65。C下预孵育2分钟，之后在41X:下孵育2分钟。加入5 体积的酶混合物(0. 08U的RNA酶H、 32U的T7 RNA聚合酶、6. 4 U 的AMV-RT)，并在4lr下孵育90分钟。实时测定转录的RM的量(NucliSens EasyQ， bioM6rieux )， NASBA 反应产生扩增子，特异性分子信标可以与所述扩增子杂交以致产生荧 光信号。新RNA分子的形成通过在荧光读取器(NucliSens EasyQ分 析仪)中连续监控信号来实时测量。数据的分析和自动化通信由Nuclisens TTP软件(bioM6rieux BV， The Netherlands)确保。将 如上(转录的RNA的稀释物108至102个拷贝)定义的标准曲线用于 定量ESR1靶基因和PPIB持家基因中每一个的表达，以便外推出每个 样品的mRNA拷贝数。靶基因的表达的定量表示为mRNA拷贝数/5 ng 总腿。表1给出了使用5 ng总RNA定量的PAI-1基因的表达，所迷总RM 来自MDA-MD-231和MCF7细胞系。表1- MCF7和T47D细胞中PAI-1基因的表达(NC:不可计算)PAI-1 mRNA拷贝数PPIB mRNA拷贝数PAI-1/PPIBMDA-MD-2 312. 52x1053. 04x1048, 29MCF7NC2. 60x106NCPAI-1基因的表达表示为耙基因的mRNA拷贝数与持家基因的mRNA 拷贝数的比率。因而，PAI-1 mRNA在MDA-MD-231细胞中表达，而其 在MCF7细胞中没有检测到，这与这些细胞的表达相一致。表2给出了使用50 ng总RNA定量的PAI-l基因的表达，所述总 RNA来自ELISA+肺瘤，即表达PAI-1蛋白的肿瘤，或来自ELISA-肿瘤。表2- ELISA+和ELISA-肿瘤中PAI-1基因的表达PAI-1 mRNA拷贝 的平均值PPIB mRNA拷贝 的平均值PAI-1/PPIBELISA-肿瘤2.83 x1041. 121xl062. 5x10—2ELISA+肿瘤7.70 x1041, 269x1066. 1x10—2PAI-1基因的表达表示为靶基因的mRNA拷贝数与持家基因的mRNA 拷贝数的比率。在ELISA+肿瘤中观察到PAI-1基因的过表达。基于先前产生的PAI-1和PPIB标准曲线，测定了对于双重扩增的 PAI-1和PPIB基因的检测极限和定量极限。对于PAI-1和PPIB，在 1000个mRNA拷贝时观察到定量极限。对于PAI-1和PPIB，检测极限 是100个mRNA拷贝。当用源于PAI-l-阴性的MCF7细胞系的总RM进行NASBA时，观 察不到信号。所有这些结果使用另一种扩增技术(定量RT-PCR)来确认 (PAI-1: r = 0. 7886， p<0. 0001， n=80; Spearman相关性统计检验)。 此外，对于PAI-1基因通过NASBA技术在信使RNA水平上获得的结果 与通过ELISA在蛋白质水平上获得的结果相关(PAI-l:r - 0.3590， p=0. 0013， n=77; Spearman相关性统计检验)。这些结果证明，mRNA 的表达与在胞质溶胶和细胞核中的存在相关，证实了在mRNA水平上研 究该基因的表达的优势。这些潜果证银，遞过时^/-//^/"双,^增炎谬游多灰十 AW矛始，^广泛她说，^c,分V、量^^，膚勿應矛始;Cf"/^差萄^表这，并_^^:全这合^于研究#乙^膚#梦辟/资^和^^: ,悉者对發定治^^询^。b2) UPA和PPIB基因的双重扩增该扩增反应使用Nuclisens basic⑧试剂盒(bioM6rieux BV， The Netherlands)来进行。为此，将从不同细胞系提取的5 ng的总RNA 加至10 pl的NASBA緩冲液(在20 Jul反应介质中的终浓度40mM的 Tris HC1， pH 8. 5， 12mMMgCl2， 7mMKCl， 5mM二硫苏糖醇，15% v/v DMSO， 1 mM的每种dNTP， 2 mM的每种NTP )中。在该介质中加入O. lpM的分子信标，其包含a SEQ ID No. 10，在其5'端用荧光团FAM (6-羧基-荧光素)标 记并在其3'端用猝灭剂(Dabsyl )标记，用于在UPA/亲环蛋白B的双 重扩增时检测编码UPA的RNA，□ SEQ ID No. 15，在5'端用荧光团R0X (6-羧基-X-罗丹明)标 记并在3'端用捽灭剂(Dabsyl)标记，用于检测PPIB基因的RNA。在该介质中还加入以下物质□ 0. 2 jLiM的第一 UPA引物SEQ ID No. 5，该引物在其5'端包含含有T7聚合酶的启动子的序列，□ 0. 2 jnM的第二UPA引物SEQ ID No. 6，□ 0. 2 nM的第一PPIB引物SEQ ID No. 13，该引物在其5'端包 含含有T7聚合酶的启动子的序列，□ 0. 2 的第二 PPIB引物SEQ ID No. 15。在65匸下预孵育2分钟，之后在41X:下孵育2分钟。加入5 pi 体积的酶混合物(0. 08U的RNA酶H、 32U的T7 RNA聚合酶、6. 4 U 的AMV-RT)，并在41。C下孵育90分钟。根据与关于UPA而描述的原理相当的原理，实时检测转录的RNA 的量。将如上(转录的RNA的稀释物108至102个拷贝)定义的标准 曲线用于定量UPA靶基因和PPIB持家基因的表达，以便外推出每个样 品的mRNA拷贝数。靶基因的表达的定量表示为mRNA拷贝数/5 ng总 RNA。表3给出了使用5 ng总RNA定量的UPA基因的表达，所述总RM 来自MCF-7和MDA-MD-231细胞系。表3- MCF-7和MDA-MD-231细胞中UPA基因的表达UPA mRM的拷贝数PPIB mMA的拷贝数UPA/PPIBMDA-MD-2 311. 67xl052, 96xl055. 62xl(T1MCF-7NC9. 49xl05NCUPA基因的表达表示为靼基因的mRNA拷贝数与持家基因的mRNA 拷贝数的比率。因而，UPA mRNA在MDA321细胞中表达，而其在MCF-7 细胞中没有检测到，这与在这些细胞中的表达相一致。表4给出了使用50 ng总RM定量的UPA基因的表达，所述总RNA 来自ELISA+肿瘤或来自ELISA-肿瘤。表4- ELISA+和ELISA-胂瘤中UPA基因的表达UPA mRNA拷贝 的平均值PPIB mRNA拷贝 的平均值UPA/PPIBELISA-肺瘤3. 70xl049. 82xl043. 8xl(T2ELISA+肿瘤6. 70xl(T8. 39xl058. Oxl(T2UPA基因的表达表示为靶基因的mRNA拷贝数与持家基因的mRNA 拷贝数的比率。在ELISA+肺瘤中观察到UPA基因的过表达。基于先前产生的UPA和PPIB标准曲线，测定了对于双重扩增的 UPA和PPIB基因的检测极限和定量极限。对于UPA和PPIB，分别在 1000和104个mRNA拷贝时测定到了定量极限。对于UPA和PPIB，检 测极限是100个mRNA拷贝。类似地，当用源于UPA-阴性的MCF7细胞系的总RNA进行MSBA 时，观察不到信号。所有这些结果使用另 一种扩增技术(定量RT-PCR )来确认(UPA: r =0.8029， p<0. 0001， n=81; Spear歸n相关性统计检验)。此外，对 于UPA基因通过NASBA技术在信使RNA水平上获得的结果与通过ELISA 在蛋白质水平上获得的结果相关(UPA:r = 0.5784， p<0. 0001， n-77; Spearman相关性统计检验)。这些结果证明，mRNA的表达与在胞质溶 胶和细胞核中的蛋白质的存在相关，证实了在mRNA水平上研究该基因 的表达的优势。这婆潜^证坊，遞d # 〃A/PP/"欢,^，炎谬游多^C十为、V、量^,g 矛始，^户《她说，^C十为、/、量^，yf叙應矛始定量〃A并j2^:全适合^f ^^:^靡^W梦浙/资,和硬究,悉者对 發定治疔的询^。
权利要求
1. 用于乳腺癌的诊断/预后的方法，所述方法包括以下步骤A-从生物样品中提取核物质；B-使用至少一对扩增引物来获得所述核物质的至少一种靶序列的扩增子；C-使用至少一种检测探针来检测所述扩增子的存在，所述方法的特征在于，在步骤B中，所述引物对包括至少一种含有选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.8的核苷酸序列的至少10个核苷酸单元的扩增引物，和/或在步骤C中，所述检测探针含有选自SEQ IDNo.9至SEQ ID No.10的核苷酸序列的至少10个核苷酸单元。
2. 权利要求1的用于乳腺癌的诊断/预后的方法，所述方法的特 征在于，在步骤B中，所述引物对选自以下引物对□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 1的至少10个核苷酸单元的第一 扩增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 2的至少IO个核苷酸单元的 第二扩增引物；□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 3的至少10个核苷酸单元的第一 扩增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 4的至少IO个核苷酸单元的 第二扩增引物；□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 5的至少10个核苷酸单元的第一 扩增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 6的至少IO个核苷酸单元的 第二扩增引物；□含有核苷酸序列SEQ ID No. 7的至少10个核苷酸单元的第一 扩增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 8的至少IO个核苷酸单元的 第二扩增引物。
3. 权利要求1或2中任一项的用于乳腺癌的诊断/预后的方法， 其中所述引物对包括至少一种含有启动子的扩增引物，所述启动子允许起始通过T7噬菌体聚合酶进行的转录。
4. 权利要求1-3中任一项的用于乳腺癌的诊断/预后的方法，其 中，在步骤C中，所述检测探针包含荧光团和伴灭剂。
5. 权利要求l-4中任一项的方法，其中所述靶序列被包含于选自 PAI-1、 UPA-1的基因内。
6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤B和C同时进行。
7. 权利要求1-6中任一项的方法，所述方法的特征在于，在步骤 B过程中，还使用至少一对扩增引物来获得持家基因的特异性扩增子。
8. 扩增引物，其含有选自SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 8的核 苷酸序列的至少IO个核苷酸单元。
9. 权利要求8的扩增引物，其含有允许起始通过T7噬菌体聚合 酶进行的转录的启动子。
10. 扩增引物对，其选自以下引物对□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 1的至少10个核苷酸单元的第一 扩增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 2的至少IO个核苷酸单元的 第二扩增引物；□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 3的至少10个核苷酸单元的第一 扩增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 4的至少IO个核苷酸单元的 第二扩增引物；□ 含有核苷酸序列SEQ ID No. 5的至少10个核苷酸单元的第一 扩增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 6的至少IO个核苷酸单元的 第二扩增引物；含有核苷酸序列SEQ ID No. 7的至少10个核苷酸单元的第一 扩增引物和含有核苷酸序列SEQ ID No. 8的至少IO个核苷酸单元的 第二扩增引物。
11. 权利要求io的引物对，其中所述第一引物含有允许起始通过T7噬菌体聚合酶进行的转录的启动子。
12. 权利要求8或9的至少一种扩增引物和/或权利要求10或11 的引物对在NASBA扩增反应中的用途。
13. 检测引物，其含有选自SEQ ID No. 9至SEQ ID No. 10的 核苷酸序列的至少IO个核普酸单元。
14. 权利要求13的检测探针，其含有荧光团和猝灭剂。
15. 权利要求8或9的至少一种引物和/或权利要求10或11的至 少一对引物和/或权利要求13或14的至少一种检测探针用于乳腺癌的 诊断/预后的用途。
16. 用于乳腺癌的诊断/预后的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求 8或9的至少一种引物和/或权利要求10或11的至少一对引物和/或 权利要求13或14的至少一种检测探针。
全文摘要
本发明涉及用于乳腺癌的诊断/预后的方法，所述方法包括以下步骤A-从生物样品中提取核物质；B-使用至少一对扩增引物来获得所述核物质的至少一种靶序列的扩增子；C-使用至少一种检测探针来检测所述扩增子的存在，所述方法的特征在于，在步骤B中，所述引物对包括至少一种含有选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.8的核苷酸序列的至少10个核苷酸单元的扩增引物，和/或在步骤C中，所述检测探针含有选自SEQ ID No.9至SEQ ID No.10的核苷酸序列的至少10个核苷酸单元。本发明还涉及可在所述方法中使用的扩增引物和杂交探针，以及涉及用于乳腺癌的诊断/预后的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101223287SQ200680025764
公开日2008年7月16日 申请日期2006年6月7日 优先权日2005年6月9日
发明者T·韦尔雅 申请人:拜奥默里克斯公司