抗her2中和活性单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学领域及抗体制备技术，具体地说，涉及抗HER2中和活性单克隆 抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 人表皮生长因子受体2 (HER2)是表皮生长因子受体（ErbB2)家族中的一员，是相 对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。HER2是重要的乳腺癌预后 判断因子，HER2阳性（过表达或扩增）的乳腺癌，其临床特点和生物学行为有特殊表现，治 疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。作用于HER-2靶点的药物，是目前治疗乳腺 癌最常用最有效的药物，主要有曲妥珠单抗、帕妥珠单抗等。
[0003] 基因泰克公司早在1997年就上市了第一个针对乳腺癌标志物HER2的抗体药物赫 赛汀，每年销售额可达50多亿美元，目前成为仿制药的热点。2012年基因泰克又推出一种 针对HER-Domain2位点的抗体药，与赫赛汀联合使用治疗效果更佳。2013年3月，基因泰克 又上市了赫赛汀和药物DMl偶联物，对癌症晚期病人也有非常好的疗效。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供抗HER2中和活性单克隆抗体及其应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的提供两个抗HER2中和活性单克隆抗体，分别命名 为 clone6B2 和 clone4G8。
[0006] 抗HER2中和活性单克隆抗体clone6B2, i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸 序列；以及
[0007] ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添 加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0008] 抗HER2中和活性单克隆抗体clone4G8, i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸 序列；以及
[0009] ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，或该序列经替换、缺失或添 加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0010] 本发明还分别提供产生单克隆抗体clone6B2、clone4G8的杂交瘤细胞。
[0011] 本发明还提供抗HER2中和活性单克隆抗体clone6B2和clone4G8的制备方 法，以HER2为靶蛋白，设计合成含有HER2胞外区Domain2第266-296位氨基酸的多肽， 与载体蛋白KLH偶联作为免疫原，免疫小鼠制备获得。其中，所述多肽的氨基酸序列为： PALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFG。
[0012] 本发明还提供所述单克隆抗体clone6B2和clone4G8在制备以HER2为靶标的疾 病治疗药物中的应用。
[0013] 本发明进一步提供含有所述单克隆抗体clone6B2和/或clone4G8的药物、检测 试剂、试剂盒。
[0014] 具体地，本发明提供针对与Herceptin识别表位不同的人表皮生长因子受体 2 (HER2)单克隆抗体以及产生所述单抗的杂交瘤细胞系。
[0015] 使用可以诱发机体产生免疫反应并生成具有中和效应抗体的多肽序列，偶联至 KLH载体蛋白作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定 分泌抗HER2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌得到单克隆抗体。
[0016] 优选地，上述多肽序列选自HER2 :
[0017] 含有 PALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFG
[0018] 由多肽序列与载体蛋白偶联作为免疫原制备获得的单克隆抗体能够特异性地识 别HER2蛋白的多肽序列，共筛选出82个阳性克隆，复筛获得15个阳性克隆，进一步中和活 性试验筛选出2个阳性克隆，将这两个单克隆抗体分别命名为clone6B2和clone4G8。
[0019] 所述clone6!?2和clone4G8具有良好的亲和力，实验表明，clone 6!?2和clone4G8 与HER2阳性细胞SK-BR-3细胞的亲和力EC50为1-4ηΜ。能够结合到SK-BR-3细胞表面 HER2,有效地抑制乳腺癌细胞的增殖生长，可以成为非常理想的生物靶向治疗抗体。
[0020] 另外，本发明的单克隆抗体识别的是HER2胞外区Domain2中的一个线性表位，t匕 用HER2胞外区Domain2免疫小鼠获得的帕妥珠单抗的位点更清晰，与Hercetpin治疗性单 抗药的识别HER2表位完全不同，可以与赫赛汀联合用药，增强治疗效果，在乳腺癌的治疗 中有着广阔的前景。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明实施例1中通过间接ELISA法筛选识别HER2的阳性克隆，其中筛选 了 700个克隆，阳性克隆395个，挑选较好的82个阳性克隆进行下一步复筛。
[0022] 图2为本发明实施例2中单抗的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白分子量标准，6B2 和4G8分别为本发明获得的两个单克隆抗体clone6B2和clone4G8。
[0023] 图3为本发明实施例2中两个克隆的亚型鉴定图；其中，clone6B2显示IgG2b信 号最强，cl 〇ne4G8显示IgG2b同样信号最强，依据亚型鉴定试剂盒说明中结果判定标准， clone6B2 及 clone4G8 的亚型为 IgG2b。
[0024] 图4为本发明实施例3中两个克隆结合SK-BR-3细胞流式细胞仪检测图；其中， clone6B2和clone4G8明显能够结合到SK-BR-3细胞表面。
[0025] 图5为本发明实施例4中两个克隆结合SK-BR-3细胞且抑制其增殖的增殖曲线 图；其中，clone6B2的抑制效果达到40%，显示良好的中和活性。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0027] 实施例1产生clone6B2、clone4G8的杂交瘤细胞系的建立
[0028] 一、实验材料
[0029] 1、免疫原：以HER2作为靶蛋白，从中选取一段多肽序列，序列如下： PALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFG
[0030] 采用化学合成的方式制备上述多肽，纯度要求大于90%。将多肽与KLH偶联制备 成免疫原。
[0031] 2、培养基：DMEM培养基购自Hyclone公司，HAT、HT选择培养基、降植烷购自sigma 公司。
[0032] 3、实验动物：Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。
[0033] 4、其他材料：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购自Sigma公司，PEG4000购自Fluka 公司，HRP-山羊抗小鼠 IgG抗体购自JacksonImmune公司，其余试剂均为国产分析纯产品。 [0034] 二、杂交瘤细胞系的建立
[0035] 1、动物免疫
[0036] 1)基础免疫：将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每 只Balb/c小鼠每次注射量为100 μ g。
[0037] 2)加强免疫：加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前 3天，经腹腔注射含150ug抗原的生理盐水溶液。
[0038] 2、杂交瘤细胞的制备
[0039] 按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000 进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10-15天，取上清采用间接ELISA法筛选分 泌抗HER2抗原的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接 ELISA法的操作步骤如下：用200μ 1的HER2包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照， 无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠 IgGlOO μ 1，最后测定450nm OD值。0D450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳 性克隆。共获得了 395个阳性克隆，从中挑选出82个较好的阳性克隆。（图1)
[0040] 3、杂交瘤细胞系的建立
[0041] 经过4次亚克隆和间接ELISA或细胞ELISA筛选，得到15株分别针对HER2,识别 SK-BR-3细胞的稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。（表1)
[0042] 4、应用上述杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测
[0043] 1)小鼠腹水效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价为：1 : 500000-1 :1000000。
[0044] 2)纯化抗体效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的纯化抗体效价 为：0· 05-lOng/ml。
[0045] 5、杂交瘤细胞系的传代培养
[0046] 将上述杂交瘤细胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代， 培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达 到1:10000以上。
[0047] 以上结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗HER2的 单克隆抗体。
[0048] 获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否 则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体 的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。因此必须冷藏保存一部 分。保存方法如下：
[0049] 1.材料
[0050] ⑴细胞：取对数生长期的细胞。
[0051] (2) 10%二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不 能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌）：含10%二甲基亚砜、20%灭活胎牛血清，70% RPMI-1640 液。
[0052] (3) 20 % FCS-1640 培养液